BS3 化学交联测定:评估慢性应激对啮齿动物大脑中细胞表面 GABAA 受体呈递的影响

摘要

BS3化学交联测定显示，在慢性社会心理应激条件下，小鼠大脑中细胞表面GABA_A 受体表达减少。

摘要

焦虑是一种情绪状态，对动物的行为（包括认知功能）产生不同影响。在整个动物王国中观察到焦虑的行为迹象，并且可以被认为是对各种压力模式的适应性或适应不良反应。啮齿动物为转化研究提供了一个经过验证的实验模型，解决了分子、细胞和回路水平上焦虑的综合机制。特别是，慢性心理社会压力范式引发适应不良反应，模仿人类和啮齿动物之间的类似焦虑/抑郁样行为表型。虽然以前的研究表明慢性压力对大脑中神经递质内容物的显着影响，但压力对神经递质受体水平的影响尚未得到充分研究。在本文中，我们提出了一种实验方法来定量慢性应激下小鼠神经递质受体的神经元表面水平，特别是关注与情绪和认知调节有关的γ-氨基丁酸（GABA）受体。使用膜不可渗透的不可逆化学交联剂，双磺基琥珀酰亚胺基辛二酸酯（BS3），我们发现慢性压力显着下调前额叶皮层中GABA_A 受体的表面可用性。GABA_A 受体的神经元表面水平是GABA神经传递的限速过程，因此可以用作分子标志物或实验动物模型中焦虑/抑郁样表型程度的代表。这种交联方法适用于在任何大脑区域表达的神经递质或神经调节剂的各种受体系统，并有望有助于更深入地了解情绪和认知背后的机制。

引言

神经递质受体位于神经元质膜表面或细胞内内膜（例如，内体、内质网 [ER] 或反式高尔基体装置）上，并根据神经元的内在生理状态或对外在神经网络活动的响应在这两个隔室之间动态穿梭^1，2.由于新分泌的神经递质主要通过表面定位的受体池引发其生理功能，因此给定神经递质的表面受体水平是其在^{神经回路中}信号传导能力的关键决定因素之一3。

有几种方法可用于监测培养神经元中的表面受体水平，包括表面生物素化测定⁴，在非透^{化条件下使用}特异性抗体进行免疫荧光测定5，或使用与pH敏感荧光光学指示剂（例如pHluorin^）遗传融合的受体转基因6。相比之下，在评估 体内表面受体水平时，这些方法要么有限，要么不切实际。例如，表面生物素化程序可能不适用于处理大量和样品数量的 体内 脑组织，因为它的价格相对较高，并且需要后续步骤纯化亲和素偶联珠上的生物素化蛋白。对于嵌入三维大脑结构的神经元，低抗体可及性或基于显微镜的定量困难可能对评估 体内表面受体水平构成重大限制。为了可视化完整大脑中神经递质受体的分布，可以使用非侵入性方法（例如正电子发射断层扫描）来测量受体占用并估计表面受体水平⁷。然而，这种方法严重依赖于特定无线电配体的可用性、昂贵的设备和特殊的专业知识，这使得大多数研究人员难以获得常规使用。

在这里，我们描述了一种简单，通用的方法，用于使用水溶性，膜不可渗透的化学交联剂双（磺基琥珀酰亚胺基）亚伯酸双（磺基琥珀酰亚胺基）俯二酸酯（BS3^）离体测量实验动物大脑中的表面受体水平8^，9。BS3靶向赖氨酸残基侧链中的伯胺，并且可以在彼此附近共价交联蛋白质。当从感兴趣的区域新鲜制备脑切片并在含有BS3的缓冲液中孵育时，细胞表面受体与邻近蛋白质交联，从而转化为更高分子量的物种，而细胞内膜相关受体保持未修饰。因此，表面和细胞内受体池可以通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并使用对待研究受体特异性的抗体通过蛋白质印迹进行定量。

不可预测的慢性轻度应激（UCMS）是诱导啮齿动物慢性社会心理应激的成熟实验范式¹⁰。UCMS通过调节一系列神经递质系统（包括GABA及其受体^10，11）来引发焦虑/抑郁样行为表型和认知缺陷。特别是，含有α5亚基的GABA A受体（α5-GABA_AR）与记忆和认知功能的调节有关¹²，^13，这表明该亚基的功能改变可能参与UCMS诱导的认知缺陷。在该协议中，我们使用BS3交联测定来定量暴露于UCMS的小鼠前额叶皮层中表面表达的α5-GABA_AR的水平与非应激对照小鼠相比。

研究方案

该协议中的所有动物工作均根据安大略省动物研究法（RSO 1990，第A.22章）和加拿大动物护理委员会（CCAC）完成，并得到机构动物护理委员会的批准。

1. 动物的制备

1. 确定实验中使用的动物数量，并将它们分成适当的组或实验队列。有关群体规模、性别和统计功效的讨论，请参阅讨论部分。
   注意:该协议是为小鼠（C57BL6 / J菌株;2-4个月大;通常为20-30克体重;等量使用的雄性和雌性）定制的。
2. 按照前面描述的方案将动物置于UCMS或控制非应激条件下5-8周¹⁴。
3. 在最后一次UCMS程序后，让动物在家笼中停留1天，然后再将它们用于交联测定，以避免对受体表达的急性应激影响。

2. 储备溶液的制备

1. 在测定前按照说明制备和储存以下溶液。
   1. 通过将 14.6 g NaCl 溶解在 40 mL 去离子水中来制备 5 M NaCl。在室温 （RT） 下储存。
   2. 通过将 3.22 g KCl 溶解在 40 mL 去离子水中来制备 1.08 M KCl。存放在RT。
   3. 通过将 3.25 g MgCl 2·6H 2 O 溶解在 40 mL 去离子水中来制备 400 mM MgCl₂。存放在RT。
   4. 通过将3g甘氨酸溶解在40mL去离子水中来制备1M甘氨酸，并储存在4°C。
   5. 通过将 1.54 g DTT 溶解在 10 mL 去离子水中来制备 1 M 二硫苏糖醇 （DTT）。通过孔径为 0.2 μm 的过滤器对其进行过滤灭菌，并分装到 2 mL 管中。储存在-20°C。
   6. 通过在去离子水中以 1:10 （v/v） 的比例稀释来制备 10% Nonidet-P40 （NP-40）。存放在RT。
   7. 制备0.5 M EDTA（pH = 8.0），并储存在室温下。
   8. 准备1M HEPES缓冲液（pH = 7.2-7.5），并储存在4°C。
   9. 准备2.5M或45%（w / v）葡萄糖，并储存在4°C。

3. 工作站的准备

1. 在BS3交联测定当天，在动物解剖室（图1）中收集以下材料，在冰上预冷的几个物品:冰桶，金属温度块（在冰上预冷），50mL锥形管中的冰冷PBS和培养皿中的冷冻PBS，用PBS润湿滤纸并放置在冷却的平坦表面或蓝冰上， 在冰上预冷的脑基质（1 mm间隔用于剃须刀片插入），在冰上预冷的剃须刀片（~10），解剖工具（剪刀，镊子，弯曲探针），纸巾打孔器，70%乙醇喷雾擦拭纸和纸巾，移液器吸头（200μL），移液器（P200），秒表，记事本，笔和微量离心管（1.5 mL）。
   1. 在测定之前，用样品信息（例如，动物ID号，治疗类型[UCMS与无应激（NS）]，大脑区域，有或没有BS3等）标记微量离心管。
      注意:对于BS3交联测定，必须从每个脑区域收集两个样品;一个样品将用于交联（使用BS3），另一个样品将用于非交联反应（无BS3）作为对照。因此，为了从12只小鼠的两个大脑区域（即前额叶皮层[PFC]和海马[HPC]）中采样，标记48个试管进行初始采样（= 2个样本×2个区域×12只小鼠）（用于第6节）。标记另外两组 48 个试管以供以后存储（用于存储每个样品的两个不同体积 [100 μL， 300 μL]）（用于第 7 节）。因此，需要为该队列大小总共标记 144 个管。
2. 此外，请确保实验室中提供以下设备:台式冷冻微量离心机，超声仪，管旋转器（用于冷藏室或冰箱内[4°C]），用于储存样品的冰箱（-80°C）和用于临时储存样品的一桶干冰（用于第7节）

4. 工作溶液和缓冲液的制备

注意:在测定的早晨，准备以下溶液。该计算基于处理来自12只小鼠的两个大脑区域（即PFC和HPC）的必要解决方案。

1. 制备人工脑脊液（aCSF，pH = 7.4），如 表1所述。将 750 μL aCSF 分配到每个采样管（步骤 3.1.1 中标记的 48 个管）中，并将它们放入冰上的金属温度块中以预冷缓冲液。
2. 如 表2所述制备裂解缓冲液。储存在冰上（每个样品使用 400 μL）。
3. 在5 mM柠檬酸钠缓冲液（pH = 5.0）中制备52 mM BS 3储备溶液（26x）。
   1. 首先，制备100mM柠檬酸（储备A）和100mM柠檬酸钠（储备B）。
   2. 用去离子水以 1:20 的比例稀释储备液 A 和储备液 B。将 100 μL 各加入 1.9 mL 水中，分别制备 5 mM 柠檬酸（储备液 C）和 5 mM 柠檬酸钠（储备液 D）。
   3. 混合 410 μL 储备液 C 和 590 μL 储备液 D，制备 5 mM 柠檬酸钠缓冲液 （pH = 5.0）（溶液 E，1 mL）。
   4. 使用pH指示条确认溶液E的pH值。
   5. 涡旋 30 秒，将 24 mg BS3 溶解在 806.4 μL 溶液 E 中，以制备 BS3 储备溶液 （26x）。
   6. 准备另外 1 mL 溶液 E，用作非交联样品的载体对照。
      注意:当其他一切准备就绪且实验即将开始时，准备BS3储备溶液。BS3应在4°C干燥下储存直至使用。一旦重组，BS3仅保持活性约≤3小时。据报道，5mM柠檬酸钠缓冲液（溶液E）的pH值会随着时间的推移而升高，导致BS 3水解加速，因此建议从储备溶液A和B⁹中新鲜制备溶液E。由于BS3在低温下的溶解度有限，因此将重组的BS3保持在室温下。 在3小时内用完重组的BS3，并且不要冷冻/解冻或重复使用重组的BS3。

5. 脑组织解剖

注意:从此步骤开始，至少两个人应以协调的方式一起工作。当一个人专注于动物解剖（步骤5.2-5.10和步骤6.3）时，另一个人应该担任计时员并帮助协调测定（步骤5.1，步骤6.1，步骤6.2，步骤6.4和步骤6.5）

1. 将第一只动物从住房区带到解剖室。
   注意:由于急性应激源（例如，新的环境，血液气味）可能会影响大脑蛋白质动力学，因此应将动物饲养在远离解剖区域的家中笼子中，然后单独带入解剖室立即斩首。
2. 通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死，然后斩首。将大脑迅速从颅骨中取出，并将其浸入培养皿中的冰冷PBS中10-15秒（图2）。
   注意:动物没有被麻醉用于BS3实验，因为任何麻醉剂都可能影响神经递质受体9的表面呈递^水平。
3. 将冷却的大脑放入冰上的大脑基质中，大脑的腹侧朝上（图3）。
4. 将第一个剃须刀片插入嗅球和嗅蒂之间的边界，以切开大脑冠状（图4）。使用三到四个额外的剃须刀片，以 1 mm 的间隔连续切割大脑的前部冠状动脉。
5. 将所有插入的剃须刀片放在一起，将大脑的后部留在大脑基质中，从而将冠状切片从大脑基质中移除。使用镊子将剃须刀片彼此分开，并将它们放在平坦的冷却表面上，脑切片朝上（图5）。
6. 标识包含感兴趣区域的切片。要对PFC进行采样，请选择包含嗅蒂的第一个切片后面的第二和第三切片。
7. 使用组织冲头（视频 1）去除感兴趣的区域，将其放在冷却的剃须刀片上，并将组织均匀地分成两部分（例如，来自左半球和右半球的组织，一半用于 BS3 交联反应，另一半用于无交联对照，如果感兴趣的目标蛋白在两个半球中表达相同）。
8. 使用镊子的细尖在刀片上将每张纸巾切成碎片，对刀片进行多次垂直运动（视频 2），而不是捣碎或研磨纸巾。这将最大限度地提高BS3可及的表面积，而不会严重损害细胞的膜完整性。切碎后，立即将切碎的组织转移到适当的管中（见步骤6.3）。
9. 为了对HPC进行采样，将大脑的后部从基质中取出，然后将大脑放在冷却平坦表面上的湿滤纸上，背侧朝上（图6）。
10. 使用弯曲的探针和镊子，从背侧接近（视频3），从两个半球（一半用于BS3交联，另一半用于对照）解剖HPC（背半，腹侧半或两者）。按照步骤5.8将每个组织切碎，并将组织转移到适当的管中（见步骤6.3）。
    注意:每只动物的整个解剖时间应保持在~5分钟，以使实验条件和结果保持一致。

6. 交联反应

1. 当前一只小鼠的大脑解剖即将完成时，将下一只动物从住房区带到解剖室（步骤5.10）。
2. 在切碎的组织准备转移到适当的管中之前，用 30 μL BS3 溶液 （26x） 或载体溶液 E 加标在冰上预冷的试管（从步骤 4.1 开始）。更换管之间的移液器吸头，以确保无交联对照管中没有BS3污染。
3. 将切碎的组织（从步骤5.8和步骤5.10）转移到适当的管中，然后开始解剖下一只动物（步骤5.2）
4. 倒置并混合试管，将组织块分解成更小的碎片（视频4），并开始在冷藏室的试管旋转器上孵育样品30分钟至2小时。记录每个试管的BS3孵育开始时间。请参阅讨论部分，了解最佳孵育时间。
5. 通过用78μL的1M甘氨酸加标试管来淬灭反应，并将样品在4°C下以恒定旋转进一步孵育10分钟。记录每个管子淬火的开始和结束时间。继续通过带来下一只动物（步骤6.1）和帮助交联（步骤6.2）来帮助专注于动物解剖的人。
   注意:在所有样品中以完全相同的时间处理每个样品。如果解剖室离冷库较远，强烈建议招募第三人参加冷库样品孵化和淬火。

7. 组织裂解、蛋白质制备和蛋白质印迹

1. 淬灭10分钟后（步骤6.5），将样品在4°C下以20，000× g 旋转2分钟，并弃去上清液。如果有第三人可用，请继续执行步骤 7.2;否则，将样品快速冷冻在干冰上，并在此处暂停测定，直到所有动物的脑解剖（第5节）和交联（第6节）完成。
2. 每管加入 400 μL 冰冷的裂解缓冲液。
3. 对样品进行超声处理 1 秒五次，中间间隔 5 秒，同时将样品保持在冰上。
4. 以20，000× g 旋转样品2分钟以旋转出不溶性组织碎片（沉淀），并保存上清液。
5. 使用 5 μL 上清液使用二辛可宁酸 （BCA） 测定法测量蛋白质浓度。
6. 将上清液的其余部分分成两个管;一个管含有 100 μL 上清液用于随后的蛋白质印迹，另一个管包含剩余的 （~300 μL），用于在 −80 °C 下长期储存。 向样品中加入适量的4x SDS样品缓冲液（补充有β2-巯基乙醇），并在70°C下孵育10分钟。
7. 在用于电泳的丙烯酰胺凝胶 （SDS-PAGE） 上每孔运行 10-20 μg 蛋白质，然后将蛋白质转移到聚偏氟乙烯 （PVDF） 膜上进行蛋白质印迹分析。
8. 将PVDF膜封闭在5%（w / v）脱脂牛奶中，溶解在含有0.1%吐温-20（TBS-T）的Tris缓冲盐水中，在室温下1小时。
9. 用TBS-T短暂洗涤膜两次，并将其与在TBS-T中稀释的一抗在4°C孵育过夜。
10. 在室温下的TBS-T中洗掉一抗三次，每次10分钟。
11. 将膜与在TBS-T中稀释的辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育1小时。
12. 在室温下的TBS-T中洗掉二抗三次，每次10分钟。
13. 在增强化学发光试剂中孵育膜，并使用凝胶记录装置检测信号。

结果

为了证明BS3交联测定法评估小鼠PFC中表面α5-GABA_AR水平的可行性，我们在SDS-PAGE上运行BS3交联和非交联蛋白质样品各10μg，并使用抗α5-GABA_AR抗体（兔多克隆）通过蛋白质印迹分析蛋白质（图7）。非交联蛋白质样品在~55 kDa处给出α5-GABA_aR的总量，而BS3交联蛋白质样品给出一定量的内膜相关α5-GABA_AR（在~55 kDa迁移）以及代表与α5-GABA_AR共价交...

讨论

尽管慢性社会心理压力对行为（即情绪和认知缺陷）和分子变化（即GABA能基因表达减少和伴随GABA能神经传递缺陷）的影响已有充分记录¹⁰，但这种缺陷的机制需要进一步研究。特别是，鉴于最近的研究表明，慢性压力通过ER功能的过载显着影响神经元蛋白质组，从而增加ER压力¹⁵，慢性压力是否影响通过ER膜的GABA_AR运输以及GABA_AR的改变或表面水平...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020
1 M HEPES	Gibco	15630080
10x TBS	Bio-Rad	1706435
2.5 M (45%, w/v) Glucose	Sigma	G8769
2-mercaptoethanol	Sigma	M3148
4x SDS sample buffer (Laemmli)	Bio-Rad	1610747
Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)	Pierce	A39266	No-Weigh Format; 10 x 2 mg
Brain matrix	Ted Pella	15003	For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
Curved probe	Fine Science Tools	10088-15	Gross Anatomy Probe; angled 45
Deionized water	milli-Q	EQ 7000	Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb]
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001
Filter paper (3MM)	Whatman	3030-917
Forceps (large)	Fine Science Tools	11152-10	Extra Fine Graefe Forceps
Forceps (small)	Fine Science Tools	11251-10	Dumont #5 Forceps
GABA-A R alpha 5 antibody	Invitrogen	PA5-31163	Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking
GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody	R&D Systems	PPS027	Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat
Glycine	Sigma	W328707
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Bio-Rad	1721019
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O)	Sigma	M2670
Nonidet-P40, substitute (NP-40)	SantaCruz	68412-54-4
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P9541
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340
PVDF membrane	Bio-Rad	1620177
Scissors (large)	Fine Science Tools	14007-14	Surgical Scissors - Serrated
Scissors (small)	Fine Science Tools	14060-09	Fine Scissors - Sharp
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S9888
Sonicator (Qsonica Sonicator Q55)	Qsonica	15338284
Table-top refregerated centrifuge	Eppendorf	5425R
Tissue punch (ID 1 mm)	Ted Pella	15110-10	Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm
Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer	Bio-Rad	10026938
Tube rotator (LabRoller)	Labnet	H5000