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要約

BS3化学架橋アッセイは、慢性心理社会的ストレス条件下でのマウス脳における細胞表面GABAA 受容体発現の減少を明らかにします。

要約

不安は、認知機能を含む動物の行動にさまざまに影響を与える感情の状態です。不安の行動徴候は動物界全体で観察され、広範囲のストレスモダリティに対する適応的または不適応的な反応として認識することができます。げっ歯類は、分子、細胞、および回路レベルでの不安の統合メカニズムに対処するトランスレーショナル研究のための実証済みの実験モデルを提供します。特に、慢性心理社会的ストレスパラダイムは、人間とげっ歯類に類似した不安/抑うつのような行動表現型を模倣する不適応反応を誘発します。以前の研究では、脳内の神経伝達物質の内容に対する慢性ストレスの有意な影響が示されていますが、神経伝達物質受容体レベルに対するストレスの影響は十分に研究されていません。本稿では、慢性ストレス下マウスの神経伝達物質受容体の神経表面レベルを定量する実験方法を、特に情動や認知の調節に関与するγ-アミノ酪酸(GABA)受容体に着目して紹介します。膜不透過性の不可逆化学架橋剤であるビススルホスクシンイミジルスベレート(BS3)を使用して、慢性ストレスが前頭前野におけるGABAA 受容体の表面利用可能性を大幅に下方制御することを示しています。GABAA 受容体のニューロン表面レベルは、GABA神経伝達の律速プロセスであるため、実験動物モデルにおける不安/抑うつ様表現型の程度の分子マーカーまたはプロキシとして使用できます。この架橋アプローチは、あらゆる脳領域で発現する神経伝達物質や神経調節物質の様々な受容体系に適用可能であり、情動や認知のメカニズムのより深い理解に貢献することが期待されます。

概要

神経伝達物質受容体は、神経細胞の原形質膜表面または細胞内の内膜(エンドソーム、小胞体[ER]、トランスゴルジ体など)に局在し、ニューロンの内因性生理学的状態に応じて、または外因性ニューラルネットワーク活動に応答して、これら2つのコンパートメント間を動的に往復します1,2.新たに分泌された神経伝達物質は、主に表面局在化した受容体のプールを介して生理学的機能を誘発するので、所与の神経伝達物質の表面受容体レベルは、神経回路内のそのシグナル伝達能力の重要な決定要因の1つである3。

培養ニューロンの表面受容体レベルをモニタリングするには、表面ビオチン化アッセイ4、非透過処理条件下での特異的抗体を用いた免疫蛍光アッセイ5、pH感受性蛍光光学指示薬(pHluorinなど)6と遺伝的に融合した受容体導入遺伝子の使用など、いくつかの方法があります。対照的に、これらのアプローチは、 インビボで表面受容体レベルを評価する場合、限定的であるか実用的ではありません。例えば、表面ビオチン化手順は、その比較的高い価格およびアビジン結合ビーズ上のビオチン化タンパク質を精製するために必要な後続のステップのために、in vivo 脳組織の大量およびサンプル数の処理には実用的ではないかもしれない。3次元脳構造に埋め込まれたニューロンの場合、抗体のアクセシビリティが低いか、顕微鏡ベースの定量が難しいため、 in vivoでの表面受容体レベルを評価する上で大きな制限が生じる可能性があります。無傷の脳における神経伝達物質受容体の分布を視覚化するために、陽電子放出断層撮影法などの非侵襲的方法を使用して、受容体占有率を測定し、表面受容体レベルを推定することができます7。ただし、このアプローチは、特定の放射性リガンド、高価な機器、および特別な専門知識の可用性に大きく依存しているため、ほとんどの研究者が日常的に使用することは困難になっています。

ここでは、水溶性で膜を透過しない化学架橋剤であるビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3)8,9を使用して、実験動物の脳の表面受容体レベルをex vivoで測定するための簡単で汎用性の高い方法について説明します。BS3はリジン残基の側鎖にある第一級アミンを標的とし、互いに近接したタンパク質を共有結合的に架橋することができます。脳スライスを関心のある領域から新たに調製し、BS3を含むバッファー中でインキュベートすると、細胞表面受容体は隣接するタンパク質と架橋され、したがって、より高分子量の種に変換されますが、細胞内膜内関連受容体は修飾されません。したがって、表面受容体プールと細胞内受容体プールは、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分離し、研究対象の受容体に特異的な抗体を用いたウェスタンブロットによって定量することができます。

予測不可能な慢性軽度ストレス(UCMS)は、げっ歯類に慢性心理社会的ストレスを誘発するための確立された実験パラダイムです10。UCMSは、GABAとその受容体を含む一連の神経伝達物質系の調節を介して、不安/抑うつのような行動表現型と認知障害を誘発します10,11。特に、α5サブユニット含有GABAA受容体(α5-GABAAR)は、記憶および認知機能の調節に関与しており12,13、UCMS誘発性認知障害におけるこのサブユニットの機能の変化の関与の可能性を示唆している。このプロトコルでは、BS3架橋アッセイを使用して、UCMSに曝露されたマウスの前頭前野における表面発現α5-GABAARのレベルを、非ストレス対照マウスと比較して定量しました。

プロトコル

このプロトコルのすべての動物作業は、オンタリオ州動物研究法(RSO 1990、第A.22章)およびカナダ動物管理評議会(CCAC)に従って完了し、施設動物管理委員会によって承認されました。

1.動物の準備

  1. 実験に使用する動物数を決定し、それらを適切なグループまたは実験コホートに分割します。グループのサイズ、性別、および統計的検出力の説明については、ディスカッションのセクションを参照してください。
    注:このプロトコルは、マウス(C57BL6 / J系統、生後2〜4か月、通常は体重20〜30 g、使用するオスとメスの同数)用にカスタマイズされています。
  2. 動物をUCMSまたは非ストレス条件下で5〜8週間制御し、前述のプロトコルに従います14。
  3. 最後のUCMS手順の後、受容体発現に対する急性ストレスの影響を避けるために、動物を架橋アッセイに使用する前に、動物を自宅のケージに1日間滞在させます。

2. 原液の調製

  1. アッセイ前の指示に従って、以下の溶液を調製して保管してください。
    1. 14.6 g の NaCl を 40 mL の脱イオン水に溶解して、5 M の NaCl を調製します。室温(RT)で保存してください。
    2. 3.22 g の KCl を 40 mL の脱イオン水に溶解して、1.08 M の KCl を調製します。RTで保存してください。
    3. 3.25gのMgCl2・6H2Oを40mLの脱イオン水に溶解することにより、400mMMgCl2を調製する。RTで保存してください。
    4. 3 gのグリシンを40 mLのイオン交換水に溶解して1 Mのグリシンを調製し、4°Cで保存します。
    5. 1.54 gのDTTを10 mLの脱イオン水に溶解して、1 Mのジチオスレイトール(DTT)を調製します。孔径0.2 μmのフィルターでろ過滅菌し、2 mLチューブに分注します。-20°Cで保存してください。
    6. 10%ノニデット-P40(NP-40)を脱イオン水で1:10(v / v)の比率で希釈して調製します。RTで保存してください。
    7. 0.5 M EDTA(pH = 8.0)を調製し、室温で保存します。
    8. 1 M HEPESバッファー(pH = 7.2-7.5)を調製し、4°Cで保存します。
    9. 2.5 Mまたは45%(w / v)グルコースを調製し、4°Cで保存します。

3.ワークステーションの準備

  1. BS3架橋アッセイの日に、次の材料を動物解剖室(図1)に集め、氷上で事前に冷却したいくつかのアイテム:アイスバケット、金属温度ブロック(氷上で事前に冷却)、50 mLの円錐管に氷冷したPBS、ペトリ皿に凍結したPBS、PBSで湿らせたろ紙を冷やした平らな表面または青い氷の上に置きます。 氷上で予め冷却した脳マトリックス(かみそりの刃の挿入に1mm間隔)、氷上で予め冷却したかみそりの刃(~10)、解剖器具(はさみ、鉗子、湾曲したプローブ)、ティッシュパンチ、70%エタノールスプレー拭き取り紙とペーパータオル、ピペットチップ(200μL)、ピペッター(P200)、ストップウォッチ、メモ帳、ペン、マイクロ遠心チューブ(1.5mL)。
    1. アッセイの前に、微量遠心チューブにサンプル情報(例えば、動物ID番号、治療タイプ[UCMS対ストレスなし(NS)]、脳領域、BS3の有無など)を標識します。
      注:BS3架橋アッセイでは、各脳領域から2つのサンプルを収集する必要があります。一方のサンプルは架橋(BS3を使用)に使用され、もう一方は非架橋反応(BS3なし)にコントロールとして使用されます。したがって、12匹のマウスにおける2つの脳領域(すなわち、前頭前野[PFC]および海馬[HPC])からサンプリングするために、初期サンプリング用に48本のチューブ(=12匹のマウス×2領域×2サンプル)を標識する(セクション6で使用する)。後で保管するために、追加の2セットの48チューブにラベルを付けます(各サンプルの2つの異なる容量[100 μL、300 μL]を保存するため)(セクション7で使用)。したがって、このコホートサイズに対して合計144本のチューブにラベルを付ける必要があります。
  2. さらに、実験室で次の機器が利用可能であることを確認してください:卓上冷蔵マイクロ遠心分離機、超音波破砕機、チューブ回転子(冷蔵室または冷蔵庫内[4°C]で使用される)、サンプルを保管するための冷凍庫(-80°C)、およびサンプルの一時保管用のドライアイスのバケツ(セクション7で使用)

4. 作業溶液とバッファーの調製

注:アッセイの朝に、以下の溶液を調製してください。この計算は、12匹のマウスからの2つの脳領域(すなわち、PFCおよびHPC)を処理するために必要な解に基づいている。

  1. 表1に記載の人工脳脊髄液(aCSF、pH = 7.4)を調製する。750 μLのaCSFを各サンプリングチューブ(ステップ3.1.1でラベル付けされた48本のチューブ)に分注し、氷上の金属温度ブロックに入れてバッファーを事前に冷却します。
  2. 表2に記載のように溶解バッファーを調製します。氷上で保存します(サンプルあたり400 μLを使用します)。
  3. 5 mM クエン酸ナトリウムバッファー(pH = 5.0)中の52 mM BS3ストック溶液(26x)を調製します。
    1. まず、100 mMクエン酸(原液A)と100 mMクエン酸ナトリウム(原液B)を用意する。
    2. ストックAとストックBを脱イオン水で1:20の比率で希釈します。1.9 mLの水にそれぞれ100 μLを加えて、それぞれ5 mMクエン酸(ストックC)と5 mMクエン酸ナトリウム(ストックD)を調製します。
    3. ストックC410 μLとストックD590 μLを混合して、5 mMクエン酸ナトリウムバッファー(pH = 5.0)を調製しました(溶液E、1 mL)。
    4. pH指示薬ストリップを使用して溶液EのpHを確認します。
    5. 24 mgのBS3を806.4 μLの溶液Eに30秒間ボルテックスして溶解し、BS3ストック溶液(26x)を調製します。
    6. 非架橋サンプルのビヒクルコントロールとして使用するために、さらに1 mLの溶液Eを調製します。
      注:他の準備が整い、実験が開始されようとしているときに、BS3ストック溶液を準備してください。BS3は、使用するまで4°Cで乾燥させて保管する必要があります。再構成されると、BS3は約≤3時間のみアクティブになります。5 mMクエン酸ナトリウム緩衝液(溶液E)のpHは経時的に上昇し、BS3加水分解が促進されることが報告されているため、溶液Eはストック溶液AおよびBから新鮮に調製することをお勧めします9。低温でのBS3の溶解度は限られているため、再構成されたBS3はRTで保持してください。 再構成されたBS3を3時間で使い切り、再構成されたBS3を凍結/解凍または再利用しないでください。

5.脳組織の解剖

注:このステップ以降、少なくとも2人が調整された方法で協力する必要があります。一人が動物の解剖に焦点を当てている間(ステップ5.2-5.10およびステップ6.3)、もう一人はタイムキーパーとして働き、アッセイの調整を支援する必要があります(ステップ5.1、ステップ6.1、ステップ6.2、ステップ6.4、およびステップ6.5)

  1. 解剖のために最初の動物を住居エリアから解剖室に連れて行きます。
    注:急性ストレッサー(例:.、新しい環境、血液の臭い)が脳タンパク質のダイナミクスに影響を与える可能性があるため、動物は解剖エリアから離れた自宅のケージに保管し、解剖室に個別に持ち込んですぐに斬首する必要があります。
  2. 頸部脱臼とそれに続く断頭によってマウスを安楽死させる。脳を頭蓋骨から急速に取り出し、ペトリ皿の氷冷PBSに10〜15秒間沈めます(図2)。
    注:麻酔薬は神経伝達物質受容体の表面提示レベルに影響を与える可能性があるため、動物はBS3実験のために麻酔されていません9。
  3. 冷やした脳を氷の上の脳マトリックスに入れ、脳の腹側を上に向けてください(図3)。
  4. 最初のかみそりの刃を嗅球と嗅花柄の境界に挿入して、脳を冠状に切断します(図4)。3〜4枚の追加のかみそりの刃を使用して、脳の前部を1mm間隔で冠状に連続的に切断します。
  5. 挿入されたすべてのかみそりの刃を一緒に保持し、脳の後部を脳マトリックスの後ろに残して、冠状スライスを脳マトリックスから持ち上げます。鉗子を使用してかみそりの刃を互いに分離し、脳スライスを上に向けて平らで冷やした表面に置きます(図5)。
  6. 対象領域を含むスライスを特定します。PFCをサンプリングするには、嗅柄を含む最初のスライスの後方の2番目と3番目のスライスを選択します。
  7. ティッシュパンチを使用して関心領域を除去し(ビデオ1)、冷やしたカミソリの刃の上に置き、組織を2つに均等に分割します(たとえば、左半球と右半球の組織で、半分はBS3架橋反応に使用し、残りの半分は、目的の標的タンパク質が両方の半球で等しく発現している場合は、架橋なしの制御に使用されます)。
  8. 組織をすりつぶしたり粉砕したりする代わりに、鉗子の細い先端を使用して、ブレードに対して複数の垂直方向の動き(ビデオ2)を使用して、各組織をかみそりの刃で細かく刻みます。これにより、細胞の膜の完全性を著しく損なうことなく、BS3がアクセスできる表面積が最大化されます。ミンチの直後に、ミンチした組織を適切なチューブに移します(ステップ6.3を参照)。
  9. HPCをサンプリングするには、脳の後部をマトリックスから取り出し、背側を上に向けて、冷やした平らな面の湿らせたろ紙の上に脳を置きます(図6)。
  10. 湾曲したプローブと鉗子を使用し、背側からアプローチし(ビデオ3)、両方の半球(BS3架橋用の半分とコントロール用の残りの半分)からHPC(背側半分、腹側半分、またはその両方)を解剖します。ステップ5.8のように各組織を細かく刻み、組織を適切なチューブに移します(ステップ6.3を参照)。
    注:実験条件と結果の一貫性を保つために、各動物の解剖時間全体を~5分に保つ必要があります。

6.架橋反応

  1. 前のマウスの脳の解剖が終わりに近づいたら、次の解剖動物を収容場所から解剖室に連れて行きます(ステップ5.10)。
  2. 細切した組織を適切なチューブに移す準備ができる直前に、氷上で事前に冷却したチューブに30 μLのBS3溶液(26x)またはビヒクル溶液Eをスパイクします(ステップ4.1から)。チューブ間のピペットチップを交換して、架橋のないコントロールチューブにBS3が汚染されていないことを確認します。
  3. 細かく刻んだ組織(ステップ5.8およびステップ5.10)を適切なチューブに移し、次の動物の解剖を開始します(ステップ5.2)
  4. チューブを反転させて混合し、組織の塊を細かく砕き(ビデオ4)、冷蔵室のチューブローテーターでサンプルを30分から2時間インキュベートし始めます。各チューブのBS3インキュベーションの開始時間を記録します。最適なインキュベーション時間については、ディスカッションセクションを参照してください。
  5. チューブに78 μLの1 Mグリシンを加えて反応を停止し、さらにサンプルを一定の回転で4°Cで10分間インキュベートします。各チューブの焼入れの開始時間と終了時間を記録します。次の動物を連れてきて(ステップ6.1)、架橋を手伝う(ステップ6.2)ことによって、動物の解剖に焦点を合わせている人を助け続けます。
    注意: すべてのサンプルでまったく同じタイミングで各サンプルを処理します。解剖室が冷蔵室から遠く離れている場合は、冷蔵室でのサンプルインキュベーションとクエンチに参加する第三者を募集することを強くお勧めします。

7.組織溶解、タンパク質調製、およびウェスタンブロット

  1. 10分間のクエンチ(ステップ6.5)後、サンプルを20,000 x g で4°Cで2分間回転させ、上清を廃棄します。第三者が対応可能な場合は、手順 7.2 に進みます。それ以外の場合は、ドライアイス上でサンプルを急速凍結し、すべての動物の脳解剖(セクション5)と架橋(セクション6)が完了するまでここでアッセイを一時停止します。
  2. チューブあたり400 μLの氷冷溶解バッファーを追加します。
  3. サンプルを氷上に保ちながら、間に5秒間隔で1秒間5回サンプルを超音波処理します。
  4. サンプルを20,000 x g で2分間回転させて不溶性組織破片(ペレット)をスピンアウトし、上清を保存します。
  5. ビシンコニン酸(BCA)アッセイを用いてタンパク質濃度を測定するために5 μLの上清を使用します。
  6. 残りの上清を2つのチューブに分割します。一方のチューブには、後続のウェスタンブロット用の上清が100 μL含まれており、もう一方のチューブには、-80 °Cでの長期保存用の残り(~300 μL)が含まれています。 適量の4x SDSサンプルバッファー(β2-メルカプトエタノールを添加したもの)をサンプルに加え、70°Cで10分間インキュベートします。
  7. 電気泳動用アクリルアミドゲル(SDS-PAGE)でウェルあたり10〜20 μgのタンパク質を流し、ウェスタンブロット分析のためにタンパク質をポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに移します。
  8. 0.1%Tween-20(TBS-T)を含むトリス緩衝生理食塩水に溶解した5%(w / v)スキムミルクでPVDFメンブレンをRTで1時間ブロックします。
  9. メンブレンをTBS-Tで2回短時間洗浄し、TBS-Tで希釈した一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートします。
  10. 一次抗体をRTでTBS-Tで10分間ずつ3回洗い流します。
  11. TBS-Tで希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体でメンブレンをRTで1時間インキュベートします。
  12. 二次抗体をRTのTBS-Tでそれぞれ10分間3回洗い流します。
  13. 増強化学発光試薬中でメンブレンをインキュベートし、ゲルドキュメンテーション装置を用いてシグナルを検出します。

結果

マウスPFCの表面α5-GABA A Rレベルを評価するためのBS3架橋アッセイの実現可能性を実証するために、SDS-PAGE上でBS3架橋タンパク質サンプルと非架橋タンパク質サンプルをそれぞれ10 μg実行し、抗α5-GABAAR抗体(ウサギポリクローナル)を用いたウェスタンブロットでタンパク質を分析しました(図7)。非架橋タンパク質サンプルは~55 kDaでの総量のα5-GABAA ...

ディスカッション

慢性的な心理社会的ストレスが行動(すなわち、感情および認知障害)および分子変化(すなわち、GABA作動性遺伝子の発現低下およびそれに伴うGABA作動性神経伝達の欠損)に与える影響は十分に文書化されているが10、そのような欠陥の根底にあるメカニズムはさらなる調査が必要である。特に、慢性ストレスが小胞体機能の過負荷、ひいては小胞体ストレスの上昇を通じてニ?...

開示事項

著者らは利益相反を報告していない。

謝辞

著者らは、研究期間中にわたって動物の世話をしてくれたCAMH動物施設のスタッフに感謝しています。この研究は、カナダ健康研究所(CIHRプロジェクト助成金#470458からT.T.へ)、CAMHからのディスカバリー基金(T.P.へ)、統合失調症とうつ病に関する研究のための全国同盟(ESへのNARSAD賞#25637)、およびキャンベルファミリーメンタルヘルス研究所(ESへ)。E.S.は、新規GABA作動性化合物を臨床に持ち込むことに専念するバイオ医薬品であるダモナファーマシューティカルズの創設者です。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020
1 M HEPESGibco15630080
10x TBSBio-Rad1706435
2.5 M (45%, w/v) GlucoseSigmaG8769
2-mercaptoethanolSigmaM3148
4x SDS sample buffer (Laemmli)Bio-Rad1610747
Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)PierceA39266No-Weigh Format; 10 x 2 mg
Brain matrixTed Pella15003For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm
Calcium chloride (CaCl2)SigmaC4901
Curved probeFine Science Tools10088-15Gross Anatomy Probe; angled 45
Deionized watermilli-QEQ 7000Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] 
Dithiothreitol (DTT)Sigma10197777001
Filter paper (3MM)Whatman3030-917
Forceps (large)Fine Science Tools11152-10Extra Fine Graefe Forceps
Forceps (small)Fine Science Tools11251-10Dumont #5 Forceps
GABA-A R alpha 5 antibodyInvitrogenPA5-31163Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking
GABA-A R alpha 5 C-terminus antibodyR&D SystemsPPS027Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat
GlycineSigmaW328707
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)Bio-Rad1721019
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O)SigmaM2670
Nonidet-P40, substitute (NP-40)SantaCruz68412-54-4
Potassium chloride (KCl)SigmaP9541
Protease inhibitor cocktailSigmaP8340
PVDF membraneBio-Rad1620177
Scissors (large)Fine Science Tools14007-14Surgical Scissors - Serrated
Scissors (small)Fine Science Tools14060-09Fine Scissors - Sharp
Sodium chloride (NaCl)SigmaS9888
Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) Qsonica15338284
Table-top refregerated centrifugeEppendorf5425R
Tissue punch (ID 1 mm)Ted Pella15110-10Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm
Trans-Blot Turbo 5x Transfer bufferBio-Rad10026938
Tube rotator (LabRoller)LabnetH5000

参考文献

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