Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يكشف اختبار التشابك الكيميائي BS3 عن انخفاض تعبير مستقبلات GABAA لسطح الخلية في أدمغة الفئران في ظل ظروف الإجهاد النفسي والاجتماعي المزمنة.

Abstract

القلق هو حالة من العاطفة التي تؤثر بشكل متغير على سلوكيات الحيوانات ، بما في ذلك الوظائف المعرفية. لوحظت العلامات السلوكية للقلق في جميع أنحاء المملكة الحيوانية ويمكن التعرف عليها على أنها استجابات تكيفية أو غير قادرة على التكيف مع مجموعة واسعة من طرق الإجهاد. توفر القوارض نموذجا تجريبيا مثبتا للدراسات الانتقالية التي تتناول الآليات التكاملية للقلق على المستويات الجزيئية والخلوية والدائرة. على وجه الخصوص ، يثير نموذج الإجهاد النفسي والاجتماعي المزمن استجابات غير قادرة على التكيف تحاكي الأنماط الظاهرية السلوكية الشبيهة بالقلق / الاكتئاب والتي تشبه البشر والقوارض. بينما تظهر الدراسات السابقة آثارا كبيرة للإجهاد المزمن على محتويات الناقل العصبي في الدماغ ، فإن تأثير الإجهاد على مستويات مستقبلات الناقل العصبي غير مدروس. في هذه المقالة ، نقدم طريقة تجريبية لتحديد مستويات السطح العصبي لمستقبلات الناقلات العصبية في الفئران تحت الضغط المزمن ، مع التركيز بشكل خاص على مستقبلات حمض جاما أمينوبتيريك (GABA) ، والتي تشارك في تنظيم العاطفة والإدراك. باستخدام التشابك الكيميائي غير المنفذ الذي لا رجعة فيه ، bissulfosuccinimidyl suberate (BS3) ، نظهر أن الإجهاد المزمن يقلل بشكل كبير من توافر السطح لمستقبلات GABAA في قشرة الفص الجبهي. مستويات السطح العصبي لمستقبلات GABAA هي عملية تحديد معدل النقل العصبي GABA ، وبالتالي ، يمكن استخدامها كعلامة جزيئية أو وكيل لدرجة الأنماط الظاهرية الشبيهة بالقلق / الاكتئاب في النماذج الحيوانية التجريبية. ينطبق هذا النهج المتشابك على مجموعة متنوعة من أنظمة المستقبلات للناقلات العصبية أو المعدلات العصبية المعبر عنها في أي منطقة دماغية ومن المتوقع أن يساهم في فهم أعمق للآليات الكامنة وراء العاطفة والإدراك.

Introduction

تتوضع مستقبلات الناقل العصبي إما على سطح غشاء البلازما العصبية أو داخل الخلايا على الأغشية الداخلية (على سبيل المثال ، الإندوسوم أو الشبكة الإندوبلازمية [ER] أو جهاز Trans-Golgi) وتنتقل ديناميكيا بين هاتين الجزأين اعتمادا على الحالات الفسيولوجية الجوهرية في الخلايا العصبية أو استجابة لأنشطة الشبكة العصبية الخارجية 1,2. نظرا لأن الناقلات العصبية المفرزة حديثا تثير وظائفها الفسيولوجية بشكل أساسي من خلال مجموعة المستقبلات الموضعية على السطح ، فإن مستويات المستقبلات السطحية لناقل عصبي معين هي أحد المحددات الحاسمة لقدرتها على الإشارة داخل الدائرة العصبية3.

تتوفر عدة طرق لمراقبة مستويات المستقبلات السطحية في الخلايا العصبية المستزرعة ، بما في ذلك مقايسة البيوتينيل السطحي4 ، ومقايسة التألق المناعي مع جسم مضاد محدد في ظروف غير نفاذية5 ، أو استخدام جين محوري مستقبلات مدمج وراثيا مع مؤشر بصري فلوري حساس لدرجة الحموضة (على سبيل المثال ، pHluorin)6. على النقيض من ذلك ، فإن هذه الأساليب إما محدودة أو غير عملية عند تقييم مستويات المستقبلات السطحية في الجسم الحي. على سبيل المثال ، قد لا يكون إجراء البيوتينيل السطحي عمليا لمعالجة كميات كبيرة وأعداد عينات من أنسجة المخ في الجسم الحي بسبب سعره المرتفع نسبيا والخطوات اللاحقة اللازمة لتنقية البروتينات البيوتينيل على حبات مقترنة بالأفيدين. بالنسبة للخلايا العصبية المضمنة في بنية الدماغ ثلاثية الأبعاد ، قد يشكل انخفاض إمكانية الوصول إلى الأجسام المضادة أو الصعوبات في القياس الكمي القائم على المجهر قيدا كبيرا لتقييم مستويات المستقبلات السطحية في الجسم الحي. لتصور توزيع مستقبلات الناقلات العصبية في أدمغة سليمة ، يمكن استخدام طرق غير جراحية ، مثل التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني ، لقياس إشغال المستقبلات وتقدير مستويات المستقبلات السطحية7. ومع ذلك ، يعتمد هذا النهج بشكل حاسم على توافر روابط راديوية محددة ، ومعدات باهظة الثمن ، وخبرة خاصة ، مما يجعلها أقل سهولة للاستخدام الروتيني من قبل معظم الباحثين.

هنا ، نصف طريقة بسيطة ومتعددة الاستخدامات لقياس مستويات المستقبلات السطحية في أدمغة التجارب خارج الجسم الحي باستخدام رابط متشابك كيميائي قابل للذوبان في الماء وغير منفذ للغشاء ، مكرر (سلفوسوسينيميديل) suberate (BS3) 8,9. يستهدف BS3 الأمينات الأولية في السلسلة الجانبية لبقايا اللايسين ويمكنه ربط البروتينات تساهميا بالقرب من بعضها البعض. عندما يتم تحضير شرائح الدماغ حديثا من منطقة ذات أهمية وتحضينها في مخزن مؤقت يحتوي على BS3 ، يتم ربط مستقبلات سطح الخلية مع البروتينات المجاورة ، وبالتالي تتحول إلى أنواع ذات وزن جزيئي أعلى ، في حين تظل المستقبلات المرتبطة بالغشاء الداخلي داخل الخلايا دون تعديل. لذلك ، يمكن فصل برك المستقبلات السطحية وداخل الخلايا عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) وقياسه بواسطة اللطخة الغربية باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالمستقبل المراد دراسته.

الإجهاد الخفيف المزمن غير المتوقع (UCMS) هو نموذج تجريبي راسخ لإحداث الإجهاد النفسي والاجتماعي المزمن في القوارض10. يثير UCMS الأنماط الظاهرية السلوكية الشبيهة بالقلق / الاكتئاب والعجز المعرفي من خلال تعديل مجموعة من أنظمة الناقلات العصبية ، بما في ذلك GABA ومستقبلاتها10,11. على وجه الخصوص ، فإن مستقبلات GABA A المحتوية على الوحدة الفرعية α5 (α5-GABAAR) متورطة في تنظيم الذاكرة والوظائف المعرفية12,13 ، مما يشير إلى احتمال مشاركة الوظائف المتغيرة لهذه الوحدة الفرعية في العجز المعرفي الناجم عن UCMS. في هذا البروتوكول ، استخدمنا مقايسة التشابك BS3 لتحديد مستويات α5-GABAAR المعبر عنها سطحيا في قشرة الفص الجبهي للفئران المعرضة ل UCMS مقارنة بالفئران الضابطة غير المجهدة.

Protocol

تم الانتهاء من جميع الأعمال الحيوانية في هذا البروتوكول وفقا لقانون أونتاريو للحيوانات للبحوث (RSO 1990 ، الفصل A.22) والمجلس الكندي لرعاية الحيوان (CCAC) وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية.

1. إعداد الحيوانات

  1. تحديد أعداد الحيوانات التي سيتم استخدامها في التجارب ، وتقسيمها إلى مجموعات مناسبة أو مجموعات تجريبية. راجع قسم المناقشة لمناقشة حجم المجموعة والجنس والقوة الإحصائية.
    ملاحظة: تم تخصيص هذا البروتوكول للفئران (سلالة C57BL6 / J ؛ 2-4 أشهر من العمر ؛ عادة 20-30 جم من وزن الجسم ؛ أعداد مكافئة من الذكور والإناث لاستخدامها).
  2. ضع الحيوانات تحت UCMS أو تحكم في الظروف غير المجهدة لمدة 5-8 أسابيع ، باتباع البروتوكول كما هو موضح سابقا14.
  3. بعد إجراء UCMS الأخير ، اسمح للحيوانات بالبقاء في أقفاصها المنزلية لمدة 1 يوم قبل استخدامها لمقايسة التشابك لتجنب تأثيرات الإجهاد الحادة على تعبير المستقبلات.

2. إعداد حلول الأسهم

  1. قم بإعداد وتخزين الحلول التالية وفقا للتعليمات قبل الفحص.
    1. تحضير 5 M كلوريد الصوديوم عن طريق إذابة 14.6 g من كلوريد الصوديوم في 40 mL من الماء منزوع الأيونات. يحفظ في درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. تحضير 1.08 M KCl عن طريق إذابة 3.22 g من KCl في 40 mL من الماء منزوع الأيونات. متجر في RT.
    3. تحضير 400 mM MgCl 2 عن طريق إذابة 3.25 جم من MgCl 2 · 6H2 O في 40 مل منالماء منزوع الأيونات. متجر في RT.
    4. تحضير 1 M الجلايسين عن طريق إذابة 3 غرام من الجلايسين في 40 مل من الماء منزوع الأيونات ، وتخزينها في 4 °C.
    5. تحضير 1 M ديثيوثريتول (DTT) عن طريق إذابة 1.54 غرام من DTT في 10 مل من الماء منزوع الأيونات. قم بتعقيمه من خلال مرشح بحجم مسام 0.2 ميكرومتر ، والقسمة إلى أنابيب سعة 2 مل. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    6. تحضير 10٪ Nonidet-P40 (NP-40) عن طريق تخفيفه بنسبة 1:10 (v / v) في الماء منزوع الأيونات. متجر في RT.
    7. تحضير 0.5 M EDTA (درجة الحموضة = 8.0) ، وتخزينها في RT.
    8. تحضير 1 M HEPES العازلة (الرقم الهيدروجيني = 7.2-7.5) ، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    9. تحضير 2.5 م أو 45٪ (وزن / حجم) الجلوكوز ، وتخزينها في درجة حرارة 4 درجة مئوية.

3. إعداد محطة العمل

  1. في يوم اختبار BS3 المتشابك ، اجمع المواد التالية في غرفة تشريح الحيوانات (الشكل 1) ، مع العديد من العناصر المبردة مسبقا على الجليد: دلو ثلج ، كتلة درجة حرارة معدنية (مبردة مسبقا على الجليد) ، برنامج تلفزيوني بارد بالجليد في أنبوب مخروطي سعة 50 مل و PBS مجمد في طبق بتري ، ورق ترشيح مبلل ب PBS ويوضع على سطح مستو مبرد أو ثلج أزرق ، مصفوفة دماغية (فاصل 1 مم لإدخال شفرة الحلاقة) مبردة مسبقا على الجليد ، شفرات حلاقة (~ 10) مبردة مسبقا على الجليد ، أدوات تشريح (مقص ، ملقط ، مسبار منحني) ، لكمة أنسجة ، 70٪ رذاذ الإيثانول يمسح الورق والمناشف الورقية ، أطراف الماصة (200 ميكرولتر) ، ماصة (P200) ، ساعة توقيت ، لوحة مذكرات ، قلم ، وأنابيب طرد مركزي دقيقة (1.5 مل).
    1. قبل الفحص ، قم بتسمية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة بمعلومات العينة (على سبيل المثال ، رقم معرف الحيوان ، ونوع العلاج [UCMS مقابل عدم الإجهاد (NS)] ، ومنطقة الدماغ ، مع أو بدون BS3 ، وما إلى ذلك).
      ملاحظة: بالنسبة لمقايسات التشابك BS3 ، يجب جمع عينتين من كل منطقة دماغية ؛ سيتم استخدام عينة واحدة للربط المتشابك (مع BS3) والأخرى للتفاعل غير المتشابك (بدون BS3) كعنصر تحكم. لذلك ، من أجل أخذ عينات من منطقتين في الدماغ (أي قشرة الفص الجبهي [PFC] والحصين [HPC]) في 12 فأرا ، قم بتسمية 48 أنبوبا لأخذ العينات الأولية (= عينتان × منطقتان × 12 فئران) (لاستخدامها في القسم 6). قم بتسمية مجموعتين إضافيتين من 48 أنبوبا للتخزين لاحقا (لتخزين مجلدين مختلفين [100 ميكرولتر ، 300 ميكرولتر] من كل عينة) (لاستخدامها في القسم 7). وبالتالي ، يلزم تسمية 144 أنبوبا إجمالا لحجم المجموعة هذا.
  2. بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من توفر المعدات التالية في المختبر: جهاز طرد مركزي دقيق مبرد على سطح الطاولة ، وجهاز صوتي ، ودوار أنبوبي (يستخدم في الغرفة الباردة أو داخل الثلاجة [4 درجات مئوية]) ، ومجمد (-80 درجة مئوية) لتخزين العينات ، ودلو من الثلج الجاف للتخزين المؤقت للعينات (يستخدم في القسم 7)

4. إعداد حلول العمل والمخازن المؤقتة

ملاحظة: في صباح يوم الفحص ، قم بإعداد الحلول التالية. يعتمد هذا الحساب على الحلول اللازمة لمعالجة منطقتين في الدماغ (أي PFC و HPC) من 12 فأرا.

  1. تحضير السائل النخاعي الاصطناعي (aCSF ، درجة الحموضة = 7.4) كما هو مذكور في الجدول 1. قم بتوزيع 750 ميكرولتر من aCSF في كل أنبوب أخذ عينات (الأنابيب ال 48 الموضحة في الخطوة 3.1.1) ، وضعها في كتلة درجة الحرارة المعدنية على الجليد لتبريد المخزن المؤقت مسبقا.
  2. تحضير المخزن المؤقت للتحلل كما هو مذكور في الجدول 2. يخزن على الثلج (400 ميكرولتر للاستخدام لكل عينة).
  3. قم بإعداد محلول مخزون BS3 52 مللي متر (26x) في محلول سترات الصوديوم 5 مللي مول (الرقم الهيدروجيني = 5.0).
    1. أولا ، تحضير 100 mM حامض الستريك (الأسهم A) و 100 mM سيترات الصوديوم (الأسهم B).
    2. تمييع الأسهم A والأسهم B بنسبة 1:20 مع الماء منزوع الأيونات. أضف 100 ميكرولتر لكل منهما إلى 1.9 مل من الماء لتحضير 5 مللي متر من حامض الستريك (المخزون C) و 5 مللي متر سترات الصوديوم (المخزون D) ، على التوالي.
    3. امزج 410 ميكرولتر من المخزون C و 590 ميكرولتر من المخزون D لتحضير مخزن سترات الصوديوم 5 مللي متر (الرقم الهيدروجيني = 5.0) (المحلول E ، 1 مل).
    4. تأكد من الأس الهيدروجيني للمحلول E باستخدام شريط مؤشر الأس الهيدروجيني.
    5. قم بإذابة 24 مجم من BS3 في 806.4 ميكرولتر من المحلول E عن طريق الدوامة لمدة 30 ثانية لتحضير محلول مخزون BS3 (26x).
    6. قم بإعداد 1 مل أخرى من المحلول E لاستخدامها كعنصر تحكم في السيارة للعينات غير المتشابكة.
      ملاحظة: قم بإعداد حل مخزون BS3 عندما يكون كل شيء آخر جاهزا والتجربة على وشك البدء. يجب تخزين BS3 مجففا عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. بمجرد إعادة تشكيله ، يظل BS3 نشطا فقط لمدة ≤3 ساعة تقريبا. نظرا لأن الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت لسترات الصوديوم 5 مللي متر (المحلول E) يرتفع بمرور الوقت ، مما يتسبب في تسارع التحلل المائي BS3 ، فمن المستحسن تحضير المحلول E طازجا من محلولي المخزون A و B9. نظرا لقابلية الذوبان المحدودة ل BS3 في درجات حرارة منخفضة ، احتفظ ب BS3 المعاد تشكيله في RT. استخدم BS3 المعاد تشكيله في 3 ساعات ، ولا تجمد / تذوب أو تعيد استخدام BS3 المعاد تشكيله.

5. تشريح أنسجة المخ

ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، يجب أن يعمل شخصان على الأقل معا بطريقة منسقة. بينما يركز شخص واحد على تشريح الحيوانات (الخطوات 5.2-5.10 والخطوة 6.3) ، يجب أن يعمل الشخص الآخر كضابط للوقت ويساعد في تنسيق الفحص (الخطوة 5.1 والخطوة 6.1 والخطوة 6.2 والخطوة 6.4 والخطوة 6.5)

  1. أحضر أول للتشريح من منطقة السكن إلى غرفة التشريح.
    ملاحظة: نظرا لأن الضغوطات الحادة (على سبيل المثال ، بيئة جديدة ، رائحة الدم) قد تؤثر على ديناميكيات بروتين الدماغ ، يجب الاحتفاظ بالحيوانات في أقفاصها المنزلية الموضوعة بعيدا عن منطقة التشريح ثم يتم إحضارها بشكل فردي إلى غرفة التشريح لقطع الرأس الفوري.
  2. القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم متبوعا بقطع الرأس. أخرج الدماغ بسرعة من الجمجمة ، واغمره في برنامج تلفزيوني بارد في طبق بتري لمدة 10-15 ثانية (الشكل 2).
    ملاحظة: لا يتم تخدير الحيوانات لتجارب BS3 لأن أي عامل مخدر يمكن أن يؤثر على مستوى العرض السطحي لمستقبلات الناقل العصبي9.
  3. ضع الدماغ المبرد في مصفوفة الدماغ على الجليد ، مع توجيه الجانب البطني من الدماغ لأعلى (الشكل 3).
  4. أدخل شفرة الحلاقة الأولى عبر الحدود بين البصلة الشمية والسويقة الشمية لقطع الدماغ إكليليا (الشكل 4). باستخدام ثلاث إلى أربع شفرات حلاقة إضافية ، قم بقطع الجزء الأمامي من الدماغ بشكل متسلسل بفواصل زمنية 1 مم.
  5. ارفع الشرائح الإكليلية عن مصفوفة الدماغ عن طريق تثبيت جميع شفرات الحلاقة المدرجة معا ، تاركا الجزء الخلفي من الدماغ خلفه في مصفوفة الدماغ. استخدم الملقط لفصل شفرات الحلاقة عن بعضها البعض ، وضعها على سطح مستو ومبرد مع توجيه شريحة الدماغ لأعلى (الشكل 5).
  6. حدد الشرائح التي تحتوي على منطقة الاهتمام. لأخذ عينات من PFC ، اختر الشريحتين الثانية والثالثة خلف الشريحة الأولى التي تحتوي على السويقة الشمية.
  7. قم بإزالة المنطقة محل الاهتمام باستخدام لكمة الأنسجة (الفيديو 1) ، وضعها جانبا على شفرة الحلاقة المبردة ، وقسم الأنسجة بالتساوي إلى قسمين (على سبيل المثال ، الأنسجة من نصف الكرة الأيسر مقابل نصف الكرة الأيمن ، مع استخدام نصفها لتفاعل التشابك BS3 والنصف الآخر للتحكم في عدم التشابك إذا تم التعبير عن البروتين المستهدف محل الاهتمام بالتساوي في نصفي الكرة الأرضية).
  8. قم بفرم كل منديل إلى قطع على شفرة الحلاقة باستخدام الطرف الرفيع للملقط بحركات رأسية متعددة ضد الشفرة (فيديو 2) بدلا من هرس الأنسجة أو طحنها. سيؤدي ذلك إلى زيادة مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها بواسطة BS3 دون المساس بشدة بسلامة غشاء الخلايا. مباشرة بعد الفرم ، انقل الأنسجة المفرومة إلى الأنابيب المناسبة (انظر الخطوة 6.3).
  9. لأخذ عينات من HPC ، أخرج الجزء الخلفي من الدماغ من المصفوفة ، وضع الدماغ على ورق ترشيح مبلل على السطح المسطح المبرد ، مع توجيه الجانب الظهري لأعلى (الشكل 6).
  10. باستخدام مسبار منحني وملقط ، والاقتراب من الجانب الظهري (فيديو 3) ، قم بتشريح HPC (النصف الظهري أو النصف البطني أو كليهما) من نصفي الكرة الأرضية (نصف للتشابك BS3 والنصف الآخر للتحكم ). فرم كل نسيج كما في الخطوة 5.8 ، وانقل الأنسجة إلى أنابيب مناسبة (انظر الخطوة 6.3).
    ملاحظة: يجب الحفاظ على وقت التشريح الكامل لكل حيوان عند ~ 5 دقائق حتى تكون الظروف والنتائج التجريبية متسقة.

6. تفاعل التشابك

  1. أحضر الحيوان التالي للتشريح من منطقة السكن إلى غرفة التشريح عندما يكون تشريح دماغ الفأر السابق على وشك الانتهاء (الخطوة 5.10).
  2. قم برفع الأنبوب المبرد مسبقا على الثلج (من الخطوة 4.1) باستخدام 30 ميكرولتر من محلول BS3 (26x) أو محلول السيارة E مباشرة قبل أن تصبح المناديل المفرومة جاهزة للنقل إلى الأنابيب المناسبة. قم بتغيير أطراف الماصة بين الأنابيب لضمان عدم تلوث BS3 في أنابيب التحكم غير المتشابكة.
  3. انقل الأنسجة المفرومة (من الخطوة 5.8 والخطوة 5.10) إلى الأنابيب المناسبة ، ثم ابدأ في تشريح الحيوان التالي (الخطوة 5.2)
  4. اقلب الأنبوب واخلطه لتقسيم قطع الأنسجة إلى قطع أصغر (فيديو 4) ، وابدأ في احتضان العينات على دوار الأنبوب في الغرفة الباردة لمدة 30 دقيقة إلى 2 ساعة. سجل وقت بدء حضانة BS3 لكل أنبوب. راجع قسم المناقشة لمعرفة وقت الحضانة الأمثل.
  5. قم بإخماد التفاعل عن طريق رفع الأنبوب ب 78 ميكرولتر من 1 M glycine ، واحتضان العينة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية مع دوران ثابت. سجل وقت بدء ونهاية التبريد لكل أنبوب. استمر في مساعدة الشخص الذي يركز على تشريح الحيوان عن طريق إحضار الحيوان التالي (الخطوة 6.1) والمساعدة في التشابك (الخطوة 6.2).
    ملاحظة: تعامل مع كل عينة بنفس التوقيت بالضبط عبر جميع العينات. إذا كانت غرفة التشريح بعيدة عن الغرفة الباردة ، فمن المستحسن بشدة تجنيد شخص ثالث للمشاركة في حضانة العينة والتبريد في الغرفة الباردة.

7. تحلل الأنسجة ، وإعداد البروتين ، واللطخة الغربية

  1. بعد 10 دقائق من التبريد (الخطوة 6.5) ، قم بتدوير العينات عند 20000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 2 دقيقة ، وتخلص من المادة الطافية. في حالة توفر شخص ثالث ، انتقل إلى الخطوة 7.2 ؛ خلاف ذلك ، قم بتجميد العينات على الثلج الجاف ، وأوقف الفحص هنا حتى يتم الانتهاء من تشريح الدماغ (القسم 5) والتشابك (القسم 6) لجميع الحيوانات.
  2. أضف 400 ميكرولتر من محلول تحلل الثلج البارد لكل أنبوب.
  3. قم بتقطيع العينات لمدة 1 ثانية خمس مرات مع فترات 5 ثوان بينهما ، مع الاحتفاظ بالعينات على الجليد.
  4. قم بتدوير العينات عند 20000 × جم لمدة 2 دقيقة لتدوير بقايا الأنسجة غير القابلة للذوبان (الحبيبات) ، وحفظ المادة الطافية.
  5. استخدم 5 ميكرولتر من المادة الطافية لقياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة حمض البيسينتشونينيك (BCA).
  6. قسم بقية المادة الطافية إلى أنبوبين ؛ يحتوي أنبوب واحد على 100 ميكرولتر من المادة الطافية للبقعة الغربية اللاحقة ، ويحتوي الأنبوب الآخر على الباقي (~ 300 ميكرولتر) للتخزين طويل الأجل عند -80 درجة مئوية. أضف كمية مناسبة من 4x SDS عينة عازلة (مكملة ب β2-mercaptoethanol) إلى العينات ، واحتضانها عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  7. قم بتشغيل 10-20 ميكروغرام من البروتين لكل بئر على هلام الأكريلاميد للرحلان الكهربائي (SDS-PAGE) ، ثم انقل البروتينات إلى غشاء فلوريد البولي فينيليدين (PVDF) لتحليل اللطخة الغربية.
  8. سد غشاء PVDF في 5٪ (وزن / حجم) حليب خالي الدسم مذاب في محلول ملحي مخزن Tris يحتوي على 0.1٪ Tween-20 (TBS-T) لمدة 1 ساعة في RT.
  9. اغسل الغشاء لفترة وجيزة مرتين باستخدام TBS-T ، واحتضنه بالجسم المضاد الأساسي المخفف في TBS-T طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  10. اغسل الجسم المضاد الأساسي ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها في TBS-T في RT.
  11. احتضان الغشاء مع الجسم المضاد الثانوي المترافق بيروكسيديز الفجل المخفف في TBS-T لمدة 1 ساعة في RT.
  12. اغسل الجسم المضاد الثانوي ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها في TBS-T في RT.
  13. احتضان الغشاء في كاشف التلألؤ الكيميائي المحسن ، وكشف الإشارة باستخدام جهاز توثيق الهلام.

النتائج

لإثبات جدوى مقايسة التشابك BS3 لتقييم مستويات α5-GABA A R السطحيةفي الفأر PFC ، قمنا بتشغيل 10 ميكروغرام لكل من عينات البروتين المتشابكة وغير المتشابكة BS3 على SDS-PAGE وقمنا بتحليل البروتينات بواسطة اللطخة الغربية باستخدام جسم مضاد ل α5-GABAAR (متعدد النسيلة للأرانب) (الشكل 7)....

Discussion

على الرغم من أن تأثير الإجهاد النفسي والاجتماعي المزمن على السلوكيات (أي العجز العاطفي والمعرفي) والتغيرات الجزيئية (أي انخفاض التعبير عن جينات GABAergic والعجز المصاحب في النقل العصبي GABAergic) موثق جيدا10 ، فإن الآليات الكامنة وراء هذا العجز تحتاج إلى مزيد من التحقيق. على وجه الخصوص...

Disclosures

لم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون موظفي مرفق الحيوانات CAMH لرعاية الحيوانات خلال مدة الدراسة. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR Project Grant #470458 to T.T.) ، وصندوق الاكتشاف من CAMH (إلى TP) ، والتحالف الوطني للبحوث حول الفصام والاكتئاب (جائزة NARSAD # 25637 إلى E.S.) ، ومعهد كامبل لأبحاث الصحة العقلية للأسرة (إلى E.S.). E.S. هو مؤسس Damona Pharmaceuticals ، وهي شركة أدوية حيوية مكرسة لجلب مركبات GABAergic الجديدة إلى العيادة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020
1 M HEPESGibco15630080
10x TBSBio-Rad1706435
2.5 M (45%, w/v) GlucoseSigmaG8769
2-mercaptoethanolSigmaM3148
4x SDS sample buffer (Laemmli)Bio-Rad1610747
Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)PierceA39266No-Weigh Format; 10 x 2 mg
Brain matrixTed Pella15003For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm
Calcium chloride (CaCl2)SigmaC4901
Curved probeFine Science Tools10088-15Gross Anatomy Probe; angled 45
Deionized watermilli-QEQ 7000Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] 
Dithiothreitol (DTT)Sigma10197777001
Filter paper (3MM)Whatman3030-917
Forceps (large)Fine Science Tools11152-10Extra Fine Graefe Forceps
Forceps (small)Fine Science Tools11251-10Dumont #5 Forceps
GABA-A R alpha 5 antibodyInvitrogenPA5-31163Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking
GABA-A R alpha 5 C-terminus antibodyR&D SystemsPPS027Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat
GlycineSigmaW328707
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)Bio-Rad1721019
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O)SigmaM2670
Nonidet-P40, substitute (NP-40)SantaCruz68412-54-4
Potassium chloride (KCl)SigmaP9541
Protease inhibitor cocktailSigmaP8340
PVDF membraneBio-Rad1620177
Scissors (large)Fine Science Tools14007-14Surgical Scissors - Serrated
Scissors (small)Fine Science Tools14060-09Fine Scissors - Sharp
Sodium chloride (NaCl)SigmaS9888
Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) Qsonica15338284
Table-top refregerated centrifugeEppendorf5425R
Tissue punch (ID 1 mm)Ted Pella15110-10Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm
Trans-Blot Turbo 5x Transfer bufferBio-Rad10026938
Tube rotator (LabRoller)LabnetH5000

References

  1. Groc, L., Choquet, D. Linking glutamate receptor movements and synapse function. Science. 368 (6496), (2020).
  2. Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA receptor code of synaptic plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
  3. Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T. Role of DISC1 in neuronal trafficking and its implication in neuropsychiatric manifestation and neurotherapeutics. Neurotherapeutics. 14 (3), 623-629 (2017).
  4. Sumitomo, A., et al. Ulk2 controls cortical excitatory-inhibitory balance via autophagic regulation of p62 and GABAA receptor trafficking in pyramidal neurons. Human Molecular Genetics. 27 (18), 3165-3176 (2018).
  5. Brady, M. L., Jacob, T. C. Synaptic localization of α5 GABA (A) receptors via gephyrin interaction regulates dendritic outgrowth and spine maturation. Developmental Neurobiology. 75 (11), 1241-1251 (2015).
  6. Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. The Journal of Neuroscience. 25 (45), 10469-10478 (2005).
  7. Takamura, Y., Kakuta, H. In vivo receptor visualization and evaluation of receptor occupancy with positron emission tomography. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (9), 5226-5251 (2021).
  8. Archibald, K., Perry, M. J., Molnár, E., Henley, J. M. Surface expression and metabolic half-life of AMPA receptors in cultured rat cerebellar granule cells. Neuropharmacology. 37 (10-11), 1345-1353 (1998).
  9. Boudreau, A. C., et al. A protein crosslinking assay for measuring cell surface expression of glutamate receptor subunits in the rodent brain after in vivo treatments. Current Protocols in Neuroscience. , 1-19 (2012).
  10. Fee, C., Banasr, M., Sibille, E. Somatostatin-positive gamma-aminobutyric acid interneuron deficits in depression: Cortical microcircuit and therapeutic perspectives. Biological Psychiatry. 82 (8), 549-559 (2017).
  11. Bernardo, A., et al. Symptomatic and neurotrophic effects of GABAA receptor positive allosteric modulation in a mouse model of chronic stress. Neuropsychopharmacology. 47 (9), 1608-1619 (2022).
  12. Prévot, T., Sibille, E. Altered GABA-mediated information processing and cognitive dysfunctions in depression and other brain disorders. Molecular Psychiatry. 26 (1), 151-167 (2021).
  13. Martin, L. J., et al. Alpha5GABAA receptor activity sets the threshold for long-term potentiation and constrains hippocampus-dependent memory. The Journal of Neuroscience. 30 (15), 5269-5282 (2010).
  14. Nollet, M. Models of depression: Unpredictable chronic mild stress in mice. Current Protocols. 1 (8), e208 (2021).
  15. Tomoda, T., Sumitomo, A., Newton, D., Sibille, E. Molecular origin of somatostatin-positive neuron vulnerability. Molecular Psychiatry. 27 (4), 2304-2314 (2022).
  16. Guilloux, J. P., et al. Molecular evidence for BDNF- and GABA-related dysfunctions in the amygdala of female subjects with major depression. Molecular Psychiatry. 17 (11), 1130-1142 (2012).
  17. Lin, L. C., Sibille, E. Somatostatin, neuronal vulnerability and behavioral emotionality. Molecular Psychiatry. 20 (3), 377-387 (2015).
  18. Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. The Journal of Comparative Neurology. 359 (1), 154-194 (1995).
  19. Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. Fluorescence activated cell sorting (FACS) and gene expression analysis of Fos-expressing neurons from fresh and frozen rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (114), e54358 (2016).
  20. Boudreau, A. C., Wolf, M. E. Behavioral sensitization to cocaine is associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus accumbens. The Journal of Neuroscience. 25 (40), 9144-9151 (2005).
  21. Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
  22. Tomoda, T., et al. BDNF controls GABAAR trafficking and related cognitive processes via autophagic regulation of p62. Neuropsychopharmacology. 47 (2), 553-563 (2022).
  23. Hernandez-Rabaza, V., et al. Sildenafil reduces neuroinflammation and restores spatial learning in rats with hepatic encephalopathy: Underlying mechanisms. Journal of Neuroinflammation. 12, 195 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195 BS3 GABAA 5

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved