Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم بروتوكولا لزراعة الكرويات عالية التكرار وتوصيفها الظاهري باستخدام التقاط الصور والبروتينات.

Abstract

نقدم بروتوكولا يصف خصائص ومزايا استخدام حاضنة clinostat مستقلة لزراعة ومعالجة ومراقبة ثقافات الخلايا 3D. يحاكي clinostat بيئة يمكن أن تتجمع فيها الخلايا ككرويات قابلة للتكاثر بدرجة عالية مع قوى قص منخفضة وانتشار نشط للمغذيات. لقد أثبتنا أن كلا من خلايا الكبد السرطانية وغير السرطانية (خطوط خلايا HepG2 / C3A و THLE-3) تتطلب 3 أسابيع من النمو قبل تحقيق وظائف مماثلة لخلايا الكبد. يسلط هذا البروتوكول الضوء على راحة استخدام الحاضنات لخلايا 3D مع كاميرات تراقب نمو الخلايا ، حيث يمكن التقاط لقطات لحساب وقياس الأجسام الكروية عند العلاج. وصفنا المقارنة بين خطوط خلايا THLE-3 و HepG2 / C3A ، مما يوضح كيف يمكن زراعة خطوط الخلايا غير السرطانية وكذلك الخلايا السرطانية الخالدة. نوضح ونوضح كيف يمكن إجراء تجارب البروتينات من عدد قليل من الأجسام الكروية ، والتي يمكن جمعها دون إزعاج إشارات الخلية ، أي لا يلزم التربسين. لقد أوضحنا أنه يمكن استخدام تحليل البروتينات لمراقبة النمط الظاهري النموذجي للكبد لعملية التمثيل الغذائي للسلسلة التنفسية وإنتاج البروتينات المشاركة في إزالة السموم المعدنية ووصف نظام شبه آلي لحساب وقياس منطقة الكرة الأرضية. إجمالا ، يقدم البروتوكول صندوق أدوات يشتمل على توصيف النمط الظاهري عبر التقاط الصور وخط أنابيب البروتينات لتجربة نماذج زراعة الخلايا 3D.

Introduction

لقد ثبت أن مزارع الخلايا في المختبر ضرورية ولا تقدر بثمن في إنشاء المعرفة الأساسية في علم الأحياء. الكثير من الفهم العلمي في علم الأحياء والسرطان على وجه التحديد جاء من نظام ثقافة 2D الذي هو خلايا تنمو في طبقة واحدة. على الرغم من أن ثقافة 2D كانت نظام زراعة الخلايا المهيمن ، إلا أن لها العديد من العيوب التي يمكن أن تخنق المزيد من التقدم البيولوجي. على سبيل المثال ، تفتقر الثقافات ثنائية الأبعاد إلى تفاعلات الخلايا الخلوية المهمة لإشارات الخلية وانتشارها1. حتى الآن ، ثبت أن أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد تعمل على تحسين تمايز النماذج ، والاستجابة للأدوية ، وغزو الورم ، والبيولوجيا2،3،4،5. النمذجة 3D من السرطانات الخبيثة أمر حيوي بشكل خاص بسبب ارتفاع عدد السكان المسنين ووفيات السرطان. سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو أحد الأسباب الرئيسية للوفيات المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم وكثيرا ما يكون له تشخيص سيئللغاية 6. من المعروف أن سرطان الكبد لديه معدل شفاء منخفض ، واستجابة ضعيفة للأدوية ، ومعدل تكرار مرتفع6،7،8. تم تطوير العديد من نماذج 3D للكبد الطبيعي وسرطان الكبد التي تحاكي فسيولوجيا أنسجة الكبد الطبيعية والخبيثة في الجسم الحي 9,10.

تتضمن بعض أنظمة 3D الحالية تراكبات سائلة ومفاعلات حيوية وهيدروجيل وسقالات وهياكل مطبوعة ثلاثية الأبعاد. توفر الأجسام الكروية المتولدة في المفاعلات الحيوية مزايا فريدة على وجه التحديد لأنها تحاكي توزيع الورم للتعرض للمغذيات وتبادل الغازات وتكاثر الخلايا / السكون11. المفاعلات الحيوية مناسبة بشكل خاص لنماذج السرطان نظرا لسهولة استخدامها ، وقابلية التوسع الكبيرة ، ونشر المغذيات ، وإمكانية الوصولإليها 11. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تسمح المفاعلات الحيوية بإجراء تجارب عالية الإنتاجية ، وقابلية أكبر للتكاثر ، وتقليل الخطأ البشري. المفاعل الحيوي المستخدم في هذه الدراسة فريد من نوعه لأنه يحاكي نظاما منخفض الجاذبية ، مما يقلل من قوى القص التخريبية المطبقة في المفاعلات الحيوية النموذجية مما يسمح باستنساخ أفضل12. تسمح الجاذبية متعددة الاتجاهات وتقليل قوى القص للخلايا بالتطور بطريقة فسيولوجية أكثر. كدليل على ذلك ، تقوم خلايا HepG2 / C3A التي تنمو وفقا لهذه المنهجية بتطوير عضيات كروية تنتج في الجسم الحي مستويات ATP وأدينيلات كيناز واليوريا والكوليسترول13,14. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العلاجات الدوائية في نظام 3D هذا أكثر تقدما وآلية مقارنة بثقافات 2D. في الثقافات 2D ، يجب أن يكون للعلاجات الدوائية في كثير من الأحيان دورة زمنية قصيرة بسبب الحاجة إلى التربسين والحفاظ على صحة الخلايا. ومع ذلك ، في حالتنا ، يمكننا إجراء علاجات دوائية طويلة الأمد للكرويات دون الحاجة إلى تعطيل بنية الخلايا وفسيولوجيتها. لذلك ، فإن التحول من ثقافات 2D إلى 3D ضروري لنمذجة أفضل للظواهر البيولوجية في الجسم الحي والمزيد من التطور العلمي.

تقدم هذه الورقة منهجية لزراعة كرويات عالية التكاثر (الشكل 1 والشكل 2) وتظهر نظاما شبه آلي لتوصيف الهياكل ثلاثية الأبعاد ظاهريا (الشكل 3). على مستوى الصورة ، نقدم معلومات حول عد وقياس مساحة الأجسام الكروية (الشكل 3). باستخدام طرق قياس الطيف الكتلي ، نوضح كيف يمكن استخدام البروتينات لتقييم وظائف بيولوجية محددة (الشكل 4). من خلال جمع وتحليل هذه البيانات ، نأمل في تحسين فهم البيولوجيا وراء أنظمة زراعة الخلايا 3D.

Protocol

1. المخازن المؤقتة والكواشف

  1. وسائط نمو الخلايا لخلايا HepG2 / C3A: قم بإعداد وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM ، 4.5 جم / لتر جلوكوز) يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، وأحماض أمينية غير أساسية (1٪ v / v) ، L-glutamine (1٪ v / v) والبنسلين / الستربتومايسين (0.5٪ v / v). قم بتخزين وسائط النمو عند 4 درجات مئوية.
  2. وسائط نمو الخلايا لخلايا THLE-3: تحضير وسط نمو الخلايا الظهارية الشعب الهوائية [BEGM] الذي يحتوي على مكملاته (مستخلص الغدة النخامية البقري [BPE] ، الهيدروكورتيزون ، عامل نمو البشرة البشري [hEGF] ، الإبينفرين ، الترانسفيرين ، الأنسولين ، حمض الريتينويك ، ثلاثي يودوثيرونين ، جنتاميسين سلفات الأمفوتريسين [GA]) بالإضافة إلى 10٪ FBS ، 5 نانوغرام / مل hEGF و 70 نانوغرام / مل فوسفويتانولامين.
  3. 500 مللي مول DL-Dithiothreitol (DTT): لتحضير 10 مل ، أعد تعليق 0.771 جم من DTT في 10 مل من الماء بدرجة HPLC. قم بتخزين 100 ميكرولتر من القسامات عند -20 درجة مئوية.
  4. 200 mM iodoacetamide: لتحضير 1 مل ، أعد تعليق 36 مجم من يودواسيتاميد في 1 مل من 50 مللي مول من بيكربونات الأمونيوم. لا تقم بتخزين اليودواسيتاميد المعاد تعليقه.
  5. 5٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS): لتحضير 50 مل ، أعد تعليق 2.5 جم من SDS في 50 مل من 50 مللي مول من بيكربونات الأمونيوم 50 مللي مول. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
  6. 12٪ حمض الفوسفوريك: لتحضير 100 مل ، قم بتخفيف 14.1 مل من 85٪ حمض الفوسفوريك في 85.9 مل من ماء HPLC. تخزينها في زجاجة زجاجية في درجة حرارة الغرفة (RT).
  7. عازلة ملزمة: لتحضير 1 لتر ، أضف 900 مل من الميثانول المركز إلى 100 مل من 10 مللي مول من بيكربونات الأمونيوم 10 مللي متر أو TEAB.
  8. 0.1٪ محلول حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA): أضف 1 مل من TFA المركز إلى 999 مل من ماء HPLC الصف. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
  9. 60٪ أسيتونيتريل / 0.1٪ محلول TFA: أضف 600 مل من الأسيتونيتريل بدرجة HPLC (60٪ v / v) إلى 399 مل من الماء بدرجة HPLC. بعد ذلك ، أضف 1 مل من TFA المركز إلى هذا المحلول ، ثم خزنه في 4 درجات مئوية.
  10. المرحلة A المتنقلة (MPA) - 0.1٪ حمض الفورميك: أضف 1 مل من حمض الفورميك المركز إلى 999 مل من الماء بدرجة HPLC واخلطه جيدا.
  11. المرحلة B المتنقلة (MPB) - 80٪ أسيتونيتريل من درجة HPLC + 0.1٪ حمض الفورميك: أضف 800 مل من الأسيتونيتريل من درجة HPLC إلى 199 مل من الماء من درجة HPLC. بعد ذلك ، أضف 1 مل من حمض الفورميك المركز إلى هذا المحلول واخلطه.

2. إعداد كرويات

ملاحظة: يمثل الشكل 1A الخطوات الأولية لإعداد وزراعة كرويات 3D من خطوط الخلايا.

  1. قم بإذابة خلايا HepG2 / C3A و THLE-3 المجمدة وزرعها كطبقة أحادية باستخدام وسائط نمو قياسية في دورق أو طبق زراعة الأنسجة حتى تصل إلى التقاء 80٪ تقريبا.
    ملاحظة: عندما تصل الخلايا إلى نقطة التقاء ، تحقق من التشكل الخلوي العام وأنماط النمو باستخدام المجهر. لا ينصح باستخدام الخلايا بأرقام مرور عالية.
  2. اغسل الخلايا مرتين بمحلول الملح المتوازن من هانك (HBSS ، استخدم 5 مل لقارورة T75 سم2 أو طبق 10 سم).
  3. أضف 5 مل من 0.05٪ تربسين-EDTA المخفف في HBSS (تخفيف 1: 2) واحتضانه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. استخدم المجهر لتقييم انفصال الخلايا وإضافة 3 مل من FBS أو وسائط النمو (تحتوي على 10٪ FBS) لتحييد تفاعل التربسين.
  4. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل. قم بالدوران لأسفل عند 270 × جم في RT لمدة 5 دقائق.
  5. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 5 مل من وسائط النمو الكاملة.
    ملاحظة: إذا كان هناك عدد كبير جدا من الخلايا ، فقم بتخفيف تعليق الخلية قبل العد.
  6. احسب عدد الخلايا وخفف تعليق الخلية في وسائط النمو الكاملة للحصول على 1 × 106 في حجم أقصى يبلغ 1.5 مل.
  7. قم بموازنة لوحة سفلية مستديرة ذات 24 بئرا ذات ملحق منخفض للغاية تحتوي على آبار دقيقة.
    1. اغسل الآبار ب 0.5 مل من وسائط النمو.
    2. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 3000 × غرام لمدة 5 دقائق (وهذا يزيل فقاعات الهواء من سطح الآبار).
  8. انقل تعليق الخلية (المعد في الخطوة 1.4) إلى اللوحة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 120 × جم.
    ملاحظة: قد يختلف حجم تعليق الخلية اعتمادا على عدد الخلايا ، ولكن من المهم قصره على 1.5 مل.
  9. احتضان اللوحة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لبدء تكوين كروي.

3. زراعة الكرويات في المفاعلات الحيوية (الشكل 2)

ملاحظة: للحفاظ على بنية كروية ، استخدم نصائح التجويف العريض عند التعامل مع كرات 3D.

  1. قم بموازنة المفاعل الحيوي عن طريق ملء غرفة الرطوبة ب 25 مل من الماء المعقم وغرفة الخلية ب 9 مل من وسائط النمو 24 ساعة قبل نقل الكرويات إليها (الشكل 2 أ). تأكد من استخدام حقنة سعة 10 مل مقترنة بإبرة طويلة عند ملء الرطوبة وغرف الخلايا.
  2. احتضان المفاعل الحيوي ، بالتناوب (15 دورة في الدقيقة) في الحاضنة ثلاثية الأبعاد (الشكل 2D ، F) ، لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  3. باستخدام أطراف تجويف عريضة سعة 1 مل ، ماصة برفق لأعلى ولأسفل لفصل الأجسام الكروية عن لوحة التثبيت المنخفضة للغاية ونقل الأجسام الكروية إلى طبق زراعة الأنسجة.
  4. اغسل لوحة التثبيت المنخفضة للغاية ب 0.5 مل من وسائط النمو الدافئة مسبقا لالتقاط بقايا كرويات ونقلها إلى نفس الطبق من الخطوة 3.3.
  5. قم بتقييم حجم الأجسام الكروية وانضغاطها واستدارتها باستخدام مجهر ضوئي (تكبير 4x) واختر تلك التي تم تشكيلها بشكل كاف.
    ملاحظة: تتشكل الخلايا بشكل كاف عندما تكون مضغوطة ولا تتفتت أثناء المناولة. من المهم أيضا أن تكون الأجسام الكروية وحدة واحدة ولا تتجمع معا. يفضل حجم كروي يتراوح بين 100-200 ميكرومتر عند نقله إلى المفاعل الحيوي.
  6. نقل الأجسام الكروية إلى المفاعل الحيوي المتوازن المملوء ب 5 مل من وسائط النمو الطازجة. بعد نقل المواد الكروية ، املأ المفاعل الحيوي بالكامل بوسائط نمو جديدة ، وتأكد من تجنب إضافة فقاعات إلى المفاعل الحيوي عند ملئه بالوسائط.
  7. ضع المفاعل الحيوي في حاضنة 3D واضبط سرعة الدوران باستخدام وحدة التحكم (الشكل 2C). بالنسبة للكرويات HepG2 / C3A ، اضبط سرعة الدوران على 10-11 دورة في الدقيقة ؛ بالنسبة للكرويات THLE-3 ، اضبطها على 11-12 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: يتم ضبط سرعة الدوران بشكل صحيح عندما يتم توزيع الأجسام الكروية بالتساوي في وسط المفاعل الحيوي وعدم لمس جدرانه. يوضح الشكل 2E مفاعلا حيويا دوارا.
  8. تبادل وسائط النمو كل 2-3 أيام عن طريق إزالة 10 مل من الوسائط القديمة واستبدالها ب 10 مل من الوسائط الجديدة ؛ تأكد من عدم إزالة الأجسام الكروية عند تبادل الوسائط (الشكل 2 ب).
    ملاحظة: يوصى بأن يكون هناك روتين لتبادل الوسائط (على سبيل المثال ، 48 ساعة / 48 ساعة / 72 ساعة) والاحتفاظ بسجل مفصل.
  9. اضبط سرعة الدوران في كل مرة يتم فيها تغيير الوسائط. زيادة السرعة مع نمو الأجسام الكروية في الحجم والعدد.
  10. بعد 15 يوما في الثقافة ، قسم الأجسام الكروية إلى مفاعلين حيويين جديدين.
    ملاحظة: اعتمادا على خط الخلية ومعدل النمو ، قد يختلف الوقت ويجب تحسينه بشكل فردي.
  11. بعد 20 يوما ، تكون الأجسام الكروية جاهزة للتجميع.

4. التقاط الصور وعد الأجسام الكروية

ملاحظة: يظهر خط الأنابيب المبسط لعدد الأجسام الكروية في الشكل 3 أ. بالنسبة لعدد الأجسام الكروية وتحديد المساحة (القسم 5) ، من الأهمية بمكان تقييم انضغاط هياكل 3D. سيساهم ذلك في تحسين تباين الألوان بشكل أكبر ، وهو أمر ضروري حتى تكون الطريقة دقيقة.

  1. افتح تطبيق 3D المثبت على الجهاز اللوحي.
  2. حدد المفاعل الحيوي والتقط لقطة.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن التقاط صورة. يجب مراعاة المعلمات التالية.
    1. ضع خلفية سوداء خلف المفاعل الحيوي (يتم توفير الدعم الأسود في صندوق المفاعل الحيوي).
    2. تأكد من عدم وجود انعكاس للضوء على حجرة الخلية.
    3. التقط الصورة بالقرب من المفاعل الحيوي قدر الإمكان.
  3. افتح صورة واحدة في فيجي (ImageJ).
  4. تحضير الصورة للتحليل:
    1. حدد الأداة البيضاوية . ارسم دائرة حول القابس.
    2. انقر فوق حذف على لوحة المفاتيح لجعل كل شيء داخل الدائرة أسود. ارسم دائرة حول حجرة الخلية. تأكد من أن جميع الأجسام الكروية داخل الدائرة.
  5. قم بتشغيل الماكرو لحساب الأجسام الكروية:
    1. انقر فوق المكونات الإضافية > سجل > الماكرو. انسخ نص الماكرو من الملف التكميلي 1 إلى المسجل.
    2. اضغط على إنشاء ، وسيتم فتح نافذة جديدة. اضغط على تشغيل لتحليل الصورة المفتوحة.
    3. سيتم فتح نافذة جديدة مع النتائج (العدد والمساحة الإجمالية ومتوسط الحجم والنسبة المئوية للمساحة).
  6. أغلق الصورة وكرر الخطوتين 4.4 و 4.5 لكل صورة تحتاج إلى عدد كروي. لمعالجة أسهل وأسرع ، احفظ الماكرو وقم بتشغيله بالنقر فوق المكونات الإضافية > ماكرو > تشغيل وحدد الماكرو المحفوظ.

5. تحديد Planimetric للمنطقة الكروية

ملاحظة: يظهر خط الأنابيب المبسط لتحديد المنطقة الكروية في الشكل 3B.

  1. التقط الصور كما هو موضح في الخطوة 3.5.
  2. قبل البدء ، قم بتعيين مقياس عالمي لقياس مساحة الأجسام الكروية.
    1. افتح في فيجي صورة بشريط مقياس مع التكبير المطلوب. حدد أداة الخط. ارسم فوق شريط المقياس (يجب أن يكون الخط بطول شريط المقياس).
    2. افتح تحليل > تعيين مقياس. اكتب مسافة المعرفة (يتم إدخال طول الخط تلقائيا في المسافة بالبكسل. تأكد من وضع علامة عالمي.
    3. اضغط على موافق. الآن تم تعيين المقياس للصورة التي سيتم تحليلها.
  3. لبدء التحديد المسطح، قم بتشغيل الماكرو (الملف التكميلي 2).
    1. انقر فوق معالجة > الدفعات > ماكرو. اختر المجلد الذي يحتوي على الصور المراد تحليلها. سيكون هذا المجلد هو الإدخال.
    2. اختر المجلد الذي تم إنشاؤه في الخطوة 5.3.1 كإخراج. عملية الضغط.
  4. كفحص للجودة ، قم بتقييم ما إذا كانت المنطقة الكروية المقاسة تتوافق مع الصورة الأصلية.
    ملاحظة: يستثني الماكرو الأجسام الكروية الموجودة على الحافة حيث يمكن قياس جزء فقط من الكرة الأرضية.

6. مجموعة من كرويات

ملاحظة: ينصح بشدة أن يتم جمع كرويات باستخدام نصائح تجويف واسعة للحفاظ على هيكل 3D الخاص بهم. يمكن إجراء التجميع باستخدام القابس الموجود في مقدمة المفاعل الحيوي (الشكل 2 أ).

قد يختلف حجم الكرات عند التجميع اعتمادا على خط الخلية ، وعدد الخلايا الأولية ، وعملية الانقسام (أيام في الثقافة ، وعدد الأجسام الكروية لكل مفاعل حيوي ، ونسبة الانقسام).

  1. لجمع الأجسام الكروية ، قم بإزالة 5 مل من الوسائط من المفاعل الحيوي عبر المنفذ العلوي باستخدام حقنة مقترنة بإبرة طويلة. تأكد من ترك الكائنات الكروية تغرق في المركز السفلي للمفاعل الحيوي (بالقرب من المنفذ السفلي).
  2. افتح المنفذ الأمامي واجمع الأجسام الكروية باستخدام طرف تجويف بعرض 1 مل. ضع الكرات الكروية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. أجهزة الطرد المركزي الكروية في 500 × غرام لمدة 5 دقائق وتجاهل الوسائط.
  3. اغسل الكرات ب 200 ميكرولتر من HBSS لإزالة FBS. أجهزة الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقائق وتجاهل الطاف.
  4. قم بتجميد الحبيبات الكروية بالنيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى المعالجة.

7. صلاحية الكرويات

ملاحظة: تم تحديد صلاحية الكرة الأرضية عن طريق قياس نشاط كيناز أدينيلات (AK) المنبعث من الخلايا التالفة (الشكل 4 أ). بسبب تدرج الانتشار ، يكون قياس AK فعالا عندما تكون الأجسام الكروية أصغر من 900 ميكرومتر في القطر12. إذا أصبحت الأجسام الكروية أكبر ، أو إذا كان هناك أي شك فيما يتعلق بقياس الجدوى ، فيمكن إجراء فحص ATP15.

  1. اجمع الطافي الكروي وانقل 20 ميكرولتر إلى صفيحة ذات جدران بيضاء ذات 96 بئرا (قاع مسطح واضح). أضف 100 ميكرولتر من كاشف الكشف عن كيناز أدينيلات إلى كل بئر وقم بالتجانس عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل.
  2. إزالة الفقاعات عن طريق الطرد المركزي في فراغ السرعة لمدة 2 دقيقة في RT. احتضان لوحات لمدة 20 دقيقة في RT.
  3. ضع اللوحة في مقياس الإنارة (قارئ اللوحة ، وضع التلألؤ) وابدأ البرنامج. اضبط المعلمات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للمجموعة.
    ملاحظة: في مقايسات صلاحية التلألؤ الحيوي ، يمكن استخدام خرج ضوء مقياس الإنارة المباشر (عادة RLUs) لحساب استجابة الخلية. نظرا لأن أدينيلات كيناز لن يتسرب إلا من الخلايا التي تعرضت سلامة خلاياها للخطر ، فمن الممكن تحقيق تحكم كلي في أدينيلات كيناز باستخدام كاشف التحلل.

8. استخراج البروتين

ملاحظة: يمثل الشكل 1B سير العمل لمعالجة الأجسام الكروية واستخراج البروتين.

  1. جمع كرويات (القسم 6) في اليوم 36. إعادة تعليق كرويات في 25 ميكرولتر من 5 ٪ SDS لتحلل الخلايا.
    1. بعد إضافة 5٪ SDS ، قم بتجانس الحبيبات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. في بعض الحالات عندما يكون من الصعب تحلل الكرات ، استخدم مدقة صغيرة.
  2. احتضان العينات ب 20 mM DTT لمدة 1 ساعة لتقليل البروتينات. تخلط عن طريق سحب السحب لأعلى ولأسفل.
  3. احتضان العينات مع 40 مليمتر يودواسيتاميد لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء إلى بروتينات الألكيلات. تخلط عن طريق سحب السحب لأعلى ولأسفل.
  4. أضف 12٪ محلول حمض الفوسفوريك (10x) إلى العينات بتركيز نهائي قدره 1.2٪.
  5. تمييع العينات في ستة مجلدات من العازلة ملزمة وتخلط بلطف.
  6. قم بتحميل العينة إلى لوحة مرشح S-Trap وقم بتدويرها لأسفل عند 500 × جم لمدة 30 ثانية.
    ملاحظة: إذا تجاوز الحجم الإجمالي للعينة في الخطوة 8.4 سعة حجم العمود، فقم بتحميل العينات على دفعات وكرر الخطوة 8.6 حتى يتم تمرير كل شيء عبر العمود.
  7. اغسل العينات مرتين باستخدام 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط. بعد كل غسلة ، قم بتدويرها لأسفل عند 500 × جم لمدة 30 ثانية وتجاهل التدفق من خلالها.
  8. احتضان العينات ب 1 ميكروغرام من التربسين بدرجة التسلسل المخفف في 50 مللي متر بيكربونات الأمونيوم طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يوصى باستخدام 20 ميكروغرام على الأقل من البروتين كمواد أولية لتحليل البروتين الشامل. لهذا ، 1 ميكروغرام من التربسين هي الكمية المثالية للهضم الفعال. قم بإزالة أي فقاعات بين المخزن المؤقت وسرير العمود.
  9. قم ببتيدات Elute مع 40 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 50 mM وتجمع في نفس أنبوب التجميع.
  10. تدور لأسفل عند 500 × جم لمدة 30 ثانية. قم ببتيدات Elute مع 40 ميكرولتر من 0.1٪ TFA وقم بتجميعها في نفس أنبوب التجميع.
  11. تدور لأسفل عند 500 × جم لمدة 30 ثانية. قم بالتخلص من الببتيدات ب 40 ميكرولتر من 60٪ أسيتونيتريل و 0.1٪ TFA وقم بتجميعها في نفس أنبوب التجميع.
  12. تدور لأسفل عند 500 × جم لمدة 30 ثانية. يشطف التجميع الجاف في فراغ السرعة ويخزن العينات عند -80 درجة مئوية حتى المعالجة.

9. تنظيف العينة

ملاحظة: قبل الشروع في تحليل البروتينات ، من الضروري إزالة الملح الموجود في العينات. يمكن أن تتداخل الأملاح مع تحليل قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة عالي الأداء (HPLC-MS) لأنها تتأين أثناء الرش الكهربائي ، مما يؤدي إلى قمع الإشارة من الببتيدات. تم إثبات الإعداد لإزالة الأملاح المستخدمة في هذه الدراسة سابقا من قبل جوزيف شودري وزملائه16.

  1. قبل البدء ، تأكد من وجود لوحة تجميع نظيفة مكونة من 96 بئرا لتجميع التدفق من خلال الخطوات التالية. امزج راتنج C18 (50 مجم / مل في 100٪ أسيتونيتريل) على لوحة تحريك مغناطيسية.
  2. أضف 70 ميكرولتر من معلق الراتنج C18 لكل بئر من لوحة المرشح ذات 96 بئرا ، وقم بذلك بسرعة لضمان عدم تجمع راتنج C18 في الجزء السفلي من الماصة.
  3. قم بتشغيل المكنسة الكهربائية برفق لمنع الرش. تخلص من التدفق الذي تم جمعه على لوحة التجميع المكونة من 96 بئرا.
  4. اغسل الراتنج ب 100 ميكرولتر من 0.1٪ TFA. قم بتشغيل المكنسة الكهربائية برفق لمنع تناثر العينات وخلطها وتجاهل التدفق من خلالها.
  5. أعد تعليق كل عينة في 100 ميكرولتر من 0.1٪ TFA. تحقق وتأكد من أن الرقم الهيدروجيني بين 2-3.
  6. قم بتحميل كل عينة في كل بئر من لوحة المرشح. قم بتشغيل المكنسة الكهربائية برفق لمنع تناثر العينات وخلطها وتجاهل التدفق من خلالها.
  7. يغسل مع 100 ميكرولتر من 0.1 ٪ TFA. قم بتشغيل المكنسة الكهربائية برفق لمنع تناثر العينات وخلطها. تجاهل التدفق من خلال.
  8. استبدل لوحة التجميع المكونة من 96 بئرا بلوحة جديدة مكونة من 96 بئرا لجمع العينات منزوعة الملوحة.
  9. أضف 60 ميكرولتر من الأسيتونيتريل / 0.1٪ TFA لكل بئر. لإزالة العينات من راتنج C18 ، قم بتشغيل المكنسة الكهربائية برفق لمنع الرش.
  10. اجمع التدفق وجففه في فراغ السرعة في RT. انتقل إلى LC-MS / MS أو قم بتخزين اللوحة في -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لمعالجة العينات.

10. تحليل البروتيوميات عبر الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي

ملاحظة: لتوليد البيانات لهذه المخطوطة ، تم استخدام نظام nLC-MS / MS مع إعداد نظام ثنائي العمود مع عمود مصيدة 300 ميكرومتر × 0.5 سم C18 ومعرف 75 ميكرومتر × 25 سم C18-AQ (3 ميكرومتر) عمود نانو تحليلي معبأ داخليا.

  1. قم بإعداد المراحل المتنقلة للتشغيل على HPLC:
    المرحلة أ المتنقلة (MPA): 0.1٪ حمض الفورميك في المياه من فئة HPLC
    المرحلة B المتنقلة (MPB): 0.1٪ حمض الفورميك في الأسيتونيتريل من فئة HPLC
  2. قم ببرمجة طريقة HPLC على النحو التالي: 4٪ -34٪ MPB أكثر من 120 دقيقة ، 34٪ -90٪ MPB أكثر من 5 دقائق ، متساوي 90٪ MPB أكثر من 5 دقائق ؛ معدل التدفق: 300 نانولتر / دقيقة.
  3. قم بإعداد طريقة اكتساب MS لإجراء اكتساب مستقل للبيانات (DIA) لإنشاء أطياف MS / MS لإشارات الببتيد المكتشفة.
  4. أعد تعليق 1 ميكروغرام من العينات في 10 ميكرولتر من 0.1٪ TFA قبل وضع العينات في جهاز أخذ العينات الأوتوماتيكي nLC.
  5. قم بتشغيل طريقة nLC-MS كما هو مبرمج لاكتساب البروتينات المتعارف عليها:
    1. اضبط مسح MS الكامل على 300-1100 م / ض في orbitrap ، بدقة 120,000 (عند 200 م / ض) وهدف التحكم التلقائي في الكسب (AGC) 125.
    2. اضبط MS / MS في orbitrap مع نافذة عزل متسلسلة تبلغ 50 م / ض مع هدف AGC يبلغ 400 وطاقة تفكك تصادمي أعلى طاقة (HCD) تبلغ 30.

11. تحليل البيانات

  1. قم باستيراد ملفات البيانات الأولية nLC-MS/MS إلى برنامج اكتشاف الذروة المتوافق مع نظام MS الأساسي المستخدم.
  2. حدد قاعدة البيانات المناسبة (الإنسان ، الماوس ، إلخ).
  3. تعيين أستلة N-terminal كتعديل متغير وكارباميدو ميثيل السيستين كتعديل ثابت.
  4. حدد التربسين باعتباره الإنزيم الهضمي مع السماح بانقسامين مفقودين.
  5. اضبط تحمل الكتلة وفقا لمحلل الكتلة المستخدم في اكتساب الأطياف.
  6. تصدير التحليل كجدول بيانات ومعالجة البيانات بشكل أكبر حسب الحاجة.

النتائج

في هذا البروتوكول ، نصف خصائص حاضنة الخلايا ثلاثية الأبعاد المبتكرة الخالية من الإجهاد ، وهو نظام مصمم خصيصا لزراعة الأجسام الكروية ثلاثية الأبعاد (الشكل 2). قمنا بتحسين بروتوكول الزراعة ثلاثية الأبعاد لخطوط خلايا THLE-3 و HepG2 / C3A. البروتوكول الموصوف هنا سهل الاستخدام ويسمح بالتكاثر والاستزراع الفعال من حيث التكلفة لما > 100 كروي لكل مفاعل حيوي. مرة واحدة في المفاعل الحيوي ، يتم التعامل مع كرويات مماثلة للخلايا التي يتم الحفاظ عليها في ثقافة 2D. يتم تحقيق ظروف النمو المثلى من خلال تبادل الوسائط مرتين إلى ثلاث مرات في الأسبوع (الشكل 2 ب) وضبط سرعة الدوران وفقا لنمو وحجم الأجسام الكروية (الشكل 2ج). يوفر هذا النظام ، الذي يتم فيه استزراع كرويات ثلاثية الأبعاد في مفاعلات حيوية دوارة (الشكل 2E ، F) ، بيئة نمو مثالية للهياكل ثلاثية الأبعاد عن طريق تعريض كروي لكمية متساوية ومنخفضة جدا من قوة القص.

لقد أظهرنا سابقا كيف يمكن استخدام الأجسام الكروية لتحليل تعديل الكروماتين16. هنا ، نوضح بالتفصيل كيفية الحصول على كرويات الكبد وكيف يمكن إجراء تجارب البروتينات لتحليل البروتين الكامل (الشكل 1). باختصار ، بدأ البروتوكول باستخدام الخلايا المسطحة THLE-3 أو HepG2 / C3A حتى وصلت الثقافة إلى التقاء 80٪. لاستزراع الخلايا ككرويات ، تم طلاء ما يقرب من 2000 خلية في لوحة ربط منخفضة للغاية تحتوي على آبار دقيقة للسماح لها بالتجميع الذاتي ، ثم تم نقل كرويات مشكلة إلى مفاعل حيوي (الشكل 1 أ). على الرغم من أنها نشطة وظيفيا بعد 3 أسابيع في الثقافة ، كما هو موضح سابقا17 ، فإننا نعرض نتائج من كرويات تم جمعها بعد 36 يوما في الثقافة لهذا البروتوكول. بعد التجميع ، تم نسج الأجسام الكروية ، وتم تخزين كل من الحبيبات والمواد الطافية للتحليل. تم تقييم صلاحية الخلية من المادة الطافية لتحديد كمية كيناز أدينيلات المنبعثة من الخلايا التالفة ، كما هو موضح سابقا17. تم استخراج البروتينات الخلوية من حبيبات الخلية ، وتم تحليل البروتين الكامل بواسطة قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (الشكل 1 ب).

يوضح هذا البروتوكول أيضا طريقة شبه آلية لحساب الأجسام الكروية (الشكل 3A) باستخدام برنامج معالجة الصور العامة FIJI (Fiji Is Just ImageJ)18. يجب التقاط صورة جيدة للكروية للتحليل ، ويجب مراعاة بعض المعلمات كما هو مذكور في القسم 5. ثم ، بعد إعداد الصورة للتحليل ، يتم استخدام برنامج نصي ماكرو (الملف التكميلي 1) لحساب الأجسام الكروية. يعمل الماكرو عن طريق إنشاء مجلد يسمى FIJI Spheroids counting أولا ، داخل المجلد حيث توجد الصور الكروية. في هذا المجلد ، يتم حفظ جميع المعلومات من التحليل ؛ يتضمن ذلك صورة للكرويات التي تم عدها ، مع رقم معرف على كل كروي. يتضمن أيضا ملف Excel يسمى العد الكروي. يحتوي هذا الملف على منطقة البكسل ورقم الهوية لكل كروي تم حسابه. يتم تقديم البيانات المقابلة لصورة واحدة تم تحليلها في كل علامة تبويب من الملف. يتم تسمية علامة التبويب وفقا لاسم الصورة التي تم تحليلها. نظرا لأن حجم الكرة يمكن أن يضعف بسبب العديد من العوامل ، بما في ذلك عدد الهياكل داخل الوعاء والعلاج بالعقاقير ، فمن المهم أيضا مراقبة مساحة سطحها (قياس المسطح). يعمل نص الماكرو المعروض هنا (الملف التكميلي 2) عن طريق قياس المناطق السوداء ، والتي تتوافق مع الكروية في الصورة (الشكل 3B). يتم جمع المخرجات في ملف يسمى planimetry.xlsx ، والذي يحتوي على المساحة المقاسة والمحيط وقطر كل كروية. هناك أيضا قياس يسمى Feret ، يستخدم لحساب القطر. النمس هو أطول قطر ممكن ، في حين أن minFeret هو الأقصر. القطر هو متوسط هذين. داخل مجلد الإخراج ، إلى جانب ملف .xlsx القياس ، توجد أيضا صورة للكرويات التي تم قياسها.

قبل الشروع في تحليل البروتين ، تم تقييم صلاحية الكائنات الكروية على مدار وقت الثقافة. تزداد مستويات AK حتى اليوم 17 ، لتصل إلى ما يقرب من 7٪ من موت الخلايا ، ثم تنخفض الوفيات إلى مستويات أقل من 5٪ (الشكل 4A) ، وهو ما يتوافق مع العمل المنشورسابقا 17. يوضح هذا البروتوكول أيضا تحليل البروتين الكامل لمراقبة النمط الظاهري للخلية. أولا ، تمت مقارنة البروتينات من الخلايا المسطحة THLE-3 و HepG2 / C3A والكروية. من خلال تحليل المكون الرئيسي الأول (PC1) ، من الواضح أن هناك فصلا صارما لعينات كروية من ثقافات الخلايا المسطحة ، ويبدو أن ارتباط نوع الخلية (THLE-3 و HepG2 / C3A) غير ذي صلة (الشكل 4B). على الرغم من أن الأجسام الكروية THLE-3 و HepG2 / C3A لا تتجمع معا ، إلا أنها تشترك في ملفات تعريف متشابهة تتفق مع وظائف الكبد. نوضح في هذا البروتوكول مثال الميتالوثيونين ، الذي له دور في إزالة السموم المعدنية التي يقوم بها الكبد. حددنا في تحليل البروتينات 2 أشكال متساوية يتم التعبير عنها بشكل مفرط في كرويات مقارنة بالخلايا المسطحة (MT1E و MT1X) (الشكل 4C). نعرض أيضا إثراء علم الوجود الجيني (GO) لكلا خطي الخلايا المزروعين ككرويات. عملية التمثيل الغذائي للكربوهيدرات ، والتي تشمل دورة حمض الكربوكسيل (دورة TCA) ، وسلسلة نقل الإلكترون (التنفس الخلوي) ، واستقلاب البيروفات ، هي مصطلح متكرر ويتم إثرائه في كل من الكرات HepG2 / C3A و THLE-3 (الشكل 4D ، E). إزالة السموم الخلوية والأحماض الدهنية واستقلاب الكوليسترول هي وظائف أخرى غنية في كل من الأجسام الكروية. معا ، من المعروف أن هذه الوظائف ضرورية لوظيفة الكبد.

figure-results-5343
الشكل 1: سير عمل لاستزراع الكائنات الكروية وإعداد العينة . (أ) النهج التجريبي لزراعة الخلايا 3D. تم زرع مزارع الخلايا المسطحة عند نقطة الالتقاء المرغوبة وزرعها على صفيحة بئر 24 منخفضة للغاية تحتوي على آبار دقيقة ، حيث تتجمع الخلايا ذاتيا في كرويات. بعد 24 ساعة ، تم نقل الأجسام الكروية إلى مفاعل حيوي وزراعتها حتى تصبح جاهزة للتحليل. (ب) بعد الجمع ، تم تكوير الحبيبات وتم تخزين كل من الحبيبات الطافية للاستزراع حتى المعالجة. تم استخراج الهستونات16والبروتينات غير الهستونية وهضمها في الببتيدات وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة عالي الدقة. تم البحث في الملفات الخام التي تم الحصول عليها من قياس الطيف الكتلي مقابل قاعدة البيانات البشرية ، وتمت معالجة البيانات بشكل أكبر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6407
الشكل 2: نظام زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. أ: أجزاء المفاعل الحيوي. يتكون المفاعل الحيوي من غرفة تبادل الغازات والترطيب التي تحتوي على حبات الماء وغرفة خلية قابلة للفتح مع قابسين لتبادل الوسائط وجمع المواد الكروية. (ب) تبادل وسائط المفاعلات الأحيائية. يمتلئ المفاعل الحيوي ب 10 مل من وسائط النمو باستخدام حقنة بإبرة. (ج) تطبيق التحكم في النظام. يمكن التحكم في سرعة الدوران ومستوى CO2 ودرجة الحرارة وسجل الإنذار والوظائف الأخرى باستخدام وحدة التحكم. د: وضع المفاعل الحيوي في حاضنة 3D. يحتوي كل مفاعل حيوي على محرك مرتبط يمكنه تدوير المفاعل الحيوي ببطء. (ه) مفاعل حيوي في حركة بسرعة (rpm) يتحكم فيها قرص (C). يتم ضبط السرعة (دورة في الدقيقة) وفقا لحجم الكائنات الكروية. (F) المفاعلات الحيوية داخل حاضنة de 3D. يمكن أن تتسع حاضنة 3D لما يصل إلى 6 مفاعلات حيوية يتم التحكم فيها بشكل فردي. الصورة مقدمة من جيسون توريس للتصوير الفوتوغرافي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7706
الشكل 3: توصيف النمط الظاهري للكرويات عن طريق التقاط الصور. أ: عدد الأجسام الكروية شبه الآلية. بعد أخذ لقطات من الأجسام الكروية في المفاعل الحيوي ، يتم إعداد الصورة للتحليل في فيجي. يتم حساب كل كروي ، ويتم توفير رقم معرف لكل منهم. يتم استخدام ماكرو ، ويتم عرض النتائج التي تعرض معرف الكروي الذي تم عده ، والتسمية (اسم الصورة التي تم تحليلها) ، والمنطقة (عدد وحدات البكسل التي تم حسابها في الكروية). ب: التحديد الطوي للمنطقة الكروية. باستخدام ماكرو ، يتم تحديد مساحة ومحيط وقطر كروي معين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8569
الشكل 4: تحليل البروتيوم للكرويات الكبدية. (أ) حسبت صلاحية الثيرويدات على أساس إطلاق كيناز أدينيلات (AK) على طاف الثقافة. النتائج هي وسيلة لتكرار نقاط البيانات ± SD. (B) تم إجراء تحليل المكون الرئيسي (PCA) لمقارنة بروتين الخلايا المسطحة والكروية THLE-3 و HepG2 / C3A. ج: الوفرة النسبية للفلوثيونين، وهي بروتينات يعبر عنها الكبد البشري. يتم تمثيل البيانات كوسيلة ± SEM. (د) تظهر الشبكة المجمعة وظيفيا إثراء GO للكرويات HepG2 / C3A و (E) الكرويات THLE-3 ، حيث يتم عرض تسمية المصطلح الأكثر أهمية لكل مجموعة فقط. تم إنشاء الشبكة باستخدام ClueGo19. يمثل حجم العقدة مصطلح أهمية الإثراء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: برنامج نصي ماكرو لحساب الكرة الأرضية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: ماكرو لتحديد البلانمترية الكروية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

إن فهم البيولوجيا وراء الهياكل الخلوية ثلاثية الأبعاد (3D) مهم للغاية للحصول على معرفة أكثر شمولا بوظائفها. هناك اهتمام متزايد باستخدام نماذج 3D لدراسة البيولوجيا المعقدة وإجراء فحص السمية. عند زراعة الخلايا في 3D ، يجب مراعاة العديد من العوامل ، بما في ذلك تقييم النمط الظاهري للنظام النموذجي. يعرف النمط الظاهري بأنه مجموعة من الخصائص التي يمكن ملاحظتها لكائن حي معين ، مثل التشكل والسلوك والخصائص الفسيولوجية والكيميائية الحيوية20.

في هذا البروتوكول ، نوضح كيف يمكن إجراء تجارب البروتينات من عدد قليل من الكائنات الكروية ويمكن استخدامها لمراقبة النمط الظاهري النموذجي للكبد. أصبح قياس الطيف الكتلي طريقة مطبقة على نطاق واسع لتوصيف الخلايا ثلاثية الأبعاد ، مما يسمح بالتحقيق في مجموعة متنوعة من الأسئلة البيولوجية 12،16،21،22. لإجراء تحليل شامل للبروتين ، يوصى باستخدام 20 ميكروغرام على الأقل من مادة بدء البروتين ، والتي يتم حقن 1 ميكروغرام منها في مطياف الكتلة. من المهم الإشارة إلى أن إضافة عينة أقل قد يؤدي إلى فقدان الحساسية ، وإضافة المزيد من شأنه أن يؤدي تدريجيا إلى تدهور جودة اللوني ويؤدي في النهاية إلى سد العمود. في هذه الدراسة ، أظهرنا أن الأجسام الكروية HepG2 / C3A و THLE-3 غنية ببروتينات مهمة من تحلل السكر ودورة TCA ، وهي مسارات كبدية محددة وضرورية للحفاظ على مستويات الجلوكوز في الدم ولإنتاج الطاقة23,24. في الواقع ، لا يوفر تحليل قياس الطيف الكتلي معلومات على مستوى البروتين فحسب ، بل يسمح أيضا بالتحقيق في تعديلات البروتين بعد الترجمة ، كما هو موضح سابقا من قبل مجموعتنا16.

جانب آخر يجب مراعاته في دراسات النمط الظاهري 3D هو عدد وحجم الأجسام الكروية. إلى جانب جعل التجارب أكثر قابلية للتكرار ، فإن حساب عدد الأجسام الكروية وتحديد حجمها أمر ضروري لتحديد وقت تقسيم الثقافة إلى مفاعلات حيوية متعددة ، حيث أن عدد هياكل 3D داخل الوعاء يمكن أن يؤثر على حجم الكائنات الكروية ومستويات النشاط الأيضي. ومع ذلك ، من المهم تسليط الضوء على أن عدد وحجم الأجسام الكروية يعتمدان على خط الخلية ، وعدد الخلايا الأولية ، وعملية الانقسام ، ووقت التجميع. تم توفير تفاصيل الثقافة الكروية HepG2 / C3A ، مثل عدد الخلايا لكل كروية ، ومحتوى البروتين ، والحجم كدالة للعمر ، بواسطة Fey و Korzeniowska و Wrzesinski25. للحصول على تحليل دقيق وناجح باستخدام الطريقة شبه الآلية الموضحة هنا ، فإن الخطوة الأكثر أهمية هي صورة كروية جيدة. من أجل البساطة ، يمكن التقاط الصورة بهاتف أو جهاز لوحي ، ولكن يجب أن تظل دقتها عالية قدر الإمكان. نظرا لسرعة الحصول على الصور ، فإنها تسمح لتجارب الفحص واسعة النطاق بتصور ميزات النمط الظاهري المحددة أو التحقيق في الاستجابات للعلاج بالعقاقير. لذلك ، نظرا للعدد المتزايد من المقايسات القائمة على الخلايا ، تم تطوير عدد من البرامج مفتوحة المصدر على مدى السنوات ال 10 الماضية لتحليل الصور26. في هذا البروتوكول ، نصف نظاما شبه آلي يستخدم برنامج FIJI18 لحساب وقياس حجم الأجسام الكروية. قدمنا نصوصا (أوامر برمجة بسيطة) لتحديد سلسلة من العمليات الخوارزمية التي يمكن تطبيقها على مجموعة الصور ، مما يجعل التحليل عملية سهلة وسريعة. ومع ذلك ، اعتمادا على خاصية كروية ، ينبغي استخدام القياس اليدوي. على سبيل المثال ، إذا كانت الأجسام الكروية شفافة للغاية ، فسيكون نص فيجي غير دقيق. بالمناسبة ، أحد أهم معايير هذه الطريقة للعمل هو انضغاط الأجسام الكروية. ستساهم هذه الخاصية في تباين ألوان أكثر تعزيزا بين الكرويات والخلفية ، وهو أمر ضروري لكي تكون الطريقة دقيقة.

باختصار ، إلى جانب تقديم منهجية لزراعة الكرات عالية التكاثر ، تم أيضا وصف نظام شبه آلي مقترن بتوصيف النمط الظاهري عبر التقاط الصور والبروتينات. نتوقع أن تصبح مجموعة الأدوات هذه لتحليل خلايا 3D أكثر قوة مع برنامج تحليل الصور الآلي الكامل ومقاييس الطيف الكتلي من الجيل التالي.

Disclosures

تعمل هيلي سيديغي فراندسن كعالمة أبحاث في CelVivo ApS ، منتجة نظام ClinoStar. كارولين ميكلسن طالبة دكتوراه صناعية تعمل في CelVivo ApS وتؤدي دراسة الدكتوراه في SDU ، أودنسه ، الدنمارك. جميع المؤلفين الآخرين ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

يعترف مختبر Sidoli بامتنان بمؤسسة أبحاث اللوكيميا (منحة أبحاث الباحث الجديد Hollis Brownstein) ، AFAR (جائزة Sagol Network GerOmics) ، Deerfield (جائزة Xseed) ، Relay Therapeutics ، Merck ، ومكتب مدير المعاهد الوطنية للصحة (1S10OD030286-01).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesBio-Rad2239480
10 mL syringeFisher Scientific1481754Luer lock tip, graduated to 12 mL
1000 µL wide bore pipet tipsFisher Scientific14222703
200 µL wide bore pipet tipsFisher Scientific14222730
96-well Orochem filter plateOrochem OF1100
96-well skirted plateAxygenPCR-96-FS-C
96-well vacuum manifoldMilliporeMAVM0960R
Ammonium bicarbonateSigmaA6141-25G
Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM)LonzaCC-3170
Cell culture grade waterCorning25-055-CV
ClinoReactorCelVivoN/ABioreactor for 3D cell culture
ClinoStar incubatorCelVivoN/ACO2 incubator for 3D cell culture
DTTSigmaD0632-5G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Fisher ScientificMT17205CV
Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwellsCorning4441
Fetal Bovine SerumFisher ScientificMT35010CV
Formic acidThermo28905
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Fisher ScientificMT21022CV
hEGFCorning354052
HERAcell vios 160iThermo51033557CO2 incubator for 2D cell culture
HPLC grade acetonitrileFisher ScientificA955-4
HPLC grade methanolFisher ScientificA452-1
HPLC grade waterFisher ScientificW5-4
IodoacetamideSigmaI1149-5G
L-glutamineFisher ScientificMT25015CI
Non-essential amino acidsFisher ScientificMT25025CI
Oasis HLB Resin 30 µmWaters186007549
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometerThermoIQLAAEGAAPFADBMBHQHigh resolution mass spectrometer
PAULA microscopeLeica
Penicillin-StreptomycinFisher ScientificMT3002CI
PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate readerPerkinElmer
pH paperHydrion93
PhosphoetanolamineSigmaP0503
Phosphoric acidFisher ScientificA260-500
Pipette gunEppendorfZ666467 (Milipore Sigma)
Refrigerated centrifugeThermo75-217-420
Reprosil-Pur resinMSWILR13.AQ.003120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 μM bead size
SDSBio-Rad1610301
Sequencing grade modified trypsinPromegaV511A
SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates)Thermo15308325Savant SPD1010
Sterile hoodThermo1375
Sterile serological pipettesFisher Scientific1367549
S-trapProtifiC02-micro-80
Syringe needle (18 G)Fisher Scientific148171003" length, 0.05" diameter
Trifluoroacetic acid (TFA)Thermo28904
Trypsin-EDTAGibco25300-054
VortexSigmaZ258415
Water bathFisher ScientificFSGPD10

References

  1. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
  2. Nirmalanandhan, V. S., Duren, A., Hendricks, P., Vielhauer, G., Sittampalam, G. S. Activity of anticancer agents in a three-dimensional cell culture model. Assay and Drug Development Technologies. 8 (5), 581-590 (2010).
  3. Erickson, I. E., Huang, A. H., Chung, C., Li, R. T., Burdick, J. A., Mauck, R. L. Differential maturation and structure-function relationships in mesenchymal stem cell- and chondrocyte-seeded hydrogels. Tissue Engineering Part A. 15 (5), 1041-1052 (2009).
  4. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10 (29), (2012).
  5. Liu, J., Abate, W., Xu, J., Corry, D., Kaul, B., Jackson, S. K. Three-dimensional spheroid cultures of A549 and HepG2 cells exhibit different lipopolysaccharide (LPS) receptor expression and LPS-induced cytokine response compared with monolayer cultures. Innate Immunity. 17 (3), 245-255 (2011).
  6. Khafaga, A. F., Mousa, S. A., Aleya, L., Abdel-Daim, M. M. Three-dimensional (3D) cell culture: a valuable step in advancing treatments for human hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 22 (1), 243 (2022).
  7. Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. The Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
  8. Sia, D., Llovet, J. M. Liver cancer: Translating '-omics' results into precision medicine for hepatocellular carcinoma. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (10), 571-572 (2017).
  9. Tang, J., et al. A three-dimensional cell biology model of human hepatocellular carcinoma in vitro. Tumour Biology. 32 (3), 469-479 (2011).
  10. van Zijl, F., Mikulits, W. Hepatospheres: Three dimensional cell cultures resemble physiological conditions of the liver. World Journal of Hepatology. 2 (1), 1-7 (2010).
  11. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  12. Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering(Basel, Switzerland). 5 (1), 22 (2018).
  13. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  14. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).
  15. Wrzesinski, K., Frandsen, H. S., Calitz, C., Gouws, C., Korzeniowska, B., Fey, S. J. Clinostat 3D cell culture: Protocols for the preparation and functional analysis of highly reproducible, large, uniform spheroids and organoids. Methods in Molecular Biology. 2273, 17-62 (2021).
  16. Joseph-Chowdhury, J. N., et al. Global level quantification of histone post-translational modifications in a 3D cell culture model of hepatic tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 183, 63606 (2022).
  17. Wrzesinski, K., Fey, S. J. After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver. Toxicology Research. 2, 123-135 (2013).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Bindea, G., et al. ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks. Bioinformatics. 25 (8), 1091-1093 (2009).
  20. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: The next challenge. Nature Reviews. Genetics. 11 (12), 855-866 (2010).
  21. Gonneaud, A., Asselin, C., Boudreau, F., Boisvert, F. M. Phenotypic analysis of organoids by proteomics. Proteomics. 17 (20), (2017).
  22. Avelino, T. M., et al. Mass spectrometry-based proteomics of 3D cell culture: A useful tool to validate culture of spheroids and organoids. SLAS Discovery. 27 (3), 167-174 (2022).
  23. Chiang, J., McManus, L. M., MitchellIn, R. N. . Liver physiology: Metabolism and Detoxification. Pathobiology of Human Disease. , 1770-1782 (2014).
  24. Begriche, K., Massart, J., Robin, M. A., Borgne-Sanchez, A., Fromenty, B. Drug-induced toxicity on mitochondria and lipid metabolism: Mechanistic diversity and deleterious consequences for the liver. Journal of Hepatology. 54 (4), 773-794 (2011).
  25. Fey, S. J., Korzeniowska, B., Wrzesinski, K. Response to and recovery from treatment in human liver-mimetic clinostat spheroids: a model for assessing repeated-dose drug toxicity. Toxicology Research. 9 (4), 379-389 (2020).
  26. Smith, K., et al. Phenotypic image analysis software tools for exploring and understanding big image data from cell-based assays. Cell Systems. 6 (6), 636-653 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

198 Clinostat THLE 3 HepG2 C3A

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved