BS3 Ensayo de reticulación química: evaluación del efecto del estrés crónico en la superficie celularPresentación del receptor GABA A en el cerebro de roedores

Resumen

El ensayo de reticulación química BS3 revela una expresión reducida del receptor GABA_A en la superficie celular en cerebros de ratones en condiciones de estrés psicosocial crónico.

Resumen

La ansiedad es un estado de emoción que afecta de manera variable los comportamientos de los animales, incluidas las funciones cognitivas. Los signos conductuales de ansiedad se observan en todo el reino animal y pueden reconocerse como respuestas adaptativas o desadaptativas a una amplia gama de modalidades de estrés. Los roedores proporcionan un modelo experimental probado para estudios traslacionales que abordan los mecanismos integradores de la ansiedad a nivel molecular, celular y de circuito. En particular, el paradigma del estrés psicosocial crónico provoca respuestas desadaptativas que imitan fenotipos conductuales similares a la ansiedad / depresivos que son análogos entre humanos y roedores. Si bien estudios previos muestran efectos significativos del estrés crónico en el contenido de los neurotransmisores en el cerebro, el efecto del estrés en los niveles de receptores de neurotransmisores está poco estudiado. En este artículo, presentamos un método experimental para cuantificar los niveles de superficie neuronal de los receptores de neurotransmisores en ratones bajo estrés crónico, especialmente centrándonos en los receptores de ácido gamma-aminobutírico (GABA), que están implicados en la regulación de la emoción y la cognición. Usando el reticulante químico irreversible impermeable a la membrana, bissulfosuccinimidyl suberate (BS3), mostramos que el estrés crónico regula significativamente a la baja la disponibilidad superficial de los receptores GABA_A en la corteza prefrontal. Los niveles de superficie neuronal de los receptores GABA_A son el proceso limitante de la velocidad para la neurotransmisión de GABA y, por lo tanto, podrían usarse como un marcador molecular o un proxy del grado de fenotipos similares a la ansiedad / depresivos en modelos animales experimentales. Este enfoque de reticulación es aplicable a una variedad de sistemas receptores para neurotransmisores o neuromoduladores expresados en cualquier región del cerebro y se espera que contribuya a una comprensión más profunda de los mecanismos subyacentes a la emoción y la cognición.

Introducción

Los receptores de neurotransmisores se localizan en la superficie de la membrana plasmática neuronal o intracelularmente en las endomembranas (por ejemplo, el endosoma, el retículo endoplásmico [RE] o el aparato trans-Golgi) y se desplazan dinámicamente entre estos dos compartimentos dependiendo de los estados fisiológicos intrínsecos en las neuronas o en respuesta a las actividades de la red neuronal extrínseca ^1,2. Dado que los neurotransmisores recién secretados provocan sus funciones fisiológicas principalmente a través del conjunto de receptores localizados en la superficie, los niveles de receptores de superficie para un neurotransmisor dado son uno de los determinantes críticos de su capacidad de señalización dentro del circuito neuronal³.

Existen varios métodos disponibles para monitorizar los niveles de receptores de superficie en neuronas cultivadas, incluyendo el ensayo de biotinilación superficial⁴, el ensayo de inmunofluorescencia con un anticuerpo específico en condiciones no permeabilizadas⁵, o el uso de un transgén receptor genéticamente fusionado con un indicador óptico fluorescente sensible al pH (por ejemplo, pHluorin)⁶. Por el contrario, estos enfoques son limitados o poco prácticos cuando se evalúan los niveles de receptores de superficie in vivo. Por ejemplo, el procedimiento de biotinilación de superficie puede no ser práctico para procesar grandes cantidades y números de muestras de tejidos cerebrales in vivo debido a su precio relativamente alto y los pasos posteriores necesarios para purificar las proteínas biotiniladas en perlas conjugadas con avidina. Para las neuronas integradas en la arquitectura cerebral tridimensional, la baja accesibilidad de anticuerpos o las dificultades en la cuantificación basada en microscopios pueden plantear una limitación significativa para evaluar los niveles de receptores de superficie in vivo. Para visualizar la distribución de los receptores de neurotransmisores en cerebros intactos, se podrían utilizar métodos no invasivos, como la tomografía por emisión de positrones, para medir la ocupación del receptor y estimar los niveles de receptores de superficie⁷. Sin embargo, este enfoque se basa críticamente en la disponibilidad de ligandos de radio específicos, equipos costosos y experiencia especial, lo que lo hace menos accesible para el uso rutinario de la mayoría de los investigadores.

Aquí, describimos un método simple y versátil para medir los niveles de receptores de superficie en cerebros de animales experimentales ex vivo utilizando un reticulante químico soluble en agua e impermeable a la membrana, bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)^8,9. BS3 se dirige a aminas primarias en la cadena lateral de residuos de lisina y puede reticular covalentemente proteínas muy cercanas entre sí. Cuando los cortes de cerebro se preparan recién a partir de una región de interés y se incuban en un tampón que contiene BS3, los receptores de la superficie celular se entrecruzan con proteínas vecinas y, por lo tanto, se transforman en especies de mayor peso molecular, mientras que los receptores asociados a la endomembrana intracelular permanecen sin modificar. Por lo tanto, los grupos de receptores superficiales e intracelulares pueden separarse mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y cuantificarse mediante Western blot utilizando anticuerpos específicos para el receptor a estudiar.

El estrés crónico leve impredecible (EMU) es un paradigma experimental bien establecido para inducir estrés psicosocial crónico en roedores¹⁰. UCMS provoca fenotipos conductuales similares a la ansiedad / depresivos y déficits cognitivos a través de la modulación de una serie de sistemas de neurotransmisores, incluyendo GABA y sus receptores^10,11. En particular, el receptor GABA A que contiene la subunidad α5 (α5-GABA_A R) está implicado en la regulación de la memoria y las funciones cognitivas^12,13, lo que sugiere la posible participación de funciones alteradas de esta subunidad en los déficits cognitivos inducidos por UCMS. En este protocolo, utilizamos el ensayo de reticulación BS3 para cuantificar los niveles de α5-GABA_AR expresado en la superficie en la corteza prefrontal de ratones expuestos a UCMS en comparación con ratones de control no estresados.

Protocolo

Todo el trabajo con animales en este protocolo se completó de acuerdo con la Ley de Animales para la Investigación de Ontario (RSO 1990, Capítulo A.22) y el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales (CCAC) y fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado de Animales.

1. Preparación de los animales

1. Determinar el número de animales que se utilizarán en los experimentos y dividirlos en grupos apropiados o cohortes experimentales. Consulte la sección de discusión para obtener una discusión sobre el tamaño del grupo, el sexo y el poder estadístico.
   NOTA: Este protocolo está personalizado para ratones (cepa C57BL6/J; 2-4 meses de edad; típicamente 20-30 g de peso corporal; número equivalente de machos y hembras a utilizar).
2. Colocar a los animales bajo UCMS o controlar condiciones no estresadas durante 5-8 semanas, siguiendo el protocolo descrito anteriormente¹⁴.
3. Después del último procedimiento de UCMS, permita que los animales permanezcan en sus jaulas domésticas durante 1 día antes de usarlos para el ensayo de reticulación para evitar efectos de estrés agudo en la expresión del receptor.

2. Preparación de las soluciones madre

1. Prepare y almacene las siguientes soluciones según las instrucciones previas al ensayo.
   1. Preparar 5 M de NaCl disolviendo 14,6 g de NaCl en 40 ml de agua desionizada. Conservar a temperatura ambiente (RT).
   2. Preparar 1,08 M de KCl disolviendo 3,22 g de KCl en 40 ml de agua desionizada. Tienda en RT.
   3. Preparar 400 mM de MgCl 2 disolviendo 3,25 g de MgCl₂·_6H2Oen 40 mL de agua desionizada. Tienda en RT.
   4. Preparar 1 M de glicina disolviendo 3 g de glicina en 40 ml de agua desionizada y conservar a 4 °C.
   5. Preparar 1 M de ditiothreitol (DTT) disolviendo 1,54 g de TDT en 10 ml de agua desionizada. Filtrar-esterilizar a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 μm, y alícuota en tubos de 2 ml. Conservar a -20 °C.
   6. Prepare 10% de Nonidet-P40 (NP-40) diluyéndolo en una proporción de 1:10 (v/v) en agua desionizada. Tienda en RT.
   7. Prepare 0,5 M EDTA (pH = 8,0) y guárdelo en RT.
   8. Preparar tampón HEPES 1 M (pH = 7,2-7,5) y conservar a 4 °C.
   9. Preparar glucosa al 2,5 M o al 45% (p/v) y conservar a 4 °C.

3. Preparación del puesto de trabajo

1. El día del ensayo de reticulación BS3, reúna los siguientes materiales en la sala de disección de animales (Figura 1), con varios elementos preenfriados en hielo: un cubo de hielo, un bloque de temperatura de metal (preenfriado sobre hielo), PBS helado en un tubo cónico de 50 ml y PBS congelado en una placa de Petri, papel de filtro humedecido con PBS y colocado sobre una superficie plana refrigerada o hielo azul, una matriz cerebral (intervalo de 1 mm para la inserción de una hoja de afeitar) preenfriada en hielo, hojas de afeitar (~10) preenfriadas en hielo, herramientas de disección (tijeras, fórceps, una sonda curva), un punzón de tejido, papel y toallas de papel de spray de etanol al 70%, puntas de pipeta (200 μL), una pipeta (P200), un cronómetro, un bloc de notas, un bolígrafo y tubos de microcentrífuga (1,5 ml).
   1. Antes del ensayo, etiquete los tubos de microcentrífuga con la información de la muestra (p. ej., número de identificación del animal, tipo de tratamiento [UCMS versus sin estrés (NS)], región cerebral, con o sin BS3, etc.).
      NOTA: Para los ensayos de reticulación BS3, se deben recolectar dos muestras de cada región del cerebro; una muestra se utilizará para la reticulación (con BS3) y la otra para la reacción sin reticulación (sin BS3) como control. Por lo tanto, para tomar muestras de dos regiones cerebrales (es decir, la corteza prefrontal [PFC] y el hipocampo [HPC]) en 12 ratones, etiquete 48 tubos para el muestreo inicial (= 2 muestras × 2 regiones × 12 ratones) (que se utilizará en la sección 6). Etiquetar dos juegos adicionales de 48 tubos para su posterior almacenamiento (para almacenar dos volúmenes diferentes [100 μL, 300 μL] de cada muestra) (que se utilizarán en la sección 7). Por lo tanto, se requiere etiquetar 144 tubos en total para este tamaño de cohorte.
2. Además, asegúrese de que el siguiente equipo esté disponible en el laboratorio: una microcentrífuga refrigerada de mesa, un sonicador, un rotador de tubos (para ser utilizado en la cámara frigorífica o dentro del refrigerador [4 °C]), un congelador (-80 °C) para almacenar muestras y un cubo de hielo seco para el almacenamiento temporal de las muestras (que se utilizará en la sección 7)

4. Preparación de las soluciones de trabajo y tampones

NOTA: En la mañana del ensayo, prepare las siguientes soluciones. Este cálculo se basa en las soluciones necesarias para procesar dos regiones cerebrales (es decir, el PFC y el HPC) de 12 ratones.

1. Preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF, pH = 7.4) como se menciona en la Tabla 1. Dispensar 750 μL de aCSF en cada tubo de muestreo (los 48 tubos etiquetados en el paso 3.1.1) y colóquelos en el bloque de temperatura del metal sobre hielo para enfriar previamente el tampón.
2. Prepare el tampón de lisis como se menciona en la Tabla 2. Conservar en hielo (400 μL por muestra).
3. Preparar una solución madre BS3 de 52 mM (26x) en tampón de citrato de sodio de 5 mM (pH = 5,0).
   1. Primero, prepare 100 mM de ácido cítrico (stock A) y 100 mM de citrato de sodio (stock B).
   2. Diluir el stock A y el stock B en una proporción de 1:20 con agua desionizada. Añadir 100 μL cada uno a 1,9 ml de agua para preparar 5 mM de ácido cítrico (stock C) y 5 mM de citrato de sodio (stock D), respectivamente.
   3. Mezclar 410 μL de cepa C y 590 μL de caldo D para preparar un tampón de citrato de sodio de 5 mM (pH = 5,0) (solución E, 1 ml).
   4. Confirme el pH de la solución E utilizando una tira indicadora de pH.
   5. Disolver 24 mg de BS3 en 806,4 μL de solución E mediante vórtice durante 30 s para preparar la solución madre de BS3 (26x).
   6. Prepare otro 1 ml de solución E para usar como control del vehículo para las muestras sin reticulación.
      NOTA: Prepare la solución madre BS3 cuando todo lo demás esté listo y el experimento esté a punto de comenzar. El BS3 debe conservarse desecado a 4 °C hasta su uso. Una vez reconstituida, la BS3 permanece activa sólo durante aproximadamente ≤3 h. Como se informa que el pH del tampón de citrato de sodio de 5 mM (solución E) aumenta con el tiempo, causando hidrólisis BS3 acelerada, se recomienda que la solución E se prepare fresca a partir de las soluciones madre A y B⁹. Debido a la solubilidad limitada de BS3 a bajas temperaturas, mantener el BS3 reconstituido a RT. Utilizar el BS3 reconstituido en 3 h, y no congelar/descongelar ni reutilizar el BS3 reconstituido.

5. Disección de tejidos cerebrales

NOTA: A partir de este paso, al menos dos personas deben trabajar juntas de manera coordinada. Mientras una persona se centra en la disección de animales (pasos 5.2-5.10 y paso 6.3), la otra persona debe trabajar como cronometrador y ayudar a coordinar el ensayo (paso 5.1, paso 6.1, paso 6.2, paso 6.4 y paso 6.5)

1. Lleve el primer animal para la disección del área de alojamiento a la sala de disección.
   NOTA: Como los factores estresantes agudos (por ejemplo, un ambiente nuevo, el olor a sangre) pueden afectar la dinámica de las proteínas cerebrales, los animales deben mantenerse en sus jaulas domésticas colocadas lejos del área de disección y luego ser llevados individualmente a la sala de disección para su decapitación inmediata.
2. Eutanasia del ratón por luxación cervical seguida de decapitación. Retire el cerebro rápidamente del cráneo y sumérjalo en PBS helado en una placa de Petri durante 10-15 s (Figura 2).
   NOTA: Los animales no son anestesiados para experimentos BS3 ya que cualquier agente anestésico podría influir potencialmente en el nivel de presentación superficial de los receptores de neurotransmisores⁹.
3. Coloque el cerebro frío en la matriz cerebral sobre hielo, con el lado ventral del cerebro hacia arriba (Figura 3).
4. Inserte la primera hoja de afeitar a través del borde entre el bulbo olfatorio y el pedúnculo olfativo para cortar el cerebro coronalmente (Figura 4). Usando de tres a cuatro cuchillas de afeitar adicionales, corte en serie la parte anterior del cerebro coronalmente con intervalos de 1 mm.
5. Levante los cortes coronales de la matriz cerebral sosteniendo todas las cuchillas de afeitar insertadas juntas, dejando la parte posterior del cerebro atrás en la matriz cerebral. Use fórceps para separar las hojas de afeitar entre sí y colóquelas en la superficie plana y fría con el corte del cerebro hacia arriba (Figura 5).
6. Identifique los sectores que contienen la región de interés. Para tomar muestras del PFC, elija la segunda y tercera rebanadas posteriores a la primera rebanada que contiene el pedúnculo olfativo.
7. Retire la región de interés con un punzón de tejido (Video 1), déjela a un lado en la cuchilla de afeitar refrigerada y divida uniformemente el tejido en dos (por ejemplo, tejidos del hemisferio izquierdo versus derecho, con una mitad para usar la reacción de reticulación BS3 y la otra mitad para el control sin reticulación si la proteína objetivo de interés se expresa igualmente en ambos hemisferios).
8. Pique cada tejido en pedazos en la hoja de afeitar usando la punta fina de las pinzas con múltiples movimientos verticales contra la hoja (Video 2) en lugar de triturar o moler los tejidos. Esto maximizará el área de superficie accesible a BS3 sin comprometer gravemente la integridad de la membrana de las células. Inmediatamente después de picar, transfiera los tejidos picados a los tubos apropiados (ver paso 6.3).
9. Para tomar muestras de la HPC, saque la parte posterior del cerebro de la matriz y coloque el cerebro sobre papel de filtro humedecido sobre la superficie plana refrigerada, con el lado dorsal hacia arriba (Figura 6).
10. Usando una sonda curva y fórceps, y acercándose desde el lado dorsal (Video 3), disecciona el HPC (mitad dorsal, mitad ventral o ambas) de ambos hemisferios (una mitad para la reticulación BS3 y la otra mitad para el control). Picar cada tejido como en el paso 5.8 y transferir el tejido a los tubos apropiados (ver paso 6.3).
    NOTA: El tiempo completo de disección para cada animal debe mantenerse en ~ 5 minutos para que las condiciones experimentales y los resultados sean consistentes.

6. Reacción de reticulación

1. Lleve al siguiente animal para la disección desde el área de alojamiento a la sala de disección cuando la disección del cerebro del ratón anterior esté a punto de terminar (paso 5.10).
2. Clavar el tubo preenfriado en hielo (a partir del paso 4.1) con 30 μL de solución BS3 (26x) o solución vehículo E justo antes de que los tejidos picados estén listos para ser transferidos a los tubos apropiados. Cambie las puntas de pipeta entre los tubos para asegurarse de que no se contamine BS3 en los tubos de control sin reticulación.
3. Transfiera los tejidos picados (de los pasos 5.8 y 5.10) a los tubos apropiados y, a continuación, comience a diseccionar al siguiente animal (paso 5.2)
4. Invierta y mezcle el tubo para separar los trozos de tejido en trozos más pequeños (Video 4), y comience a incubar las muestras en el rotador del tubo en la cámara frigorífica durante 30 minutos a 2 h. Registre la hora de inicio de la incubación BS3 para cada tubo. Consulte la sección de discusión para conocer el tiempo de incubación óptimo.
5. Apagar la reacción pinchando el tubo con 78 μL de glicina 1 M e incubar la muestra durante 10 min a 4 °C con rotación constante. Registre la hora de inicio y finalización del enfriamiento para cada tubo. Continúe ayudando a la persona que se enfoca en la disección de animales trayendo al siguiente animal (paso 6.1) y ayudando con la reticulación (paso 6.2).
   NOTA: Trate cada muestra exactamente con el mismo tiempo en todas las muestras. Si la sala de disección está lejos de la cámara frigorífica, se recomienda encarecidamente que se reclute a una tercera persona para que participe en la incubación y enfriamiento de la muestra en la cámara frigorífica.

7. Lisis tisular, preparación de proteínas y Western blot

1. Después de 10 minutos de enfriamiento (paso 6.5), girar las muestras a 20.000 x g a 4 °C durante 2 min y desechar el sobrenadante. Si hay una tercera persona disponible, continúe con el paso 7.2; De lo contrario, congele rápidamente las muestras en hielo seco y detenga el ensayo aquí hasta que se complete la disección cerebral (sección 5) y la reticulación (sección 6) para todos los animales.
2. Añadir 400 μL de tampón de lisis helada por tubo.
3. Sonicar las muestras durante 1 s cinco veces con intervalos de 5 s en el medio, mientras mantiene las muestras en hielo.
4. Girar las muestras a 20.000 x g durante 2 minutos para hilar los restos de tejido insolubles (pellets) y guardar el sobrenadante.
5. Utilice 5 μL del sobrenadante para medir la concentración de proteína mediante el ensayo de ácido bicinchonínico (BCA).
6. Divida el resto del sobrenadante en dos tubos; un tubo contiene 100 μL de sobrenadante para la posterior Western blot, y el otro tubo contiene el resto (~300 μL) para almacenamiento a largo plazo a −80 °C. Añadir una cantidad adecuada de tampón de muestra 4x SDS (suplementado con β2-mercaptoetanol) a las muestras, e incubar a 70 °C durante 10 min.
7. Ejecute 10-20 μg de proteína por pocillo en un gel de acrilamida para electroforesis (SDS-PAGE), y luego transfiera proteínas a la membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) para el análisis de Western blot.
8. Bloquear la membrana de PVDF en leche descremada al 5% (p/v) disuelta en solución salina tamponada con Tris que contiene 0,1% de Tween-20 (TBS-T) durante 1 h en RT.
9. Lave brevemente la membrana dos veces con TBS-T e incube con el anticuerpo primario diluido en TBS-T durante la noche a 4 °C.
10. Lave el anticuerpo primario tres veces durante 10 minutos cada una en TBS-T en RT.
11. Incubar la membrana con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante diluido en TBS-T durante 1 h en RT.
12. Lave el anticuerpo secundario tres veces durante 10 minutos cada una en TBS-T en RT.
13. Incubar la membrana en un reactivo de quimioluminiscencia mejorado y detectar la señal utilizando el aparato de documentación del gel.

Resultados

Para demostrar la viabilidad del ensayo de reticulación BS3 para evaluar los niveles de superficie de α5-GABA A R en el PFC de ratón, ejecutamos 10 μg de muestras de proteínas reticuladas y no reticuladas de BS3 en SDS-PAGE y analizamos las proteínas por Western blot utilizando un anticuerpo anti-α5-GABA_AR (policlonal de conejo) (Figura 7). Las muestras de proteínas no reticuladas dieron la cantidad total de α5-GABA A R a ~ 55 kDa, mientras que las muestras de ...

Discusión

Aunque el impacto del estrés psicosocial crónico en los comportamientos (es decir, la emocionalidad y los déficits cognitivos) y los cambios moleculares (es decir, la expresión reducida de los genes GABAérgicos y los déficits que acompañan a la neurotransmisión GABAérgica) están bien documentados¹⁰, los mecanismos subyacentes a tales déficits necesitan más investigación. En particular, dado el reciente estudio que muestra que el estrés crónico afecta significativamente el proteoma n...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020
1 M HEPES	Gibco	15630080
10x TBS	Bio-Rad	1706435
2.5 M (45%, w/v) Glucose	Sigma	G8769
2-mercaptoethanol	Sigma	M3148
4x SDS sample buffer (Laemmli)	Bio-Rad	1610747
Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)	Pierce	A39266	No-Weigh Format; 10 x 2 mg
Brain matrix	Ted Pella	15003	For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
Curved probe	Fine Science Tools	10088-15	Gross Anatomy Probe; angled 45
Deionized water	milli-Q	EQ 7000	Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb]
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001
Filter paper (3MM)	Whatman	3030-917
Forceps (large)	Fine Science Tools	11152-10	Extra Fine Graefe Forceps
Forceps (small)	Fine Science Tools	11251-10	Dumont #5 Forceps
GABA-A R alpha 5 antibody	Invitrogen	PA5-31163	Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking
GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody	R&D Systems	PPS027	Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat
Glycine	Sigma	W328707
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Bio-Rad	1721019
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O)	Sigma	M2670
Nonidet-P40, substitute (NP-40)	SantaCruz	68412-54-4
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P9541
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340
PVDF membrane	Bio-Rad	1620177
Scissors (large)	Fine Science Tools	14007-14	Surgical Scissors - Serrated
Scissors (small)	Fine Science Tools	14060-09	Fine Scissors - Sharp
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S9888
Sonicator (Qsonica Sonicator Q55)	Qsonica	15338284
Table-top refregerated centrifuge	Eppendorf	5425R
Tissue punch (ID 1 mm)	Ted Pella	15110-10	Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm
Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer	Bio-Rad	10026938
Tube rotator (LabRoller)	Labnet	H5000