Isolement et culture de somates ganglionnaires vestibulaires et spiralés de rongeurs nouveau-nés pour les enregistrements Patch-Clamp

Résumé

Les méthodes présentées ici fournissent des instructions détaillées pour la dissection, la dissociation, la culture et l’enregistrement patch-clamp à partir de neurones ganglionnaires vestibulaires et ganglionnaires spiralés de l’oreille interne.

Résumé

La morphologie compacte des neurones ganglionnaires de l’oreille interne isolés et cultivés permet de caractériser en détail les canaux ioniques et les récepteurs des neurotransmetteurs qui contribuent à la diversité cellulaire au sein de cette population. Ce protocole décrit les étapes nécessaires à la dissection, à la dissociation et à la culture à court terme réussies des somata des neurones bipolaires de l’oreille interne à des fins d’enregistrements patch-clamp. Des instructions détaillées pour la préparation des neurones ganglionnaires vestibulaires sont fournies avec les modifications nécessaires nécessaires au placage des neurones ganglionnaires spiralés. Le protocole comprend des instructions pour effectuer des enregistrements de patch-clamp de cellules entières dans la configuration de patch perforé. Des exemples de résultats caractérisant les enregistrements par pince de tension de courants cycliques activés par hyperpolarisation et dépendants des nucléotides (HCN) mettent en évidence la stabilité de la configuration d’enregistrement de patch perforé par rapport à la configuration plus standard de patch rompu. La combinaison de ces méthodes, somata isolée et enregistrements perforés-patch-clamp, peut être utilisée pour étudier les processus cellulaires qui nécessitent des enregistrements longs et stables et la préservation du milieu intracellulaire, tels que la signalisation par des récepteurs couplés aux protéines G.

Introduction

Les neurones bipolaires du nerf vestibulocochléaire relient les cellules ciliées sensorielles de l’oreille interne au tronc cérébral. Ils sont les principaux vecteurs d’informations sur le son et les mouvements de la tête ; Les dommages causés à ces cellules importantes entraînent une surdité et des troubles de l’équilibre. Les parties vestibulaire et auditive du nerf sont chacune composées de types cellulaires distincts qui sont morphologiquement et fonctionnellement diversifiés ^1,2. Dans le système vestibulaire, deux sous-populations afférentes se déclenchent spontanément à des intervalles réguliers ou irrég....

Protocole

Toute utilisation animale décrite ici a été approuvée par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie du Sud. Les animaux de ce protocole sont des rats Long Evans des deux sexes âgés de P3 à P25 obtenus auprès des laboratoires Charles River, mais ces méthodes peuvent être appliquées à d’autres souches de rongeurs. Une blouse de laboratoire et des gants doivent être portés pendant toutes les procédures, ainsi que des lunettes de protection contre les éclaboussures lors de la préparation des solutions.

1. Préparatifs

REMARQUE : Les solutions et le....

Résultats

L’exécution de protocoles de pince de tension en appliquant des familles de pas de tension révèle l’activation dépendante de la tension d’une variété de familles de courants différentes. Des exemples représentatifs de courants de cellules entières évoqués à partir d’un VGN et adaptés d’enregistrements publiés¹³ sont présentés à la figure 1A,B. L’application de tensions dépolarisantes (Figure 1B

Discussion

Les méthodes présentées ici sont spécifiques aux enregistrements de neurones isolés ; Des études antérieures se sont concentrées sur des enregistrements à partir de terminaisons axonales dans une préparation semi-intacte. Par rapport aux techniques d’enregistrement terminales existantes, les enregistrements isolés offrent un comportement supérieur en termes de pince d’espace et d’isopotentiel. De plus, ce protocole permet d’accéder à un échantillon plus large de neurones, puisque seules les sous-po.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin	Sigma-Aldrich	A4888-100MG	For perforated patch recordings.
ATP di-sodium	Sigma-Aldrich	A7699	Additive to internal solution
B27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044	additive to culture medium, for SGN
Beakers (1000, 100, 10) milliliter
bench-top centrifuge	USA Scientific	2641-0016
Bunsen burner
CaCl2	J.T. Baker	1311-01	Additive to internal solution
Collagenase	Sigma-Aldrich	C5318	one out of three enzyme to digest tissue
Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40	Warner Instruments	64-0707
DMSO	Biotium	90082
Dnase I,from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	11284932001	one out of three enzyme to digest tissue
Dumont #3 Forceps (Blunt)	Fine Science Tools	11231-30
Dumont #5 Forceps (Fine)	Fine Science Tools	11251-10
Dumont #55 Forceps (Fine)	Fine Science Tools	11255-20
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	Additive to internal solution
Electrode Puller	Narashige	PC-10
Epi-illumination light source	Zeiss	CL 1500 ECO
Ethanol	Decon Labs	2716	for cleaning head and around dissection bench
Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes	Sutter Instruments	BF140-117-10
Fine-edged dissection blade	Fine Science Tools	10010-00
Glass Pasteur Pipettes	VWR	14673-010	to pull trituration pipettes
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16140063	additive to culture medium
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-100G	for pH buffering all solutions in protocol
Hot plate / magnetic stirrers	VWR	76549-914
Insulated bucket filled with ice			to keep all samples and solutions cool
K2SO4, Potassium Sulfate	Sigma Aldrich	P9458-250G	Additive to internal solution
KCl	Sigma-Aldrich	P93333	Additive to internal solution
KOH (1 M)	Honeywell	319376-500ML	To bring internal solution to desired pH.
Large Spring Scissors	Fine Science Tools	14133-13
Leibovitz medium	Sigma Aldrich	L4386	dissection and bath solutions
Low-profile-bath recording chamber for culture dishes	Warner Instruments	64-0236
luer-lok syringes, 30 ml	BD	302832	for drawing L-15/HEPES/HEPES solution.
MEM + Glutamax Supplement	Fisher Scientific	41-090-101	base of the culture medium
MgCl2-Hexahydrate	Sigma-Aldrich	M1028	Additive to internal solution
microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge	World Precision Instruments	MF34G
Microforge	Narashige	MF-90	For electrode polishing.
N2 Supplement (100x)	Thermo Fisher Scientific	17502-048	additiive to culture medium, for SGN
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Additive to internal solution
NaOH (1 M)	Thomas Scientific	319511-500ML	for titration pH
Osmometer	Advanced Instruments Inc.	3320
Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing	USC Material Management	MEDOX200 (Identifier: 00015)	for dissolving into dissection and bath solutions
Parafilm	Bemis	PM992
Pasteur pipette bulb (3 ml)	Fisher Scientific	03-448-25	bulb for trituration pipettes
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	additive to prevent contamination of culture medium
Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing)	MWI Animal Health	15199	for euthanasia
PES membrane filters ,  0.2 micrometer	Nalgene	566-0020	for filtering solutions
PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm	CELLTREAT	229747	for filtering solutions drawn into syringes
Petri dishes, 35 x 10 mm	Genessee Scientific	32-103	for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration
Petri Dishes, 60 x 15 mm	Midland Scientific	P7455	for gross dissection
pH Meter	Mettler Toledo	Model S20
Pipettors (1000, 200, 10) microliter	USA Scientific
Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish	Mattek	P35GC-0-10-C	to plate neurons for culture
Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes	Warner Instruments	64-0375
Reference Cell	World Precision Instruments	RC1T
Scalpel blade	Miltex	4-315
Scalpel Handle	Fine Science Tools	10003-12
Scientific Scale	Mettler Toledo	XS64
Serological Pipettes (10, 25) milliliter	Fisher Scientific
Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber)	Warner Instruments	64-0378
Small Animal Guillotine	Kent Scientific	DCAP
Small animal guillotine	Kent Scientific	DCAP	for decapitation if dissecting rats older than P15.
Stereo Dissection Microscope	Zeiss	Stemi 2000
Straight surgical scissors	Fine Science Tools	14060-09
Syringe (3, 10, 30) milliliter
Trypsin	Sigma Aldrich	T1426	one out of three enzyme to digest tissue
Tuberculin syringe	Covidien	8881500105	for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection
Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-08
Volumetric flask, 1000 milliliter
Vortex	VWR	945300
Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system)	Millipore-Sigma	CDUFBI001