Isolement et culture de somates ganglionnaires vestibulaires et spiralés de rongeurs nouveau-nés pour les enregistrements Patch-Clamp

Résumé

Les méthodes présentées ici fournissent des instructions détaillées pour la dissection, la dissociation, la culture et l’enregistrement patch-clamp à partir de neurones ganglionnaires vestibulaires et ganglionnaires spiralés de l’oreille interne.

Résumé

La morphologie compacte des neurones ganglionnaires de l’oreille interne isolés et cultivés permet de caractériser en détail les canaux ioniques et les récepteurs des neurotransmetteurs qui contribuent à la diversité cellulaire au sein de cette population. Ce protocole décrit les étapes nécessaires à la dissection, à la dissociation et à la culture à court terme réussies des somata des neurones bipolaires de l’oreille interne à des fins d’enregistrements patch-clamp. Des instructions détaillées pour la préparation des neurones ganglionnaires vestibulaires sont fournies avec les modifications nécessaires nécessaires au placage des neurones ganglionnaires spiralés. Le protocole comprend des instructions pour effectuer des enregistrements de patch-clamp de cellules entières dans la configuration de patch perforé. Des exemples de résultats caractérisant les enregistrements par pince de tension de courants cycliques activés par hyperpolarisation et dépendants des nucléotides (HCN) mettent en évidence la stabilité de la configuration d’enregistrement de patch perforé par rapport à la configuration plus standard de patch rompu. La combinaison de ces méthodes, somata isolée et enregistrements perforés-patch-clamp, peut être utilisée pour étudier les processus cellulaires qui nécessitent des enregistrements longs et stables et la préservation du milieu intracellulaire, tels que la signalisation par des récepteurs couplés aux protéines G.

Introduction

Les neurones bipolaires du nerf vestibulocochléaire relient les cellules ciliées sensorielles de l’oreille interne au tronc cérébral. Ils sont les principaux vecteurs d’informations sur le son et les mouvements de la tête ; Les dommages causés à ces cellules importantes entraînent une surdité et des troubles de l’équilibre. Les parties vestibulaire et auditive du nerf sont chacune composées de types cellulaires distincts qui sont morphologiquement et fonctionnellement diversifiés ^1,2. Dans le système vestibulaire, deux sous-populations afférentes se déclenchent spontanément à des intervalles réguliers ou irréguliers². On pense que la synchronisation des pics afférents reflète une diversité sous-jacente dans la composition des canaux ioniques ^3,4. Dans le système auditif, il existe deux sous-populations principales de neurones ganglionnaires spiralés (SGN) ; alors que les SGN de type I entrent en contact avec des cellules ciliées internes individuelles⁵, les SGN de type II entrent en contact avec plusieurs cellules ciliées externes⁵. Des enregistrements in vitro de cultures semi-intactes et organotypiques suggèrent des différences dans les propriétés membranaires des SGN de type I et de type II ^6,7.

De nombreux canaux ioniques et récepteurs de neurotransmetteurs situés aux extrémités de ces neurones se trouvent également dans leurs corps cellulaires. Ainsi, les cultures du somata vestibulaire isolé et du somata ganglionnaire spiral peuvent être étudiées in vitro pour comprendre comment les canaux ioniques et les récepteurs des neurotransmetteurs contribuent à la réponse de ces neurones. La morphologie compacte des corps cellulaires isolés permet des enregistrements électriques de haute qualité, adaptés à la caractérisation détaillée des canaux ioniques voltage-dépendants et des récepteurs des neurotransmetteurs. L’accès facile à une variété représentative de sous-types de neurones permet une analyse à haut débit de la diversité cellulaire.

Cet article présente une méthode d’isolement et de culture des corps cellulaires ganglionnaires dissociés de la partie supérieure du ganglion vestibulaire chez le rat au jour postnatal (P)9 à P20. Des suggestions sont également fournies pour étendre ces méthodes au ganglion spiralé, en plus des étapes nécessaires pour extraire, dissocier et plaquer avec succès les cellules ganglionnaires. Ces méthodes sont une évolution de celles mises au point dans les publications de divers laboratoires ^8,9,10. Ce document contient également des conseils pour la sélection de cellules saines pour les enregistrements patch-clamp.

Enfin, le protocole décrit la procédure d’enregistrement des patch-clamps à l’aide de la configuration des patchs perforés¹¹. Bien que la configuration du patch perforé soit plus longue et plus difficile techniquement que la configuration plus courante du patch rompu, elle est préférable pour maintenir le milieu cytoplasmique qui permet des sessions d’enregistrement longues et stables. Les avantages de cette configuration d’enregistrement sont illustrés ici par l’amélioration de la stabilité des courants cationiques activés par l’hyperpolarisation dans les enregistrements en patch perforé par rapport aux enregistrements en patch rompu.

Ce protocole est organisé en cinq sections. Les sections 1 à 3 décrivent les solutions et les outils qui peuvent être préparés et stockés à l’avance. La section 4 décrit les étapes de dissection et de placage du vestibulaire et des SGN. La section 5 décrit les étapes de l’enregistrement des neurones après une période de culture. Entre nos mains, la section 4 et la section 5 sont effectuées sur une période de 2 jours consécutifs.

Protocole

Toute utilisation animale décrite ici a été approuvée par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie du Sud. Les animaux de ce protocole sont des rats Long Evans des deux sexes âgés de P3 à P25 obtenus auprès des laboratoires Charles River, mais ces méthodes peuvent être appliquées à d’autres souches de rongeurs. Une blouse de laboratoire et des gants doivent être portés pendant toutes les procédures, ainsi que des lunettes de protection contre les éclaboussures lors de la préparation des solutions.

1. Préparatifs

REMARQUE : Les solutions et les outils décrits dans cette section peuvent être conçus bien à l’avance pour être utilisés le jour de la dissection et de l’enregistrement.

1. Préparer le milieu Liebovitz complété par 10 mM de HEPES (solution L-15). Les étapes suivantes décrivent la préparation de 1 L de solution de L-15.
   1. Verser 990 mL de H₂O déminéralisé dans un bécher. Mesurez et ajoutez 2,386 g (10 mM) de HEPES. Ajouter un flacon de 1 L de poudre de solution L-15.
      REMARQUE : Le L-15 en poudre a une durée de conservation plus longue et prend moins d’espace de stockage. Vous pouvez également acheter une solution de L-15 et un supplément de HEPES. Cette dernière option a également la possibilité d’utiliser une solution sans phénol, ce qui est utile pour l’imagerie par fluorescence.
   2. Remuez la solution sur une plaque à mélanger. À l’aide d’un pH-mètre, ajoutez lentement 1 N d’hydroxyde de sodium (NaOH) pour obtenir un pH compris entre 7,34 et 7,36.
   3. Ajouter H₂O déminéralisé jusqu’à ce que la solution atteigne un volume de 1 000 ml. Filtrez la solution à l’aide d’une membrane de taille de pores de 0,22 μm.
      REMARQUE : La solution L-15 peut être conservée à 4 °C pendant environ 1 à 2 semaines. Si vous utilisez du L-15 à base de rouge phénol, la solution deviendra rose si elle est trop basique (pH > 7,4) ou orange si elle est trop acide (pH < 7,34).
2. Préparer le milieu de culture pour les neurones ganglionnaires vestibulaires (VGN) (avec modification pour les SGN). Suivez les étapes ci-dessous pour préparer 50 ml de milieu de culture :
   1. Ajouter 47,5 mL de milieu essentiel minimum GluMAX-I dans un bécher en verre propre.
   2. Mesurez et ajoutez 0,1194 g (10 mM) de HEPES. Ce tampon supplémentaire résiste aux changements de pH pendant que les cellules se déposent, avant d’être déplacées vers l’incubateur.
   3. Ajouter 2,5 mL de sérum de veau fœtal (FBS). Cela fait 5 % en volume de FBS dans un volume total de 50 mL de milieu. Pour les préparations SGN, 2,5 mL de FBS sont remplacés par 0,5 mL de N2 et 1 mL de solutions B27.
   4. Remuez la solution sur une plaque à mélanger. À l’aide d’un pH-mètre, ajoutez lentement 1 N NaOH pour obtenir un pH compris entre 7,38 et 7,4.
   5. Ajouter 0,5 mL de pénicilline-streptomycine. Filtrez la solution à travers un filtre stérile de 0,22 μm. Conserver la solution à 4 °C.
   6. Au moins 30 min avant l’utilisation, transvasez le milieu de culture dans un flacon de culture tissulaire muni d’un bouchon ventilé. Placer le flacon contenant le milieu de culture dans un incubateur à 5 % de concentration de CO₂ à 37 °C.
3. Préparer la solution interne de patch perforé
   REMARQUE : Ici, 100 mL de solution interne de timbre perforé sont utilisés pour l’enregistrement de cellules entières (la recette est résumée dans le tableau 1). Ces solutions peuvent être préparées longtemps à l’avance et conservées à -20 °C. Les aliquotes peuvent être conservées indéfiniment à -20 °C si elles ne subissent pas un cycle répété de congélation et de décongélation.
   1. Jusqu’à 6 mois à l’avance, préparez et stockez les solutions mères suivantes : 1 M KCl, 0,5 M Mg₂Cl (hexahydraté) et 0,5 M CaCl₂. Conserver dans des bouteilles hermétiques jusqu’à 6 mois à 4 °C.
      REMARQUE : Il est bon de vérifier l’osmolalité des solutions mères (2 000 mOsm pour la solution mère de 1 M de KCl ; 1 500 mOsm pour les solutions de Mg₂Cl et de CaCl₂ ) pour s’assurer que la concentration cible est atteinte. Ne pas utiliser si la solution devient trouble ou si elle forme des précipitations. Il peut s’agir d’un point de pause possible.
4. Le jour de la création de la solution interne, suivez les étapes ci-dessous en utilisant les solutions mères de l’étape 1.3.
   1. Mesurer 100 mL de milli-Q (MQ)H₂O. Prélever 40 mL des 100 mL et réserver dans un bécher propre.
   2. Ajouter les 60 mL restants de H₂O dans un bécher propre et stérile de 100 mL. Ajouter 2,5 mL de 1 M KCl, 1 mL de_0,5M Mg 2 Cl-hexahydraté et 0,02 mL de 0,5 M CaCl₂.
   3. Ajoutez une barre d’agitation et placez le bécher sur une assiette à mélanger. Remuer jusqu’à dissolution complète. Ajouter 1,307 g de K₂SO₄. Remuer jusqu’à ce que le K₂SO₄ se dissolve.
   4. Peser 0,1192 g de HEPES (viser 5 mM dans un volume final de 100 mL) et ajouter à la solution. Remuer jusqu’à dissolution.
      REMARQUE : Assurez-vous que tous les composants sont complètement dissous, car il faut parfois du temps pour que le K₂SO₄ se dissolve.
   5. Peser 0,1902 g d’acide éthylène glycol-bis(β-aminoéthyléther éthylique)-N,N,N′,N′-tétraacétique (EGTA) (viser 5 mM dans un volume final de 100 mL) et ajouter à la solution. Comme l’EGTA ne se dissout pas complètement dans une solution acide, placez le bécher sur une plaque d’agitation et insérez la sonde de pH.
   6. Tout en remuant, titrer lentement 1 M KOH jusqu’à ce que l’EGTA se dissolve complètement. Attendez-vous à ce que cela se produise lorsque le pH se situe entre 6 et 7. Continuez à ajouter lentement le KOH jusqu’à ce que le pH final atteigne 7,35 (environ 1,2 à 1,3 mL de KOH au total).
   7. Ajouter MQH₂O pour amener la solution à un volume final de 100 mL et remuer. Vérifier l’osmolalité de la solution (cible 270 mOsm/kg pour la solution perforée) à l’aide d’un osmomètre.
   8. Filtrez la solution interne perforée à l’aide d’un filtre stérile de 0,22 μm. Conserver dans 5 mL d’aliquotes à -20 °C. Utilisez une nouvelle aliquote pour chaque nouvelle session d’enregistrement.
      REMARQUE : Il peut s’agir d’un point de pause possible.

2. Fabrication de pipettes de trituration

REMARQUE : Les pipettes de trituration peuvent être réutilisées pour plusieurs expériences. Rincez les pipettes avec de l’éthanol, de l’eau et une solution de L-15 avant chaque utilisation et nettoyez-les avec de l’eau et de l’éthanol après chaque utilisation. Conserver soigneusement entre les utilisations.

1. Pour préparer des pipettes de trituration pour la dissociation cellulaire, tenez une pipette Pasteur en verre à la flamme d’un bec Bunsen. Une fois que la pointe du verre commence à fondre, étirez le verre jusqu’au diamètre de pointe souhaité. Retirez une extrémité de la pipette de la flamme pour créer une petite courbure.
2. Approchez la pipette pliée d’un microscope. À l’aide d’une tuile d’inciseur, entaillez et cassez le verre au diamètre désiré.
3. Passez l’embout de la pipette sur le dessus de la flamme du bec Bunsen. Cela polira rapidement les bords rugueux près de la pointe. Assurez-vous que l’embout n’est pas scellé par la flamme.
4. Répétez le processus jusqu’à ce que quatre ou cinq pipettes de différentes tailles aient été préparées.

3. Fabrication de pipettes patch

REMARQUE : Préparez un ensemble de pipettes patch avant la session d’enregistrement, mais après la dissection ganglionnaire et la culture. Bien que les électrodes fabriquées une à la fois pendant la session d’enregistrement soient optimales en termes de performances, un succès raisonnable a été obtenu lorsqu’elles sont fabriquées en lot la veille. Rangez les pipettes dans un récipient en verre couvert pour protéger les pointes de la poussière.

1. Utilisez un extracteur d’électrode vertical et des pipettes en verre borosilicaté filamenté de 1,5 mm de diamètre extérieur et de 1,17 mm de diamètre intérieur. Assurez-vous que le verre est toujours exempt de poussière et de traces de doigts.
2. Tirez 8 à 10 pipettes enregistreuses à l’aide d’un programme en deux étapes, comme recommandé par le fabricant pour les pipettes à patch.
3. Inspectez et polissez à chaud chaque pointe de pipette d’enregistrement à l’aide d’une microforge ; Le polissage à chaud favorise une meilleure étanchéité. La résistance de la pipette cible est comprise entre 4 et 8 MΩ.
4. Conservez les pipettes polies dans un récipient couvert. Cela peut être considéré comme un point de pause dans l’expérience.
   REMARQUE : L’optimisation du diamètre de la pipette pour atteindre la plage de résistance cible nécessite quelques essais et erreurs avec les étapes 3.2 et 3.3. La plupart des systèmes de patch-clamp commerciaux sont dotés d’une fonction de test de membrane intégrée pour mesurer la résistance de l’électrode dans la solution de bain. La résistance est calculée comme un rapport du courant de sortie en régime permanent en réponse à un stimulus de pas de 5 mV appliqué. Les réglages de traction de l’étape 3.1 et le polissage de l’étape 3.2 doivent d’abord être ajustés à l’aide de pipettes d’essai, jusqu’à ce que la résistance des pipettes d’essai se situe dans la plage de 4 à 8 MΩ.
5. Le jour de l’enregistrement, enduisez les pointes de pipette pour réduire la capacité de la pipette et le bruit d’enregistrement. Pour ce faire, enroulez une petite bande de film de paraffine sur la tige de la pipette. Il n’est pas nécessaire d’enrouler jusqu’à la pointe.
   REMARQUE : Une autre stratégie consiste à enduire et à thermofixer un élastomère de silicone sur la tige de la pipette¹².

4. Extraction du ganglion vestibulaire et placage des neurones vestibulaires

1. Préparation à la dissection
   1. Préparez un mélange enzymatique de solution L-15 avec 0,05 % de collagénase et 0,25 % de trypsine. Par exemple, ajoutez 0,001 g de collagénase et 0,005 g de trypsine à 2 mL de solution de L-15 dans un bécher, ajoutez un petit agitateur magnétique et remuez jusqu’à ce que le tout soit complètement mélangé. Réserver à température ambiante.
   2. Préparez une guillotine obtenue dans le commerce en plaçant des essuie-tout sur le côté et sous la guillotine afin de minimiser l’exposition de la paillasse et d’autres surfaces au sang et à d’autres matières biologiques.
   3. Disposez de grands ciseaux en acier inoxydable, de grandes pinces et de grands ciseaux à ressort. Gardez un grand vaporisateur contenant 70 % d’éthanol à portée de main pour le nettoyage de la tête.
   4. Remplir un bécher de 100 ml avec une solution de L-15 et le placer sur de la glace. Oxygéner la solution de L-15.
   5. Disposez les ciseaux à ressort, les ciseaux chirurgicaux, les pinces, le scalpel et la pipette de transfert (voir le tableau des matériaux).
   6. Préparez une boîte de Pétri de 60 mm (pour la dissection macroscopique) et deux boîtes de Pétri de 35 mm (pour le nettoyage/curage fin des ganglions). Remplir la boîte de 60 mm de solution oxygénée de L-15 à l’aide d’une seringue de 30 ml munie d’un embout filtrant de 0,22 μm.
2. Euthanasie, nettoyage de la tête et hémisection
   1. Peser les chiots pour calculer la dose appropriée de dilution fatale plus à administrer par voie intrapéritonéale (~ 0,01 mL par 10 g).
   2. Une fois qu’un plan d’anesthésie profond est atteint, tel qu’évalué par un manque de réponse au pincement de l’orteil, décapiter à l’aide de la guillotine.
   3. Rincez abondamment la tête avec de l’éthanol à 70%, puis abondamment avec une solution L-15.
   4. Retirez complètement la peau du crâne. Coupez la tête en deux à l’aide de grands ciseaux à ressort en commençant par le point d’entrée de la moelle épinière au cerveau et en faisant deux coupes, la première à travers le haut du crâne et la seconde à travers le bas de la mâchoire. Terminez de couper la tête en deux à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
   5. Placez les deux moitiés de la tête, côté cerveau vers le bas, dans une boîte de Pétri de 60 mm remplie de solution L-15. Placez le tissu frais qui n’est pas en cours de dissection sur de la glace.
3. Extraction du ganglion vestibulaire supérieur
   1. Retirez le cerveau à l’aide de ciseaux chirurgicaux fermés. Sectionnez et enlevez le nerf crânien pour détacher complètement le cerveau du crâne.
      REMARQUE : À ce stade, la capsule otique (en forme de chiffre 8) doit être visible à l’arrière de la tête.
   2. À l’aide d’une pince et en commençant par l’arrière de la tête, retirez le matériau membraneux transparent.
   3. Découpez le haut du crâne à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Retirez l’excès de tissu à l’arrière de la tête et du cou pour rendre la zone de dissection et la capsule otique plus propres et plus faciles d’accès.
      REMARQUE : Évitez de rendre le plat trop trouble en jetant l’excès de tissu tout au long de la procédure.
   4. Transférez le tissu dans une deuxième boîte de Pétri avec une solution fraîche de L-15. Localisez la capsule otique et les nerfs auditif, vestibulaire supérieur et vestibulaire inférieur. Coupez le nerf auditif et séparez les ganglions supérieurs et inférieurs à l’aide de petits ciseaux à ressort.
      REMARQUE : Bien que les somates du nerf vestibulaire se trouvent à la fois dans les ganglions inférieurs (plus minces) et supérieurs (plus épais), les cellules extraites du ganglion supérieur ont une meilleure survie.
   5. À l’aide d’un scalpel, rasez doucement la crête osseuse pour affaiblir la zone osseuse, sous laquelle le nerf plonge dans la capsule osseuse. Enlevez soigneusement les débris avec une pince fine, en exposant toute la partie enflée du ganglion.
   6. Utilisez les ciseaux à ressort fins pour couper et séparer le ganglion de la branche nerveuse périphérique qui plonge vers l’utricule.
   7. Retirez le ganglion supérieur à l’aide d’une pince fine, en veillant à ne pas pincer trop près du tissu ganglionnaire. Transférer dans une boîte de Pétri de 35 mm avec une solution fraîche de L-15.
   8. Avant de procéder, préchauffez la solution enzymatique : versez le mélange enzymatique dans une boîte de Pétri de 35 mm et placez-la dans un incubateur à 37 °C pendant 10 à 15 min.
   9. Nettoyez le ganglion à l’aide d’une pince fine et de petits ciseaux à ressort en enlevant l’os (qui semble blanc et cristallisé), l’excès de tissu, les fibres nerveuses et toute autre structure superflue. Prenez soin de minimiser l’ablation de tout tissu ganglionnaire.
4. Dissociation tissulaire et placage
   1. Transférez les ganglions nettoyés dans la solution enzymatique préchauffée et remettez-la dans l’incubateur pendant 10 à 40 minutes. Le traitement enzymatique est terminé une fois que le tissu commence à se détacher, mais reste en un seul morceau. Un traitement excessif du tissu avec des enzymes entraînera une dissolution complète des ganglions avant la trituration.
      REMARQUE : La durée du traitement enzymatique du tissu dépend de l’âge de l’animal. Par exemple, les ganglions des rats P9 sont traités avec une enzyme pendant 25 min, et les ganglions des rats P15 sont traités avec une enzyme pendant 35 min.
   2. Transférer les ganglions dans la boîte de Pétri de 35 mm avec la solution fraîche de L-15 et incuber pendant 2-3 min.
   3. Transférez les ganglions dans une autre boîte de Pétri de 35 mm remplie de milieux de culture filtrés.
   4. À l’aide d’une micropipette de 200 μL, pipeter une goutte de ~150 μL de milieu de culture filtré sur une boîte à fond en verre enduit. N’ajoutez pas trop de solution, car il est important de maintenir la tension superficielle pour former une bulle de solution qui reste sur la lamelle de verre.
   5. Transférez le nombre de ganglions souhaité (un à quatre) sur la lamelle.
   6. Prélevez une petite quantité de milieu de culture dans la boîte de culture pour rincer la pipette de trituration avec un milieu afin d’éviter que le tissu ne colle aux parois de la pipette en verre. Triturer en passant doucement et à plusieurs reprises le tissu à travers la pipette jusqu’à ce que les ganglions soient suffisamment dissociés.
      REMARQUE : Ne pas trop travailler le tissu pour tenter des suspensions unicellulaires ou laisser les cellules s’écraser au fond de la boîte en utilisant une pression positive excessive. Évitez également de former des bulles d’air, car cela réduira la survie des cellules. Une trituration douce est la clé d’une survie cellulaire réussie.
   7. Laisser reposer les cellules pendant 5 min. Vérifiez au microscope optique si les cellules se sont déposées sur la lamelle.
   8. Placez délicatement une boîte de culture dans un incubateur à 37 °C pendant 12 à 24 h. Encore une fois, assurez-vous de garder la bulle de solution intacte.
      REMARQUE : Lors d’une culture de plus de 24 h, rafraîchir le milieu de culture quotidiennement. Il peut s’agir d’un point de pause possible.
5. Placage des SGN
   1. Suivez les étapes 4.2.1 à 4.2.5 des instructions sur les ganglions vestibulaires pour couper la tête en deux.
   2. Localisez la capsule otique (en forme de chiffre 8) et extrayez-la du crâne en ébréchant les bords à l’aide d’une pince émoussée.
   3. Changez la solution L-15. La partie spirale de la capsule otique abrite la cochlée avec l’organe de Corti. Ébrécher l’os qui recouvre les tours cochléaires sans endommager le tissu sous-jacent, avec une pince fine parallèle à la courbe de l’os.
   4. Une fois qu’une quantité suffisante d’os a été retirée pour révéler toute l’étendue des tours cochléaires, utilisez de petits ciseaux à ressort pour sectionner le modiolus (tissu fibreux épais, blanc contenant des axones centraux de SGN) à la base de la cochlée pour le libérer du reste de la capsule otique.
   5. Retirez la strie vasculaire en pinçant la strie à la base avec une pince fine. Déroulez autour de la spirale et jusqu’à l’apex pour la libérer de l’organe de Corti.
   6. Coupez l’organe de Corti en deux ou trois tours à l’aide de petits ciseaux à ressort de manière à ce qu’il repose à plat.
   7. Retirez le modiolus de chaque tour avec de petits ciseaux à ressort.
   8. Retirez le ganglion spiralé en coupant au bord de l’endroit où les faisceaux de fibres SGN se projettent vers les cellules ciliées.
   9. Nettoyez le ganglion à l’aide d’une pince fine en enlevant l’os (qui semble blanc et cristallisé), le modiolus (qui semble blanc et fibreux) et toute autre structure superflue. Prenez soin de minimiser l’ablation de tout tissu ganglionnaire.
   10. Suivre la même procédure que pour le traitement enzymatique du ganglion spiral comme pour le ganglion vestibulaire dans la section 4.4. Les temps enzymatiques sont généralement plus courts dans le ganglion spiral, qui est plus allongé que le ganglion vestibulaire. Utilisez des pipettes de trituration de plus petit diamètre pour le ganglion spiral par rapport au ganglion vestibulaire.
   11. Triturer le ganglion spiral dans un milieu de culture complété par N2 et B27, indiqué dans la recette des milieux de culture.
   12. Placer la boîte de culture contenant les ganglions dissociés dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 12 à 24 h.
       REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.

5. Enregistrement

REMARQUE : Dans cette procédure, les enregistrements de patch-clamp du ganglion isolé sont généralement effectués 12 à 24 h après le placage. D’autres laboratoires ont rapporté des résultats de neurones après des périodes beaucoup plus longues en culture¹⁰.

1. Préparer la chambre d’enregistrement
   1. Utilisez la chambre d’enregistrement à échange rapide (ou équivalent) qui permet d’effectuer des enregistrements à pince directement dans la boîte de culture. Installez la chambre sur le microscope inversé.
   2. Insérez les boîtes de culture à fond de verre dans la chambre.
   3. Introduisez la solution L-15 dans la chambre d’enregistrement à travers un système de tubes de perfusion. Stabiliser l’entrée et la sortie de la perfusion dans la chambre à un débit de 0,5 à 1 ml par minute.
2. Préparer la solution interne pour le chargement des électrodes
   1. Décongeler une aliquote de la solution interne perforée. Verser 2,5 mL de la solution dans une boîte de culture de 35 mm. Replacez le couvercle de la boîte de culture et étiquetez-la comme « Tip Dip ». Réserver dans une zone exempte de poussière, car il est très important de garder cette solution aussi propre que possible.
   2. Peser 1 mg d’amphotéricine B et ajouter 20 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Tourbillonnez et faites tourner la solution jusqu’à ce que toute l’amphotéricine-B soit dans la solution. Ajouter 10 μL de solution de DMSO/amphotéricine-B aux 2 mL restants de la solution interne décongelée perforée. Prélever et dissiper la solution à l’aide d’une pipette deux ou trois fois pour s’assurer que le DMSO/amphotéricine-B s’est uniformément mélangé à la solution interne. La solution aura une légère teinte jaunâtre.
   3. Prélever la solution interne perforée d’amphotéricine-B dans une seringue de 3 ml. Ajoutez un embout de 34 G à la seringue. Enveloppez la seringue dans du papier d’aluminium et conservez-la sur de la glace.
      REMARQUE : Cette solution doit être refaite toutes les 2 h pour assurer l’efficacité de l’amphotéricine-B dans la perforation de la membrane cellulaire. L’amphotéricine-B est sensible à la lumière et doit être protégée de la lumière à l’aide d’une feuille d’aluminium ou d’autres méthodes.
3. Enregistrements patch-clamp
   1. Visualisez les neurones à l’aide d’un objectif 10x ou 20x. Ajustez l’éclairage et optimisez l’optique pour voir les limites et les ombres autour de la cellule.
   2. Vérifiez la qualité des neurones isolés. N’essayez que des neurones avec des surfaces lisses et régulières qui ne sont pas trop fortement contrastées et qui n’ont que de petits cratères dispersés. Assurez-vous également d’éviter les paires de neurones, les neurones entourés de débris ou d’autres cellules.
   3. Sous un grossissement de 100x, identifiez un neurone ou un champ de neurones à patcher et alignez-les au centre du champ de vision.
   4. Remplissez l’embout de la pipette avec une solution propre qui ne contient pas d’amphotéricine en trempant l’embout (pendant ~20 s) dans la solution propre qui a été placée dans une boîte de culture. L’action capillaire attirera une petite quantité de solution dans la pointe.
      REMARQUE : Effectuez cette étape sous un microscope à dissection stéréoscopique, ce qui permet de déterminer dans quelle mesure la pointe retient la solution de trempage de la pointe. Si la solution ne tient pas pendant ~10-20 s, la forme de l’électrode n’est pas idéale. Dans ce cas, reconfigurez le programme de tirage d’électrode pour produire une pointe plus longue.
   5. Ensuite, remplissez l’arrière de la pipette avec la solution interne contenant l’amphotéricine. Le filament à l’intérieur de la pipette aspirera la solution vers le bas pour rencontrer la solution propre dans l’embout. Laissez le filament tirer doucement la solution vers le bas et n’essayez pas de tapoter les bulles, car cela forcerait l’amphotéricine à atteindre l’extrémité trop rapidement.
   6. Utilisez une seringue pour aspirer la solution qui peut se trouver tout à l’arrière de l’électrode.
      REMARQUE : Il est très important de travailler rapidement à partir de ce point pour atterrir et former un joint à haute résistance sur la cellule souhaitée.
   7. Insérez la pipette dans le porte-pipette. Vérifiez que la pipette est bien ajustée dans le support pour éviter que la pipette ne dérive. Si la pipette n’est pas stable, remplacez les joints toriques d’étanchéité à l’avant et à l’arrière du porte-pipette pour minimiser la dérive et maintenir une forte aspiration. Remplacez la pipette par une pipette fraîchement remplie.
   8. Abaissez la pipette dans le bain de la chambre d’enregistrement.
   9. Localisez l’embout de la pipette au milieu du champ de vision. Assurez-vous que l’embout est exempt de bulles d’air ou d’autres débris.
   10. Appliquez un pas de tension (5 mV) dans le test de membrane pour surveiller la résistance de la pipette. Continuez à surveiller la résistance d’entrée tout au long du processus de formation d’un joint sur la cellule.
   11. Annulez le potentiel de décalage de la pipette, de sorte que le courant de la pipette soit nul en mode de test de membrane de pClamp.
   12. Corrigez la capacité de la pipette à l’aide de la fonction de compensation de capacité rapide sur l’amplificateur patch-clamp (cadrans rapides Cp dans le panneau souple Multiclamp Commander).
   13. Déplacez la pipette vers le bas jusqu’à la cellule.
   14. Une fois que la pipette est suffisamment proche du neurone, passez à l’objectif à grossissement plus élevé et envoyez l’image à travers une caméra à un moniteur (utilisez un objectif 40x, grossissement total 400x). Ajustez la pipette et recentrez le neurone.
   15. Rapprochez l’électrode d’enregistrement du soma. Localisez le centre du neurone sur le moniteur et positionnez l’électrode d’enregistrement au-dessus du neurone.
   16. Approchez-vous du neurone par le haut, de sorte que l’électrode atterrisse au centre de la cellule sphérique. Ajustez le décalage de la pipette pour mettre à zéro les potentiels CC constants dans le système.
   17. Placez la pipette près de la membrane. Atterrissez fermement au centre de la cellule.
       REMARQUE : Lors de l’atterrissage, une petite fossette à la surface du neurone et un doublement/triplement de la résistance d’entrée se produiront.
   18. Appliquez une pression négative (aspiration) à l’aide d’une seringue ou d’une pipette buccale. Activez le potentiel de rétention de -60 mV. La résistance de l’étanchéité devrait augmenter jusqu’à ce qu’elle dépasse un giga-ohm.
       REMARQUE : Travaillez rapidement pour réduire le temps entre le remplissage d’une électrode et l’atterrissage sur une cellule. Il y a un temps limité avant que l’amphotéricine ajoutée à la solution interne du patch perforé à l’étape 5.3.5 n’atteigne l’extrémité de l’électrode. Une fois que l’embout est contaminé par l’amphotéricine, il est difficile de former des joints à haute résistance, et la résistance plafonne souvent à ~200 mégaohms.
   19. Une fois qu’un joint giga-ohm se forme, relâchez la pression négative. Dès que le joint se forme, appliquez une compensation de capacité rapide pour réduire autant que possible l’amplitude des transitoires de capacité de la pipette en mode de test membranaire.
   20. Au fur et à mesure que l’amphotéricine commence à agir, observez la résistance d’entrée diminuer lentement et le courant circulant en réponse au pas de tension de 5 mV augmente progressivement à mesure que l’amphotéricine pénètre dans la membrane. Une diminution soudaine de la résistance en série au lieu d’une stabilisation progressive suggère qu’une rupture spontanée s’est produite.
   21. Estimez la capacité de la cellule entière et la résistance série à l’aide de la fonction d’annulation transitoire capacitive de l’amplificateur. Documentez et surveillez la résistance en série au début et régulièrement pendant l’expérience.
       REMARQUE : La résistance en série peut prendre de 5 à 20 minutes pour se stabiliser, en fonction de la taille de l’électrode et de la quantité de solution propre aspirée dans la pipette. Les modes pince de tension et pince de courant peuvent être utilisés une fois que la résistance série s’est stabilisée en dessous de 30 mégaohms. Un gonflement ou un rétrécissement des neurones pendant l’enregistrement est parfois observé, mais rarement lorsque l’osmolarité et le pH des solutions sont correctement ajustés.

Résultats

L’exécution de protocoles de pince de tension en appliquant des familles de pas de tension révèle l’activation dépendante de la tension d’une variété de familles de courants différentes. Des exemples représentatifs de courants de cellules entières évoqués à partir d’un VGN et adaptés d’enregistrements publiés¹³ sont présentés à la figure 1A,B. L’application de tensions dépolarisantes (Figure 1B

Discussion

Les méthodes présentées ici sont spécifiques aux enregistrements de neurones isolés ; Des études antérieures se sont concentrées sur des enregistrements à partir de terminaisons axonales dans une préparation semi-intacte. Par rapport aux techniques d’enregistrement terminales existantes, les enregistrements isolés offrent un comportement supérieur en termes de pince d’espace et d’isopotentiel. De plus, ce protocole permet d’accéder à un échantillon plus large de neurones, puisque seules les sous-po...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin	Sigma-Aldrich	A4888-100MG	For perforated patch recordings.
ATP di-sodium	Sigma-Aldrich	A7699	Additive to internal solution
B27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044	additive to culture medium, for SGN
Beakers (1000, 100, 10) milliliter
bench-top centrifuge	USA Scientific	2641-0016
Bunsen burner
CaCl2	J.T. Baker	1311-01	Additive to internal solution
Collagenase	Sigma-Aldrich	C5318	one out of three enzyme to digest tissue
Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40	Warner Instruments	64-0707
DMSO	Biotium	90082
Dnase I,from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	11284932001	one out of three enzyme to digest tissue
Dumont #3 Forceps (Blunt)	Fine Science Tools	11231-30
Dumont #5 Forceps (Fine)	Fine Science Tools	11251-10
Dumont #55 Forceps (Fine)	Fine Science Tools	11255-20
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	Additive to internal solution
Electrode Puller	Narashige	PC-10
Epi-illumination light source	Zeiss	CL 1500 ECO
Ethanol	Decon Labs	2716	for cleaning head and around dissection bench
Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes	Sutter Instruments	BF140-117-10
Fine-edged dissection blade	Fine Science Tools	10010-00
Glass Pasteur Pipettes	VWR	14673-010	to pull trituration pipettes
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16140063	additive to culture medium
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-100G	for pH buffering all solutions in protocol
Hot plate / magnetic stirrers	VWR	76549-914
Insulated bucket filled with ice			to keep all samples and solutions cool
K2SO4, Potassium Sulfate	Sigma Aldrich	P9458-250G	Additive to internal solution
KCl	Sigma-Aldrich	P93333	Additive to internal solution
KOH (1 M)	Honeywell	319376-500ML	To bring internal solution to desired pH.
Large Spring Scissors	Fine Science Tools	14133-13
Leibovitz medium	Sigma Aldrich	L4386	dissection and bath solutions
Low-profile-bath recording chamber for culture dishes	Warner Instruments	64-0236
luer-lok syringes, 30 ml	BD	302832	for drawing L-15/HEPES/HEPES solution.
MEM + Glutamax Supplement	Fisher Scientific	41-090-101	base of the culture medium
MgCl2-Hexahydrate	Sigma-Aldrich	M1028	Additive to internal solution
microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge	World Precision Instruments	MF34G
Microforge	Narashige	MF-90	For electrode polishing.
N2 Supplement (100x)	Thermo Fisher Scientific	17502-048	additiive to culture medium, for SGN
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Additive to internal solution
NaOH (1 M)	Thomas Scientific	319511-500ML	for titration pH
Osmometer	Advanced Instruments Inc.	3320
Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing	USC Material Management	MEDOX200 (Identifier: 00015)	for dissolving into dissection and bath solutions
Parafilm	Bemis	PM992
Pasteur pipette bulb (3 ml)	Fisher Scientific	03-448-25	bulb for trituration pipettes
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	additive to prevent contamination of culture medium
Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing)	MWI Animal Health	15199	for euthanasia
PES membrane filters ,  0.2 micrometer	Nalgene	566-0020	for filtering solutions
PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm	CELLTREAT	229747	for filtering solutions drawn into syringes
Petri dishes, 35 x 10 mm	Genessee Scientific	32-103	for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration
Petri Dishes, 60 x 15 mm	Midland Scientific	P7455	for gross dissection
pH Meter	Mettler Toledo	Model S20
Pipettors (1000, 200, 10) microliter	USA Scientific
Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish	Mattek	P35GC-0-10-C	to plate neurons for culture
Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes	Warner Instruments	64-0375
Reference Cell	World Precision Instruments	RC1T
Scalpel blade	Miltex	4-315
Scalpel Handle	Fine Science Tools	10003-12
Scientific Scale	Mettler Toledo	XS64
Serological Pipettes (10, 25) milliliter	Fisher Scientific
Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber)	Warner Instruments	64-0378
Small Animal Guillotine	Kent Scientific	DCAP
Small animal guillotine	Kent Scientific	DCAP	for decapitation if dissecting rats older than P15.
Stereo Dissection Microscope	Zeiss	Stemi 2000
Straight surgical scissors	Fine Science Tools	14060-09
Syringe (3, 10, 30) milliliter
Trypsin	Sigma Aldrich	T1426	one out of three enzyme to digest tissue
Tuberculin syringe	Covidien	8881500105	for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection
Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-08
Volumetric flask, 1000 milliliter
Vortex	VWR	945300
Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system)	Millipore-Sigma	CDUFBI001