BS3 Chemical Crosslinking Assay: Bewertung der Wirkung von chronischem Stress auf die Präsentation desGABA-A-Rezeptors auf der Zelloberfläche im Gehirn von Nagetieren

Zusammenfassung

Der BS3 Chemical Crosslinking Assay zeigt eine reduzierte Expression des_{GABA-A-Rezeptors} auf der Zelloberfläche im Gehirn von Mäusen unter chronischen psychosozialen Stressbedingungen.

Zusammenfassung

Angst ist ein Gefühlszustand, der das Verhalten von Tieren, einschließlich der kognitiven Funktionen, variabel beeinflusst. Verhaltensauffällige Angstzustände werden im gesamten Tierreich beobachtet und können entweder als adaptive oder maladaptive Reaktionen auf eine Vielzahl von Stressmodalitäten erkannt werden. Nagetiere bieten ein bewährtes experimentelles Modell für translationale Studien, die sich mit den integrativen Mechanismen der Angst auf molekularer, zellulärer und Schaltkreisebene befassen. Insbesondere löst das Paradigma des chronischen psychosozialen Stresses maladaptive Reaktionen aus, die angst-/depressive Verhaltensphänotypen nachahmen, die zwischen Menschen und Nagetieren analog sind. Während frühere Studien signifikante Auswirkungen von chronischem Stress auf den Neurotransmittergehalt im Gehirn zeigen, ist die Wirkung von Stress auf den Neurotransmitterrezeptorspiegel nur unzureichend untersucht. In diesem Artikel stellen wir eine experimentelle Methode zur Quantifizierung der neuronalen Oberflächenniveaus von Neurotransmitterrezeptoren in Mäusen unter chronischem Stress vor, wobei wir uns insbesondere auf Gamma-Aminobuttersäure (GABA)-Rezeptoren konzentrieren, die an der Regulation von Emotionen und Kognition beteiligt sind. Mit Hilfe des membranundurchlässigen irreversiblen chemischen Vernetzers Bissulfosuccinimidylsuberat (BS3) zeigen wir, dass chronischer Stress die Oberflächenverfügbarkeit von_{GABA-A-Rezeptoren} im präfrontalen Kortex signifikant herunterreguliert. Die neuronalen Oberflächenniveaus von GABA-A-Rezeptoren sind der geschwindigkeitsbegrenzende Prozess für die GABA-Neurotransmission und könnten daher als molekularer Marker oder Proxy für den Grad angst-/depressiver Phänotypen in experimentellen Tiermodellen verwendet werden. Dieser Vernetzungsansatz ist auf eine Vielzahl von Rezeptorsystemen für Neurotransmitter oder Neuromodulatoren anwendbar, die in jeder Gehirnregion exprimiert werden, und soll zu einem tieferen Verständnis der Mechanismen beitragen, die Emotionen und Kognition zugrunde liegen.

Einleitung

Neurotransmitterrezeptoren sind entweder an der Oberfläche der neuronalen Plasmamembran oder intrazellulär auf den Endomembranen (z. B. dem Endosom, dem endoplasmatischen Retikulum [ER] oder dem trans-Golgi-Apparat) lokalisiert und pendeln dynamisch zwischen diesen beiden Kompartimenten, abhängig von intrinsischen physiologischen Zuständen in Neuronen oder als Reaktion auf extrinsische neuronale Netzwerkaktivitäten ^1,2. Da neu sezernierte Neurotransmitter ihre physiologischen Funktionen in erster Linie über den oberflächenlokalisierten Rezeptorpool hervorrufen, sind die Oberflächenrezeptorspiegel für einen bestimmten Neurotransmitter eine der kritischen Determinanten seiner Signalkapazität innerhalb des neuronalen Schaltkreises³.

Es stehen mehrere Methoden zur Verfügung, um den Oberflächenrezeptorspiegel in kultivierten Neuronen zu überwachen, darunter der Oberflächenbiotinylierungsassay⁴, der Immunfluoreszenz-Assay mit einem spezifischen Antikörper unter nicht-permeabilisierten Bedingungen⁵ oder die Verwendung eines Rezeptortransgens, das genetisch mit einem pH-empfindlichen fluoreszierenden optischen Indikator (z. B. pHluorin⁾ fusioniert ist6. Im Gegensatz dazu sind diese Ansätze bei der Bestimmung von Oberflächenrezeptorspiegeln in vivo entweder begrenzt oder unpraktisch. Beispielsweise ist das Oberflächenbiotinylierungsverfahren aufgrund seines relativ hohen Preises und der nachfolgenden Schritte, die für die Reinigung der biotinylierten Proteine auf Avidin-konjugierten Beads erforderlich sind, möglicherweise nicht für die Verarbeitung großer Mengen und Probenzahlen von In-vivo-Hirngewebe geeignet. Für Neuronen, die in eine dreidimensionale Gehirnarchitektur eingebettet sind, können eine geringe Zugänglichkeit von Antikörpern oder Schwierigkeiten bei der mikroskopischen Quantifizierung eine erhebliche Einschränkung für die Beurteilung der Oberflächenrezeptorkonzentrationen in vivo darstellen. Um die Verteilung von Neurotransmitterrezeptoren in intakten Gehirnen sichtbar zu machen, könnten nicht-invasive Methoden, wie die Positronen-Emissions-Tomographie, verwendet werden, um die Rezeptorbelegung zu messen und die Oberflächenrezeptorspiegel abzuschätzen⁷. Dieser Ansatz hängt jedoch entscheidend von der Verfügbarkeit spezifischer Radioliganden, teurer Ausrüstung und speziellem Fachwissen ab, was ihn für den routinemäßigen Einsatz für die meisten Forscher weniger zugänglich macht.

Hier beschreiben wir eine einfache, vielseitige Methode zur Messung von Oberflächenrezeptorspiegeln in experimentellen Tiergehirnen ex vivo unter Verwendung eines wasserlöslichen, membranundurchlässigen chemischen Vernetzers, Bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS3)^8,9. BS3 zielt auf primäre Amine in der Seitenkette von Lysinresten ab und kann Proteine in unmittelbarer Nähe zueinander kovalent vernetzen. Wenn Hirnschnitte aus einer Region von Interesse frisch präpariert und in einem BS3-haltigen Puffer inkubiert werden, werden die Rezeptoren auf der Zelloberfläche mit benachbarten Proteinen vernetzt und verwandeln sich so in Spezies mit höherem Molekulargewicht, während die intrazellulären Endomembran-assoziierten Rezeptoren unverändert bleiben. Daher können die Oberflächen- und intrazellulären Rezeptorpools durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt und mittels Western Blot unter Verwendung von Antikörpern, die für den zu untersuchenden Rezeptor spezifisch sind, quantifiziert werden.

Unpredictable chronic mild stress (UCMS) ist ein etabliertes experimentelles Paradigma zur Induktion von chronischem psychosozialem Stress bei Nagetieren¹⁰. UCMS löst angst-/depressive Verhaltensphänotypen und kognitive Defizite durch die Modulation einer Reihe von Neurotransmittersystemen aus, einschließlich GABA und seiner Rezeptoren^10,11. Insbesondere der α5-Untereinheit-enthaltende GABA-A-Rezeptor (α5-GABA_A R) ist an der Regulation des Gedächtnisses und der kognitiven Funktionen beteiligt^12,13, was auf eine mögliche Beteiligung veränderter Funktionen dieser Untereinheit an UCMS-induzierten kognitiven Defiziten hindeutet. In diesem Protokoll haben wir den BS3-Crosslinking-Assay verwendet, um die Konzentrationen von oberflächenexprimiertem α5-GABA_AR im präfrontalen Kortex von Mäusen, die UCMS ausgesetzt waren, im Vergleich zu nicht gestressten Kontrollmäusen zu quantifizieren.

Protokoll

Alle Tierarbeiten in diesem Protokoll wurden in Übereinstimmung mit dem Ontario Animals for Research Act (RSO 1990, Kapitel A.22) und dem Canadian Council on Animal Care (CCAC) durchgeführt und vom Institutional Animal Care Committee genehmigt.

1. Vorbereitung der Tiere

1. Bestimmen Sie die Anzahl der Tiere, die in den Versuchen verwendet werden sollen, und teilen Sie sie in geeignete Gruppen oder Versuchskohorten ein. Im Abschnitt "Diskussion" finden Sie eine Diskussion über die Gruppengröße, das Geschlecht und die statistische Aussagekraft.
   HINWEIS: Dieses Protokoll ist auf Mäuse zugeschnitten (Stamm C57BL6/J; Alter von 2-4 Monaten; typischerweise 20-30 g Körpergewicht; gleiche Anzahl von Männchen und Weibchen).
2. Setzen Sie die Tiere 5-8 Wochen lang unter UCMS oder kontrollieren Sie nicht gestresste Bedingungen, wobei Sie das zuvor beschriebene Protokoll befolgen¹⁴.
3. Lassen Sie die Tiere nach dem letzten UCMS-Verfahren 1 Tag lang in ihren Heimkäfigen bleiben, bevor Sie sie für den Vernetzungstest verwenden, um akute Stresseffekte auf die Rezeptorexpression zu vermeiden.

2. Vorbereitung der Stammlösungen

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor und lagern Sie sie gemäß den Anweisungen vor dem Assay.
   1. Bereiten Sie 5 M NaCl vor, indem Sie 14,6 g NaCl in 40 ml deionisiertem Wasser auflösen. Bei Raumtemperatur (RT) lagern.
   2. Bereiten Sie 1,08 M KCl zu, indem Sie 3,22 g KCl in 40 ml deionisiertem Wasser auflösen. Bei RT speichern.
   3. 400 mM MgCl2 werden hergestellt, indem 3,25 g MgCl2,6H2O in 40 ml deionisiertem Wasser aufgelöst werden. Bei RT speichern.
   4. Bereiten Sie 1 M Glycin vor, indem Sie 3 g Glycin in 40 ml deionisiertem Wasser auflösen, und lagern Sie es bei 4 °C.
   5. 1 M Dithiothreitol (DTT) wird hergestellt, indem 1,54 g DTT in 10 ml deionisiertem Wasser aufgelöst werden. Filtern Sie es durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,2 μm und aliquotieren Sie es in 2-ml-Röhrchen. Bei −20 °C lagern.
   6. Stellen Sie 10% Nonidet-P40 (NP-40) her, indem Sie es im Verhältnis 1:10 (v/v) in deionisiertem Wasser verdünnen. Bei RT speichern.
   7. 0,5 M EDTA (pH = 8,0) vorbereiten und bei RT lagern.
   8. 1 M HEPES-Puffer (pH = 7,2-7,5) vorbereiten und bei 4 °C lagern.
   9. Bereiten Sie 2,5 M oder 45 % (w/v) Glukose vor und lagern Sie sie bei 4 °C.

3. Vorbereitung des Arbeitsplatzes

1. Sammeln Sie am Tag des BS3-Vernetzungstests die folgenden Materialien im Tiersezierraum (Abbildung 1), wobei mehrere Gegenstände auf Eis vorgekühlt sind: ein Eiskübel, ein Metalltemperaturblock (auf Eis vorgekühlt), eiskaltes PBS in einem konischen 50-ml-Röhrchen und gefrorenes PBS in einer Petrischale, mit PBS angefeuchtetes Filterpapier auf eine gekühlte ebene Oberfläche oder blaues Eis, eine Gehirnmatrix (1 mm Abstand zum Einführen der Rasierklinge), die auf Eis vorgekühlt ist, Rasierklingen (~10), die auf Eis vorgekühlt sind, Sezierwerkzeuge (Schere, Pinzette, eine gebogene Sonde), eine Taschentuchstanze, 70%iges Ethanol-Sprühwischpapier und Papiertücher, Pipettenspitzen (200 μl), eine Pipette (P200), eine Stoppuhr, ein Notizblock, ein Stift und Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml).
   1. Beschriften Sie die Mikrozentrifugenröhrchen vor dem Assay mit den Probeninformationen (z. B. Tier-ID-Nummer, Behandlungstyp [UCMS versus No Stress (NS)], Gehirnregion, mit oder ohne BS3 usw.).
      HINWEIS: Für die BS3-Vernetzungsassays müssen zwei Proben aus jeder Hirnregion entnommen werden. Eine Probe wird für die Vernetzung (mit BS3) und die andere für die nicht-vernetzende Reaktion (ohne BS3) als Kontrolle verwendet. Um Proben aus zwei Hirnregionen (d. h. dem präfrontalen Kortex [PFC] und dem Hippocampus [HPC]) von 12 Mäusen zu entnehmen, beschriften Sie daher 48 Röhrchen für die erste Probenahme (= 2 Proben × 2 Regionen × 12 Mäusen) (zu verwenden in Abschnitt 6). Beschriften Sie zwei weitere Sätze von 48 Röhrchen für die spätere Lagerung (für die Lagerung von zwei verschiedenen Volumina [100 μl, 300 μl] jeder Probe) (in Abschnitt 7 zu verwenden). Somit ist es erforderlich, für diese Kohortengröße insgesamt 144 Röhrchen zu kennzeichnen.
2. Stellen Sie außerdem sicher, dass im Labor die folgenden Geräte vorhanden sind: eine gekühlte Tischmikrozentrifuge, ein Ultraschallgerät, ein Röhrchenrotator (für den Einsatz im Kühlraum oder im Kühlschrank [4 °C]), ein Gefrierschrank (−80 °C) für die Lagerung von Proben und ein Eimer Trockeneis für die vorübergehende Lagerung der Proben (in Abschnitt 7 zu verwenden)

4. Vorbereitung der Arbeitslösungen und Puffer

HINWEIS: Bereiten Sie am Morgen des Assays die folgenden Lösungen vor. Diese Berechnung basiert auf den notwendigen Lösungen, um zwei Gehirnregionen (d.h. PFC und HPC) von 12 Mäusen zu verarbeiten.

1. Bereiten Sie künstlichen Liquor cerebrospinalis (aCSF, pH = 7,4) wie in Tabelle 1 beschrieben vor. Geben Sie 750 μl aCSF in jedes Probenahmeröhrchen (die 48 Röhrchen, die in Schritt 3.1.1 beschriftet sind) und legen Sie sie in den Metalltemperaturblock auf Eis, um den Puffer vorzukühlen.
2. Bereiten Sie den Lysepuffer wie in Tabelle 2 beschrieben vor. Auf Eis lagern (400 μl pro Probe).
3. Bereiten Sie eine 52 mM BS3-Stammlösung (26x) in 5 mM Natriumcitratpuffer (pH = 5,0) vor.
   1. Bereiten Sie zunächst 100 mM Zitronensäure (Brühe A) und 100 mM Natriumcitrat (Brühe B) vor.
   2. Brühe A und Brühe B im Verhältnis 1:20 mit deionisiertem Wasser verdünnen. Fügen Sie jeweils 100 μl auf 1,9 ml Wasser hinzu, um 5 mM Zitronensäure (Brühe C) bzw. 5 mM Natriumcitrat (Brühe D) herzustellen.
   3. Mischen Sie 410 μl Brühe C und 590 μl Brühe D, um einen 5 mM Natriumcitratpuffer (pH = 5,0) herzustellen (Lösung E, 1 ml).
   4. Bestätigen Sie den pH-Wert der Lösung E mit einem pH-Indikatorstreifen.
   5. 24 mg BS3 werden in 806,4 μl Lösung E gelöst, indem man 30 s lang wirbelt, um die BS3-Stammlösung herzustellen (26x).
   6. Bereiten Sie weitere 1 ml Lösung E zur Verwendung als Vehikelkontrolle für die nicht vernetzenden Proben vor.
      Anmerkungen: Bereiten Sie die BS3-Stammlösung vor, wenn alles andere fertig ist und das Experiment beginnt. Das BS3 sollte bis zur Verwendung getrocknet bei 4 °C gelagert werden. Nach der Rekonstitution bleibt BS3 nur noch ca. ≤3 h aktiv. Da der pH-Wert des 5 mM Natriumcitratpuffers (Lösung E) Berichten zufolge mit der Zeit ansteigt und eine beschleunigte BS3-Hydrolyse verursacht, wird empfohlen, Lösung E frisch aus den Stammlösungen A und B⁹ herzustellen. Aufgrund der begrenzten Löslichkeit von BS3 bei niedrigen Temperaturen wird das rekonstituierte BS3 bei RT aufbewahrt. Das rekonstituierte BS3 wird innerhalb von 3 Stunden verbraucht und das rekonstituierte BS3 nicht eingefroren/aufgetaut oder wiederverwendet.

5. Präparation von Hirngewebe

HINWEIS: Ab diesem Schritt sollten mindestens zwei Personen koordiniert zusammenarbeiten. Während sich eine Person auf die Sektion der Tiere konzentriert (Schritte 5.2-5.10 und Schritt 6.3), sollte die andere Person als Zeitnehmer fungieren und bei der Koordination des Assays helfen (Schritt 5.1, Schritt 6.1, Schritt 6.2, Schritt 6.4 und Schritt 6.5)

1. Bringen Sie das erste Tier zum Sezieren aus dem Stallbereich in den Sezierraum.
   HINWEIS: Da akute Stressoren (z. B. eine neue Umgebung, der Geruch von Blut) die Proteindynamik des Gehirns beeinträchtigen können, sollten die Tiere in ihren Käfigen fernab des Sezierbereichs gehalten und dann einzeln zur sofortigen Enthauptung in den Sezierraum gebracht werden.
2. Euthanasieren Sie die Maus durch Zervixluxation mit anschließender Enthauptung. Entfernen Sie das Gehirn schnell aus dem Schädel und tauchen Sie es für 10-15 s in eiskaltes PBS in eine Petrischale (Abbildung 2).
   HINWEIS: Die Tiere werden für BS3-Experimente nicht anästhesiert, da jedes Anästhetikum potenziell die Oberflächenpräsentation der Neurotransmitterrezeptoren^{beeinflussen könnte 9}.
3. Legen Sie das gekühlte Gehirn mit der ventralen Seite des Gehirns nach oben in die Gehirnmatrix auf Eis (Abbildung 3).
4. Führen Sie die erste Rasierklinge durch die Grenze zwischen dem Riechkolben und dem Riechstiel, um das Gehirn koronal zu schneiden (Abbildung 4). Schneiden Sie mit drei bis vier zusätzlichen Rasierklingen den vorderen Teil des Gehirns im Abstand von 1 mm nacheinander koronal durch.
5. Hebe die koronalen Schnitte von der Hirnmatrix ab, indem du alle eingesetzten Rasierklingen zusammenhältst und den hinteren Teil des Gehirns in der Hirnmatrix zurücklässt. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Rasierklingen voneinander zu trennen, und legen Sie sie mit dem Hirnschnitt nach oben auf die flache, gekühlte Oberfläche (Abbildung 5).
6. Identifizieren Sie die Slices, die den Interessenbereich enthalten. Wählen Sie für die Probenahme des PFC die zweite und dritte Scheibe hinter der ersten Scheibe, die den Riechstiel enthält.
7. Entfernen Sie die interessierende Region mit einem Gewebestanzer (Video 1), legen Sie sie auf die gekühlte Rasierklinge und teilen Sie das Gewebe gleichmäßig in zwei Teile (z. B. Gewebe von der linken oder rechten Hemisphäre, wobei eine Hälfte für die BS3-Vernetzungsreaktion und die andere Hälfte für die Nicht-Vernetzungskontrolle verwendet wird, wenn das Zielprotein von Interesse in beiden Hemisphären gleichmäßig exprimiert wird).
8. Zerkleinern Sie jedes Taschentuch auf der Rasierklinge mit der feinen Spitze der Pinzette mit mehreren vertikalen Bewegungen gegen die Klinge (Video 2), anstatt die Taschentücher zu zerdrücken oder zu zerkleinern. Dadurch wird die für BS3 zugängliche Oberfläche maximiert, ohne die Membranintegrität der Zellen stark zu beeinträchtigen. Unmittelbar nach dem Zerkleinern werden die zerkleinerten Gewebe in die entsprechenden Röhrchen umgefüllt (siehe Schritt 6.3).
9. Nehmen Sie zur Probenahme des HPC den hinteren Teil des Gehirns aus der Matrix und legen Sie das Gehirn mit der dorsalen Seite nach oben auf angefeuchtetes Filterpapier auf die gekühlte flache Oberfläche (Abbildung 6).
10. Untersuchen Sie mit einer gebogenen Sonde und einer Pinzette und nähern Sie sich von der dorsalen Seite (Video 3) die HPC (dorsale Hälfte, ventrale Hälfte oder beide) aus beiden Hemisphären (eine Hälfte für die BS3-Vernetzung und die andere Hälfte für die Kontrolle). Zerkleinern Sie jedes Gewebe wie in Schritt 5.8 und übertragen Sie das Gewebe in geeignete Röhrchen (siehe Schritt 6.3).
    Anmerkungen: Die gesamte Sezierzeit für jedes Tier sollte bei ~5 Minuten gehalten werden, damit die Versuchsbedingungen und -ergebnisse konsistent sind.

6. Vernetzungsreaktion

1. Bringen Sie das nächste Tier zur Sektion aus dem Stallbereich in den Sezierraum, wenn die Sektion des Gehirns der vorherigen Maus kurz vor dem Abschluss steht (Schritt 5.10).
2. Das auf Eis vorgekühlte Röhrchen (aus Schritt 4.1) mit 30 μl BS3-Lösung (26x) oder Vehikellösung E aufspießen, kurz bevor das zerkleinerte Gewebe bereit ist, in die entsprechenden Röhrchen überführt zu werden. Wechseln Sie die Pipettenspitzen zwischen den Röhrchen, um sicherzustellen, dass kein BS3 in den nicht vernetzenden Kontrollröhrchen verunreinigt ist.
3. Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe (aus Schritt 5.8 und Schritt 5.10) in die entsprechenden Röhrchen und beginnen Sie dann mit der Präparation des nächsten Tieres (Schritt 5.2)
4. Drehen Sie das Röhrchen um und mischen Sie es, um die Gewebestücke in kleinere Stücke zu zerlegen (Video 4), und beginnen Sie, die Proben auf dem Röhrchenrotator im Kühlraum 30 Minuten bis 2 Stunden lang zu inkubieren. Notieren Sie die Startzeit der BS3-Inkubation für jedes Röhrchen. Im Abschnitt "Diskussion" finden Sie Informationen zur optimalen Inkubationszeit.
5. Die Reaktion wird abgeschreckt, indem das Röhrchen mit 78 μl 1 M Glycin versetzt wird, und die Probe wird 10 min lang bei 4 °C mit konstanter Rotation inkubiert. Notieren Sie die Start- und Endzeit des Abschreckens für jedes Rohr. Unterstützen Sie die Person weiterhin, indem Sie sich auf die Sektion des Tieres konzentrieren, indem Sie das nächste Tier mitbringen (Schritt 6.1) und bei der Vernetzung helfen (Schritt 6.2).
   HINWEIS: Behandeln Sie jede Probe mit genau dem gleichen Timing für alle Proben. Wenn der Sezierraum weit vom Kühlraum entfernt ist, wird dringend empfohlen, eine dritte Person zu rekrutieren, die an der Probeninkubation und dem Abschrecken im Kühlraum teilnimmt.

7. Gewebelyse, Proteinpräparation und Western Blot

1. Nach 10 min Abschrecken (Schritt 6.5) werden die Proben bei 20.000 x g bei 4 °C für 2 min gedreht und der Überstand verworfen. Wenn eine dritte Person verfügbar ist, fahren Sie mit Schritt 7.2 fort. Andernfalls frieren Sie die Proben auf Trockeneis ein und pausieren Sie den Test hier, bis die Gehirndissektion (Abschnitt 5) und die Vernetzung (Abschnitt 6) für alle Tiere abgeschlossen sind.
2. Fügen Sie 400 μl eiskalten Lysepuffer pro Röhrchen hinzu.
3. Beschallen Sie die Proben fünfmal für 1 s mit Intervallen von 5 s dazwischen, während Sie die Proben auf Eis halten.
4. Schleudern Sie die Proben 2 Minuten lang bei 20.000 x g , um unlösliche Gewebetrümmer (Pellets) herauszuschleudern, und retten Sie den Überstand.
5. Verwenden Sie 5 μl des Überstandes zur Messung der Proteinkonzentration mit dem Bicinchoninsäure-Assay (BCA).
6. Teilen Sie den Rest des Überstands in zwei Röhrchen; Ein Röhrchen enthält 100 μl Überstand für den anschließenden Western Blot, das andere Röhrchen enthält den Rest (~300 μL) für die Langzeitlagerung bei −80 °C. Den Proben wird eine angemessene Menge 4x SDS-Probenpuffer (ergänzt mit β2-Mercaptoethanol) zugegeben und bei 70 °C für 10 min inkubiert.
7. Lassen Sie 10-20 μg Protein pro Well auf einem Acrylamid-Gel für die Elektrophorese (SDS-PAGE) laufen und übertragen Sie dann Proteine zur Western-Blot-Analyse auf die Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran.
8. Blockieren Sie die PVDF-Membran in 5 % (w/v) Magermilch, die in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 (TBS-T) gelöst ist, für 1 h bei RT.
9. Waschen Sie die Membran zweimal kurz mit TBS-T und inkubieren Sie sie mit dem in TBS-T verdünnten Primärantikörper über Nacht bei 4 °C.
10. Waschen Sie den Primärantikörper dreimal für jeweils 10 Minuten in TBS-T bei RT ab.
11. Inkubieren Sie die Membran mit Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörpern, die in TBS-T verdünnt sind, für 1 h bei RT.
12. Waschen Sie den Sekundärantikörper dreimal für jeweils 10 Minuten in TBS-T bei RT ab.
13. Inkubieren Sie die Membran in einem verbesserten Chemilumineszenz-Reagenz und detektieren Sie das Signal mit dem Gel-Dokumentationsgerät.

Ergebnisse

Um die Machbarkeit des BS3-Vernetzungsassays zur Bewertung des α5-GABA A R-Spiegels an der Oberfläche im PFC der Maus zu demonstrieren, ließen wir jeweils 10 μg BS3-vernetzte und unvernetzte Proteinproben auf SDS-PAGE laufen und analysierten die Proteine mittels Western Blot mit einem Anti-α5-GABA_AR-Antikörper (polyklonales Kaninchen) (Abbildung 7). Die nicht vernetzten Proteinproben ergaben die Gesamtmenge an α5-GABA AR bei ~55 kDa, während die BS3-v...

Diskussion

Obwohl die Auswirkungen von chronischem psychosozialem Stress auf Verhaltensweisen (d. h. Emotionalität und kognitive Defizite) und molekulare Veränderungen (d. h. reduzierte Expression von GABAergen Genen und damit einhergehende Defizite in der GABAergen Neurotransmission) gut dokumentiert sind¹⁰, müssen die Mechanismen, die diesen Defiziten zugrunde liegen, weiter untersucht werden. Insbesondere angesichts der kürzlich durchgeführten Studie, die zeigt, dass chronischer Stress das neuronale ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020
1 M HEPES	Gibco	15630080
10x TBS	Bio-Rad	1706435
2.5 M (45%, w/v) Glucose	Sigma	G8769
2-mercaptoethanol	Sigma	M3148
4x SDS sample buffer (Laemmli)	Bio-Rad	1610747
Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)	Pierce	A39266	No-Weigh Format; 10 x 2 mg
Brain matrix	Ted Pella	15003	For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
Curved probe	Fine Science Tools	10088-15	Gross Anatomy Probe; angled 45
Deionized water	milli-Q	EQ 7000	Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb]
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001
Filter paper (3MM)	Whatman	3030-917
Forceps (large)	Fine Science Tools	11152-10	Extra Fine Graefe Forceps
Forceps (small)	Fine Science Tools	11251-10	Dumont #5 Forceps
GABA-A R alpha 5 antibody	Invitrogen	PA5-31163	Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking
GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody	R&D Systems	PPS027	Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat
Glycine	Sigma	W328707
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Bio-Rad	1721019
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O)	Sigma	M2670
Nonidet-P40, substitute (NP-40)	SantaCruz	68412-54-4
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P9541
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340
PVDF membrane	Bio-Rad	1620177
Scissors (large)	Fine Science Tools	14007-14	Surgical Scissors - Serrated
Scissors (small)	Fine Science Tools	14060-09	Fine Scissors - Sharp
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S9888
Sonicator (Qsonica Sonicator Q55)	Qsonica	15338284
Table-top refregerated centrifuge	Eppendorf	5425R
Tissue punch (ID 1 mm)	Ted Pella	15110-10	Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm
Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer	Bio-Rad	10026938
Tube rotator (LabRoller)	Labnet	H5000