BS3 Chemical Crosslinking Assay: valutazione dell'effetto dello stress cronico sulla superficie cellulare Presentazione del recettore GABAA nel cervello dei roditori

Riepilogo

Il test di reticolazione chimica BS3 rivela una ridotta espressione_{del recettore} GABA A della superficie cellulare nel cervello dei topi in condizioni di stress psicosociale cronico.

Abstract

L'ansia è uno stato di emozione che influenza in modo variabile i comportamenti degli animali, comprese le funzioni cognitive. I segni comportamentali di ansia sono osservati in tutto il regno animale e possono essere riconosciuti come risposte adattive o disadattive a una vasta gamma di modalità di stress. I roditori forniscono un modello sperimentale collaudato per gli studi traslazionali che affrontano i meccanismi integrativi dell'ansia a livello molecolare, cellulare e circuitale. In particolare, il paradigma dello stress psicosociale cronico suscita risposte disadattive che imitano fenotipi comportamentali ansiosi / depressivi che sono analoghi tra esseri umani e roditori. Mentre studi precedenti mostrano effetti significativi dello stress cronico sul contenuto dei neurotrasmettitori nel cervello, l'effetto dello stress sui livelli del recettore dei neurotrasmettitori è poco studiato. In questo articolo, presentiamo un metodo sperimentale per quantificare i livelli di superficie neuronale dei recettori dei neurotrasmettitori nei topi sottoposti a stress cronico, concentrandoci in particolare sui recettori dell'acido gamma-aminobutirrico (GABA), che sono implicati nella regolazione delle emozioni e della cognizione. Utilizzando il reticolante chimico irreversibile impermeabile alla membrana, bissulfosuccinimidil suberato (BS3), dimostriamo che lo stress cronico riduce significativamente la disponibilità superficiale dei recettori GABA_A nella corteccia prefrontale. I livelli di superficie neuronale dei recettori GABA_A sono il processo limitante per la neurotrasmissione GABA e potrebbero, quindi, essere utilizzati come marcatore molecolare o proxy del grado di fenotipi ansiosi / depressivi in modelli animali sperimentali. Questo approccio di crosslinking è applicabile a una varietà di sistemi recettoriali per neurotrasmettitori o neuromodulatori espressi in qualsiasi regione del cervello e ci si aspetta che contribuisca a una comprensione più profonda dei meccanismi alla base delle emozioni e della cognizione.

Introduzione

I recettori dei neurotrasmettitori sono localizzati sulla superficie della membrana plasmatica neuronale o intracellulare sulle endomembrane (ad esempio, l'endosoma, il reticolo endoplasmatico [ER], o l'apparato trans-Golgi) e fanno la spola dinamica tra questi due compartimenti a seconda degli stati fisiologici intrinseci nei neuroni o in risposta alle attività estrinseche della rete neurale ^1,2. Poiché i neurotrasmettitori appena secreti suscitano le loro funzioni fisiologiche principalmente attraverso il pool di recettori localizzato in superficie, i livelli di recettori di superficie per un dato neurotrasmettitore sono uno dei determinanti critici della sua capacità di segnalazione all'interno del circuito neurale³.

Sono disponibili diversi metodi per monitorare i livelli dei recettori di superficie nei neuroni in coltura, tra cui il saggio di biotinilazione superficiale⁴, il saggio di immunofluorescenza con un anticorpo specifico in condizioni non permeabilizzate⁵ o l'uso di un transgene recettore geneticamente fuso con un indicatore ottico fluorescente sensibile al pH (ad esempio, pHluorin)⁶. Al contrario, questi approcci sono limitati o poco pratici quando si valutano i livelli dei recettori di superficie in vivo. Ad esempio, la procedura di biotinilazione superficiale potrebbe non essere pratica per il trattamento di grandi quantità e numeri di campioni di tessuti cerebrali in vivo a causa del suo prezzo relativamente elevato e delle successive fasi necessarie per purificare le proteine biotinilate su perle coniugate con avidina. Per i neuroni incorporati nell'architettura cerebrale tridimensionale, la bassa accessibilità agli anticorpi o le difficoltà nella quantificazione basata sul microscopio possono rappresentare una limitazione significativa per valutare i livelli dei recettori di superficie in vivo. Per visualizzare la distribuzione dei recettori dei neurotrasmettitori nel cervello intatto, metodi non invasivi, come la tomografia ad emissione di positroni, potrebbero essere utilizzati per misurare l'occupazione dei recettori e stimare^{i livelli 7} del recettore di superficie. Tuttavia, questo approccio si basa in modo critico sulla disponibilità di leganti radio specifici, apparecchiature costose e competenze speciali, rendendolo meno accessibile per l'uso di routine da parte della maggior parte dei ricercatori.

Qui, descriviamo un metodo semplice e versatile per misurare i livelli di recettori di superficie in cervelli animali sperimentali ex vivo utilizzando un reticolante chimico solubile in acqua e impermeabile alla membrana, bis(sulfosuccinimidil)suberato (BS3)^8,9. BS3 prende di mira le ammine primarie nella catena laterale dei residui di lisina e può reticolare covalentemente le proteine in prossimità l'una dell'altra. Quando le fette di cervello sono appena preparate da una regione di interesse e incubate in un tampone contenente BS3, i recettori della superficie cellulare sono reticolati con le proteine vicine e, quindi, si trasformano in specie ad alto peso molecolare, mentre i recettori associati all'endomembrana intracellulare rimangono invariati. Pertanto, i pool di recettori di superficie e intracellulari possono essere separati mediante elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) e quantificati mediante western blot utilizzando anticorpi specifici per il recettore da studiare.

Lo stress cronico lieve imprevedibile (UCMS) è un paradigma sperimentale ben consolidato per indurre stress psicosociale cronico nei roditori¹⁰. UCMS suscita fenotipi comportamentali ansiosi / depressivi e deficit cognitivi attraverso la modulazione di una serie di sistemi di neurotrasmettitori, tra cui GABA e i suoi recettori^10,11. In particolare, il recettore GABA A contenente subunità α5 (α5-GABA_AR) è implicato nella regolazione della memoria e delle funzioni cognitive^12,13, suggerendo il possibile coinvolgimento di funzioni alterate di questa subunità nei deficit cognitivi indotti da UCMS. In questo protocollo, abbiamo utilizzato il test di crosslinking BS3 per quantificare i livelli di α5-GABA_AR espressi in superficie nella corteccia prefrontale dei topi esposti a UCMS rispetto ai topi di controllo non stressati.

Protocollo

Tutto il lavoro sugli animali in questo protocollo è stato completato in conformità con l'Ontario Animals for Research Act (RSO 1990, capitolo A.22) e il Canadian Council on Animal Care (CCAC) ed è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura degli animali.

1. Preparazione degli animali

1. Determinare il numero di animali da utilizzare negli esperimenti e dividerli in gruppi appropriati o coorti sperimentali. Vedi la sezione di discussione per una discussione sulle dimensioni del gruppo, il sesso e il potere statistico.
   NOTA: Questo protocollo è personalizzato per i topi (ceppo C57BL6/J; 2-4 mesi di età; tipicamente 20-30 g di peso corporeo; numero equivalente di maschi e femmine da utilizzare).
2. Porre gli animali sotto UCMS o controllare condizioni non stressate per 5-8 settimane, seguendo il protocollo come descritto in precedenza¹⁴.
3. Dopo l'ultima procedura UCMS, consentire agli animali di rimanere nelle loro gabbie domestiche per 1 giorno prima di utilizzarli per il test di reticolazione per evitare effetti di stress acuto sull'espressione del recettore.

2. Preparazione delle soluzioni stock

1. Preparare e conservare le seguenti soluzioni come indicato prima del test.
   1. Preparare 5 M NaCl sciogliendo 14,6 g di NaCl in 40 ml di acqua deionizzata. Conservare a temperatura ambiente (RT).
   2. Preparare 1,08 M KCl sciogliendo 3,22 g di KCl in 40 ml di acqua deionizzata. Negozio su RT.
   3. Preparare 400 mM MgCl 2 sciogliendo 3,25 g di MgCl 2·6H ₂ O in 40 mL di acqua deionizzata. Negozio su RT.
   4. Preparare 1 M di glicina sciogliendo 3 g di glicina in 40 ml di acqua deionizzata e conservare a 4 °C.
   5. Preparare 1 M ditiotreitolo (DTT) sciogliendo 1,54 g di DTT in 10 mL di acqua deionizzata. Filtrare-sterilizzarlo attraverso un filtro con una dimensione dei pori di 0,2 μm e aliquote in tubi da 2 ml. Conservare a -20 °C.
   6. Preparare il 10% di Nonidet-P40 (NP-40) diluendolo in un rapporto di 1:10 (v / v) in acqua deionizzata. Negozio su RT.
   7. Preparare 0,5 M EDTA (pH = 8,0) e conservare a RT.
   8. Preparare 1 M tampone HEPES (pH = 7,2-7,5) e conservare a 4 °C.
   9. Preparare 2,5 M o 45% (p/v) di glucosio e conservare a 4 °C.

3. Preparazione della postazione di lavoro

1. Il giorno del test di reticolazione BS3, raccogliere i seguenti materiali nella sala di dissezione animale (Figura 1), con diversi oggetti pre-raffreddati su ghiaccio: un secchiello per il ghiaccio, un blocco di temperatura metallica (pre-raffreddato su ghiaccio), PBS ghiacciato in un tubo conico da 50 ml e PBS congelato in una capsula di Petri, carta da filtro inumidita con PBS e posta su una superficie piana refrigerata o ghiaccio blu, una matrice cerebrale (intervallo di 1 mm per l'inserimento della lama di rasoio) pre-raffreddata su ghiaccio, lamette da barba (~10) pre-raffreddata su ghiaccio, strumenti di dissezione (forbici, pinze, una sonda curva), un punzone di tessuto, carta spray al 70% di etanolo e asciugamani di carta, punte di pipetta (200 μL), un pipettor (P200), un cronometro, un blocco appunti, una penna e tubi per microcentrifuga (1,5 ml).
   1. Prima del test, etichettare le provette della microcentrifuga con le informazioni del campione (ad esempio, numero ID animale, tipo di trattamento [UCMS versus no stress (NS)], regione del cervello, con o senza BS3, ecc.).
      NOTA: Per i saggi di reticolazione BS3, devono essere raccolti due campioni da ciascuna regione del cervello; un campione sarà utilizzato per la reticolazione (con BS3) e l'altro per la reazione di non reticolazione (senza BS3) come controllo. Pertanto, per campionare da due regioni del cervello (cioè la corteccia prefrontale [PFC] e l'ippocampo [HPC]) in 12 topi, etichettare 48 provette per il campionamento iniziale (= 2 campioni × 2 regioni × 12 topi) (da utilizzare nella sezione 6). Etichettare altre due serie di 48 provette per la successiva conservazione (per conservare due volumi diversi [100 μL, 300 μL] di ciascun campione) (da utilizzare nella sezione 7). Pertanto, è necessario etichettare 144 tubi in totale per questa dimensione di coorte.
2. Inoltre, assicurarsi che le seguenti apparecchiature siano disponibili in laboratorio: una microcentrifuga refrigerata da tavolo, un sonicatore, un rotatore a tubi (da utilizzare nella cella frigorifera o all'interno del frigorifero [4 °C]), un congelatore (-80 °C) per la conservazione dei campioni e un secchio di ghiaccio secco per la conservazione temporanea dei campioni (da utilizzare nella sezione 7)

4. Preparazione delle soluzioni di lavoro e dei tamponi

NOTA: La mattina del test, preparare le seguenti soluzioni. Questo calcolo si basa sulle soluzioni necessarie per elaborare due regioni del cervello (cioè PFC e HPC) da 12 topi.

1. Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF, pH = 7,4) come indicato nella Tabella 1. Erogare 750 μL di aCSF in ciascuna provetta di campionamento (le 48 provette etichettate al punto 3.1.1) e metterle nel blocco di temperatura metallica su ghiaccio per pre-raffreddare il tampone.
2. Preparare il tampone di lisi come indicato nella tabella 2. Conservare su ghiaccio (400 μL da utilizzare per campione).
3. Preparare una soluzione madre di 52 mM BS3 (26x) in tampone citrato di sodio da 5 mM (pH = 5,0).
   1. In primo luogo, preparare 100 mM di acido citrico (stock A) e 100 mM di citrato di sodio (stock B).
   2. Diluire il brodo A e il brodo B in rapporto a 1:20 con acqua deionizzata. Aggiungere 100 μL ciascuno a 1,9 ml di acqua per preparare rispettivamente 5 mM di acido citrico (stock C) e 5 mM di citrato di sodio (stock D).
   3. Mescolare 410 μL di stock C e 590 μL di stock D per preparare un tampone citrato di sodio da 5 mM (pH = 5,0) (soluzione E, 1 mL).
   4. Confermare il pH della soluzione E utilizzando una striscia indicatrice di pH.
   5. Sciogliere 24 mg di BS3 in 806,4 μL di soluzione E mediante vortice per 30 s per preparare la soluzione madre di BS3 (26x).
   6. Preparare un altro 1 mL di soluzione E da utilizzare come controllo del veicolo per i campioni non reticolanti.
      NOTA: preparare la soluzione madre BS3 quando tutto il resto è pronto e l'esperimento sta per iniziare. Il BS3 deve essere conservato essiccato a 4 °C fino all'uso. Una volta ricostituito, BS3 rimane attivo solo per circa ≤3 ore. Poiché il pH del tampone citrato di sodio da 5 mM (soluzione E) aumenta nel tempo, causando un'idrolisi accelerata di BS3, si raccomanda di preparare la soluzione E fresca dalle soluzioni madre A e B⁹. A causa della limitata solubilità di BS3 a basse temperature, mantenere il BS3 ricostituito a RT. Utilizzare il BS3 ricostituito in 3 ore e non congelare/scongelare o riutilizzare il BS3 ricostituito.

5. Dissezione dei tessuti cerebrali

NOTA: Da questo passaggio in poi, almeno due persone dovrebbero lavorare insieme in modo coordinato. Mentre una persona si concentra sulla dissezione animale (passi 5.2-5.10 e step 6.3), l'altra persona dovrebbe lavorare come cronometrista e aiutare a coordinare il test (step 5.1, step 6.1, step 6.2, step 6.4 e step 6.5)

1. Porta il primo animale per la dissezione dall'area abitativa alla stanza di dissezione.
   NOTA: Poiché i fattori di stress acuti (ad esempio, un nuovo ambiente, l'odore del sangue) possono influenzare la dinamica delle proteine cerebrali, gli animali dovrebbero essere tenuti nelle loro gabbie domestiche poste lontano dall'area di dissezione e quindi essere portati individualmente nella stanza di dissezione per la decapitazione immediata.
2. Eutanasia del topo per dislocazione cervicale seguita da decapitazione. Rimuovere rapidamente il cervello dal cranio e immergerlo in PBS ghiacciato in una capsula di Petri per 10-15 s (Figura 2).
   NOTA: Gli animali non sono anestetizzati per gli esperimenti BS3 poiché qualsiasi agente anestetico potrebbe potenzialmente influenzare il livello di presentazione superficiale dei recettori dei neurotrasmettitori⁹.
3. Posizionare il cervello raffreddato nella matrice cerebrale sul ghiaccio, con il lato ventrale del cervello rivolto verso l'alto (Figura 3).
4. Inserire la prima lama di rasoio attraverso il bordo tra il bulbo olfattivo e il peduncolo olfattivo per tagliare il cervello coronalmente (Figura 4). Utilizzando tre o quattro lamette da barba aggiuntive, tagliare in serie la parte anteriore del cervello coronalmente con intervalli di 1 mm.
5. Sollevare le fette coronali dalla matrice cerebrale tenendo insieme tutte le lamette inserite, lasciando la parte posteriore del cervello nella matrice cerebrale. Utilizzare una pinza per separare le lamette l'una dall'altra e posizionarle sulla superficie piana e fredda con la fetta di cervello rivolta verso l'alto (Figura 5).
6. Identificare le sezioni contenenti la regione di interesse. Per il campionamento del PFC, scegliere la seconda e la terza fetta posteriore alla prima fetta contenente il peduncolo olfattivo.
7. Rimuovere la regione di interesse usando un punzone tissutale (Video 1), metterla da parte sulla lama di rasoio refrigerata e dividere uniformemente il tessuto in due (ad esempio, tessuti dell'emisfero sinistro rispetto a quello destro, con una metà da utilizzare per la reazione di reticolazione BS3 e l'altra metà per il controllo di non reticolazione se la proteina bersaglio di interesse è ugualmente espressa in entrambi gli emisferi).
8. Tritare ogni tessuto in pezzi sulla lama del rasoio usando la punta sottile della pinza con più movimenti verticali contro la lama (Video 2) invece di schiacciare o macinare i tessuti. Ciò massimizzerà la superficie accessibile a BS3 senza compromettere gravemente l'integrità della membrana delle cellule. Immediatamente dopo la tritatura, trasferire i tessuti tritati nelle provette appropriate (vedere punto 6.3).
9. Per il campionamento dell'HPC, estrarre la parte posteriore del cervello dalla matrice e posizionare il cervello su carta da filtro inumidita sulla superficie piana refrigerata, con il lato dorsale rivolto verso l'alto (Figura 6).
10. Utilizzando una sonda curva e una pinza, e avvicinandosi dal lato dorsale (Video 3), sezionare l'HPC (metà dorsale, metà ventrale o entrambi) da entrambi gli emisferi (una metà per la reticolazione BS3 e l'altra metà per il controllo). Tritare ogni tessuto come al punto 5.8 e trasferire il tessuto in tubi appropriati (vedere punto 6.3).
    NOTA: L'intero tempo di dissezione per ciascun animale deve essere mantenuto a ~ 5 minuti affinché le condizioni sperimentali e i risultati siano coerenti.

6. Reazione di reticolazione

1. Portare l'animale successivo per la dissezione dall'area abitativa alla stanza di dissezione quando la dissezione del cervello del topo precedente sta per terminare (passo 5.10).
2. Picchiettare il tubo pre-raffreddato su ghiaccio (dal punto 4.1) con 30 μL di soluzione BS3 (26x) o soluzione veicolo E subito prima che i tessuti tritati siano pronti per essere trasferiti nelle provette appropriate. Cambiare le punte dei pipetti tra i tubi per assicurarsi che nessun BS3 sia contaminato nei tubi di controllo senza reticolazione.
3. Trasferire i tessuti tritati (dal punto 5.8 al punto 5.10) nelle provette appropriate, quindi iniziare a sezionare l'animale successivo (punto 5.2)
4. Capovolgere e mescolare il tubo per rompere i pezzi di tessuto in pezzi più piccoli (Video 4) e iniziare a incubare i campioni sul rotatore del tubo nella cella frigorifera per 30 minuti a 2 ore. Registrare l'ora di inizio dell'incubazione BS3 per ogni provetta. Vedi la sezione di discussione per il tempo di incubazione ottimale.
5. Estinguere la reazione facendo spuntare il tubo con 78 μL di glicina 1 M e incubare ulteriormente il campione per 10 minuti a 4 °C con rotazione costante. Registrare l'ora di inizio e fine della tempra per ciascun tubo. Continuare ad assistere la persona che si concentra sulla dissezione dell'animale portando l'animale successivo (passo 6.1) e aiutando con la reticolazione (passo 6.2).
   NOTA: trattare ogni campione con la stessa identica tempistica per tutti i campioni. Se la sala di dissezione è lontana dalla cella frigorifera, si consiglia vivamente di reclutare una terza persona per prendere parte all'incubazione del campione e alla tempra nella cella frigorifera.

7. Lisi tissutale, preparazione proteica e western blot

1. Dopo 10 minuti di tempra (fase 6.5), ruotare i campioni a 20.000 x g a 4 °C per 2 minuti ed eliminare il surnatante. Se è disponibile una terza persona, procedere al passaggio 7.2; Altrimenti, congelare i campioni su ghiaccio secco e mettere in pausa il test qui fino a quando la dissezione cerebrale (sezione 5) e la reticolazione (sezione 6) per tutti gli animali sono completate.
2. Aggiungere 400 μL di tampone di lisi ghiacciato per provetta.
3. Sonicare i campioni per 1 s cinque volte con intervalli di 5 s in mezzo, mantenendo i campioni sul ghiaccio.
4. Spin i campioni a 20.000 x g per 2 minuti per far uscire i detriti tissutali insolubili (pellet) e salvare il surnatante.
5. Utilizzare 5 μL di surnatante per misurare la concentrazione proteica utilizzando il test dell'acido bicinconinico (BCA).
6. Dividere il resto del surnatante in due tubi; una provetta contiene 100 μL di surnatante per la successiva western blot, e l'altra provetta contiene il resto (~300 μL) per la conservazione a lungo termine a -80 °C. Aggiungere una quantità appropriata di tampone campione 4x SDS (integrato con β2-mercaptoetanolo) ai campioni e incubare a 70 °C per 10 minuti.
7. Eseguire 10-20 μg di proteine per pozzetto su un gel di acrilammide per elettroforesi (SDS-PAGE), quindi trasferire le proteine alla membrana del fluoruro di polivinilidene (PVDF) per l'analisi western blot.
8. Bloccare la membrana PVDF in latte scremato al 5% (p/v) sciolto in soluzione salina tamponata Tris contenente 0,1% Tween-20 (TBS-T) per 1 ora a RT.
9. Lavare brevemente la membrana due volte con TBS-T e incubarla con l'anticorpo primario diluito in TBS-T durante la notte a 4 °C.
10. Lavare via l'anticorpo primario tre volte per 10 minuti ciascuna in TBS-T a RT.
11. Incubare la membrana con anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano diluito in TBS-T per 1 ora a RT.
12. Lavare via l'anticorpo secondario tre volte per 10 minuti ciascuna in TBS-T a RT.
13. Incubare la membrana in un reagente a chemiluminescenza potenziato e rilevare il segnale utilizzando l'apparato di documentazione del gel.

Risultati

Per dimostrare la fattibilità del test di reticolazione BS3 per valutare i livelli di α5-GABA A Rdi superficie nel PFC del topo, abbiamo eseguito 10 μg ciascuno di campioni di proteina reticolata BS3 e non reticolata su SDS-PAGE e analizzato le proteine mediante western blot utilizzando un anticorpo anti-α5-GABA_AR (policlonale di coniglio) (Figura 7). I campioni di proteine non reticolate hanno fornito la quantità totale di α5-GABA A R a ~ 55 kDa, mentre i campion...

Discussione

Sebbene l'impatto dello stress psicosociale cronico sui comportamenti (cioè emotività e deficit cognitivi) e sui cambiamenti molecolari (cioè ridotta espressione dei geni GABAergici e deficit di accompagnamento nella neurotrasmissione GABAergica) siano ben documentati¹⁰, i meccanismi alla base di tali deficit necessitano di ulteriori indagini. In particolare, dato il recente studio che dimostra che lo stress cronico influenza significativamente il proteoma neuronale attraverso il sovraccarico s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020
1 M HEPES	Gibco	15630080
10x TBS	Bio-Rad	1706435
2.5 M (45%, w/v) Glucose	Sigma	G8769
2-mercaptoethanol	Sigma	M3148
4x SDS sample buffer (Laemmli)	Bio-Rad	1610747
Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)	Pierce	A39266	No-Weigh Format; 10 x 2 mg
Brain matrix	Ted Pella	15003	For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
Curved probe	Fine Science Tools	10088-15	Gross Anatomy Probe; angled 45
Deionized water	milli-Q	EQ 7000	Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb]
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001
Filter paper (3MM)	Whatman	3030-917
Forceps (large)	Fine Science Tools	11152-10	Extra Fine Graefe Forceps
Forceps (small)	Fine Science Tools	11251-10	Dumont #5 Forceps
GABA-A R alpha 5 antibody	Invitrogen	PA5-31163	Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking
GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody	R&D Systems	PPS027	Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat
Glycine	Sigma	W328707
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Bio-Rad	1721019
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O)	Sigma	M2670
Nonidet-P40, substitute (NP-40)	SantaCruz	68412-54-4
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P9541
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340
PVDF membrane	Bio-Rad	1620177
Scissors (large)	Fine Science Tools	14007-14	Surgical Scissors - Serrated
Scissors (small)	Fine Science Tools	14060-09	Fine Scissors - Sharp
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S9888
Sonicator (Qsonica Sonicator Q55)	Qsonica	15338284
Table-top refregerated centrifuge	Eppendorf	5425R
Tissue punch (ID 1 mm)	Ted Pella	15110-10	Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm
Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer	Bio-Rad	10026938
Tube rotator (LabRoller)	Labnet	H5000