JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة لتحديد مستقلبات 2،4-ثنائي برومو فينول في النباتات.

Abstract

يمكن أن تتعرض المحاصيل على نطاق واسع للملوثات العضوية ، لأن التربة هي بالوعة رئيسية للملوثات التي يتم التخلص منها في البيئة. وهذا يخلق تعرضا بشريا محتملا من خلال استهلاك الأغذية المتراكمة الملوثات. إن توضيح امتصاص واستقلاب الزينوبيوتيك في المحاصيل أمر ضروري لتقييم مخاطر التعرض الغذائي لدى البشر. ومع ذلك ، بالنسبة لمثل هذه التجارب ، يتطلب استخدام النباتات السليمة تجارب طويلة الأجل وبروتوكولات معقدة لإعداد العينات يمكن أن تتأثر بعوامل مختلفة. قد توفر مزارع الكالس النباتية جنبا إلى جنب مع قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (HRMS) حلا لتحديد دقيق وموفر للوقت لمستقلبات الكائنات الحية في النباتات ، حيث يمكن أن يتجنب التداخل من البيئة الدقيقة الميكروبية أو الفطرية ، وتقصير مدة العلاج ، وتبسيط تأثير المصفوفة للنباتات السليمة. تم اختيار 2،4-ثنائي برومو فينول ، وهو مثبط نموذجي للهب واضطراب الغدد الصماء ، كمادة نموذجية بسبب انتشاره على نطاق واسع في التربة وإمكانية امتصاصه من قبل النباتات. هنا ، تم إنشاء الكالس النباتي من بذور التعقيم وتعريضه لوسط استزراع معقم يحتوي على 2،4-ثنائي بروموفينول. أظهرت النتائج أنه تم تحديد ثمانية مستقلبات من 2،4-ثنائي بروموفينول في أنسجة الكالس النباتية بعد 120 ساعة من الحضانة. يشير هذا إلى أن 2،4-ثنائي بروموفينول تم استقلابه بسرعة في أنسجة الكالس النباتية. وبالتالي ، فإن منصة زراعة الكالس النباتية هي طريقة فعالة لتقييم امتصاص واستقلاب xenobiotics في النباتات.

Introduction

تم التخلص من عدد متزايد من الملوثات العضوية في البيئة بسبب الأنشطة البشريةالمنشأ 1,2 ، وتعتبر التربة بالوعة رئيسية لهذه الملوثات 3,4. يمكن أن تمتص النباتات الملوثات الموجودة في التربة ويحتمل أن تنتقل إلى كائنات ذات مستوى غذائي أعلى على طول سلاسل الغذاء ، عن طريق الدخول مباشرة إلى جسم الإنسان من خلال استهلاك المحاصيل ، مما يؤدي إلى التعرض غير المقصود 5,6. تستخدم النباتات مسارات مختلفة لاستقلاب xenobiotics لإزالة السموم7 ؛ من المهم توضيح عملية التمثيل الغذائي للأجانب ، لأنه يتحكم في المصير الفعلي للملوثات في النباتات. نظرا لأن المستقلبات يمكن أن تفرز عن طريق الأوراق (إلى الغلاف الجوي) أو الجذور ، فإن تحديد المستقلبات في المراحل المبكرة جدا من التعرض يوفر إمكانية اختبار عدد كبير من المستقلبات8. ومع ذلك ، تتطلب الدراسات التي تستخدم النباتات السليمة تجارب طويلة الأجل وبروتوكولات معقدة لإعداد العينات يمكن أن تتأثر بعوامل مختلفة.

لذلك ، تعد ثقافات الكالس النباتية بديلا جيدا لدراسة استقلاب الكائنات الحية في النبات ، حيث يمكنها تقصير وقت العلاج بشكل كبير. تستبعد هذه الثقافات التداخل الميكروبي والتحلل الكيميائي الضوئي ، وتبسط تأثير المصفوفة للنباتات السليمة ، وتوحد ظروف الزراعة ، وتتطلب جهدا تجريبيا أقل. تم تطبيق مزارع الكالس النباتية بنجاح كنهج بديل في الدراسات الأيضية للتريكلوسان9 ونونيل فينول10 وتيبوكونازول8. أظهرت هذه الدراسات أن أنماط التمثيل الغذائي في مزارع الكالس كانت مماثلة لتلك الموجودة في النباتات السليمة. تقترح هذه الدراسة طريقة لتحديد فعال ودقيق لمستقلبات xenobiotics في النباتات التي لا تحتوي على بروتوكولات معقدة وتستغرق وقتا طويلا. هنا ، نستخدم ثقافات الكالس النباتية مع قياس الطيف الكتلي عالي الدقة لتحليل المستقلبات ذات الإشارات منخفضة الكثافة11,12.

وتحقيقا لهذه الغاية، تعرضت معلقات الكالس للجزرة (Daucus carota var. sativus) إلى 100 ميكروغرام/لتر من 2،4-ثنائي برومو فينول لمدة 120 ساعة في شاكر عند 130 دورة في الدقيقة و 26 درجة مئوية. تم اختيار 2،4-ثنائي برومو فينول بسبب نشاطه الغدد الصماءالتخريبي 13 وحدوثه على نطاق واسع في التربة14. تم استخراج المستقلبات وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة عالي الدقة. يمكن للبروتوكول المقترح هنا التحقيق في التمثيل الغذائي في النبات لأنواع أخرى من المركبات العضوية التي يمكن أن تتأين.

Protocol

1. تمايز الكالس الجزرة

ملاحظة: الأوتوكلاف جميع المعدات المستخدمة هنا وإجراء جميع العمليات في طاولة عمل فائقة النظافة معقمة بالأشعة فوق البنفسجية.

  1. قم بتكثيف البذور عن طريق غمر بذور الجزر الموحدة (Daucus carota var. sativus) في ماء منزوع الأيونات عند 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعة.
  2. قم بتعقيم البذور الربيعية بنسبة 75٪ من الإيثانول لمدة 20 دقيقة ، ثم اشطفها ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات المعقم في ظروف معقمة.
  3. قم بتعقيم البذور بنسبة 20٪ H 2 O2لمدة 20 دقيقة ، واغسلها بالماء منزوع الأيونات المعقم ست مرات في ظل ظروف معقمة.
  4. تنبت البذور بشكل معقم عن طريق زرعها على وسط MS خال من الهرمونات (درجة الحموضة 5.8 ، معقم عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) يحتوي على 1٪ أجار جل ، وحضنها عند 26 درجة مئوية مع فترة ضوئية 16 ساعة (350 ميكرومول / م2ثانية) لمدة 15 يوما.
  5. الحصول على explants عن طريق قطع hypocotyl والنبتة من الشتلات إلى قطع صغيرة (0.5 سم).
  6. قم بتحويل النباتات إلى أطباق بتري (من اثنين إلى أربعة نباتات لكل طبق) تحتوي على 15-20 مل من وسط MS المعقم المكمل بأوكسيمون (2،4-حمض ثنائي كلورو فينوكسي أسيتيك ؛ 1 مجم / لتر) وفيتوكينين (6-بنزيلامينوبورين ؛ 0.5 مجم / لتر) تحت ظروف معقمة.
  7. احتضان النباتات في الظلام عند 26 درجة مئوية لمدة 3-4 أسابيع للحث على الكالس.
  8. افصل أنسجة الكالس (قطرها حوالي 1 سم) المتكونة من النباتات الأولية باستخدام مشرط معقم وملقط.
    ملاحظة: أنسجة الكالس المشكلة حديثا بيضاء إلى صفراء كريمية اللون وترتبط بشكل فضفاض بالنباتات الأولية.

2. 2،4-معالجة ثنائي بروموفينول

  1. قم بإذابة 1 ميكروغرام من 2،4-ثنائي بروموفينول في 10 مل من وسط MS السائل المعقم (التركيز النهائي ل 2،4-ثنائي بروموفينول هو 100 جزء في البليون ، درجة الحموضة 5.6-7.0).
  2. أضف 3 جم من الكالس الجزري الطازج (الخطوة 1.8) إلى قوارير زجاجية تحتوي على محلول 2،4-ثنائي بروموفينول المحضر (من الخطوة 2.1) في ظل ظروف معقمة. اعتبر هذا هو العلاج 2،4-ثنائي بروموفينول.
    ملاحظة: تم تعقيم القوارير الزجاجية وإغلاقها باستخدام فيلم البارافين.
  3. أدرج وسيطا ضابطا يحتوي على محلول 2،4-ثنائي برومو فينول فقط (محضر في الخطوة 2-1) لتقييم التحلل اللاأحيائي لثنائي برومو فينول 2،4.
  4. قم بتضمين عنصر تحكم فارغ يحتوي على الكالس الجزري فقط (لا يوجد محلول 2،4-ثنائي بروموفينول) للتحقق من أي تلوث محتمل.
    1. قم بإعداد عنصر التحكم الفارغ الذي يحتوي على الجزر عن طريق إضافة 3 جم من الكالس الجزري الطازج الذي تم جمعه فقط إلى 10 مل من وسط MS المعقم.
  5. احتضان المعالجة 2،4-ثنائي بروموفينول والضوابط المتوسطة والفارغة عند 130 دورة في الدقيقة و 26 درجة مئوية في الظلام في حاضنة لمدة 120 ساعة.
  6. قم بإزالة القوارير الزجاجية من الحاضنة لجمع العينات من المعالجة 2،4-ثنائي بروموفينول والضوابط بعد 120 ساعة من الحضانة.
    ملاحظة: تم تحضير جميع العينات في ثلاث نسخ.

3. إعداد عينة

  1. افصل الكالس بعناية عن وسط MS عن طريق الترشيح باستخدام مرشحات الألياف الزجاجية (0.45 ميكرومتر) لمعالجة 2،4-ثنائي بروموفينول والضوابط. جمع الكالس بعد الغسيل بالماء عالي النقاء ثلاث مرات.
  2. قم بتجميد الكالس الذي تم جمعه بالنيتروجين السائل ، ثم قم بتجانس الكالس الذي تم جمعه (0.2 جم) باستخدام مطحنة أنسجة عالية الإنتاجية عند 70 هرتز لمدة 3 دقائق.
  3. قم برفع الكالس المتجانس عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من 25 مجم / لتر بديل 4-n-NP-d4 مع حقنة زجاجية مجهرية ثم دوامة لمدة 1 دقيقة.
  4. قم بتنشيط العينات ب 5 مل من الميثانول / الماء (1: 1 ، v / v) في جهاز الموجات فوق الصوتية (150 واط ، 40 كيلو هرتز) مملوء بالماء المثلج لمدة 30 دقيقة ، لاستخراج 2،4-ثنائي بروموفينول والمستقلبات.
  5. أجهزة الطرد المركزي المعلقات عند 8000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، وجمع المواد الطافية عن طريق الماصة.
    1. كرر عمليات الاستخراج لعينة الكالس ثلاث مرات وادمج المستخلصات.
  6. مرر المستخلصات من خلال خراطيش استخراج الطور الصلب المتوازن المحب للماء (HLB SPE) بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة.
    ملاحظة: تمت معالجة خراطيش HLB SPE بالتتابع باستخدام 6 مل من الميثانول و 6 مل من الماء لإزالة أي تداخلات.
  7. تخلص من المواد المراد تحليلها عن طريق تمرير 6 مل من الميثانول عبر خراطيش HLB SPE. بعد ذلك ، ركز المحلول الذي تم الحصول عليه إلى 1 مل تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين للتحليل الفعال.
  8. حقن 10 ميكرولتر من المزيلات الناتجة في UPLC-Q-TOF-MS لتحليل 2،4-ثنائي برومو فينول ومستقلباتها15.
    1. قم بتصفية جميع العينات بغشاء نايلون 0.22 ميكرومتر قبل التحليل الآلي.

4. التحليل الآلي

ملاحظة: أجريت تحليلات 2،4-ثنائي برومو فينول ومستقلباتها على كروماتوجراف سائل فائق الأداء (UPLC) بالاشتراك مع مطياف الكتلة micrOTOF-QII المجهز بالتأين بالرش الكهربائي (ESI) ، يعمل في وضع الأيونات الموجبة والسالبة.

  1. افتح باب سخان العمود وقم بتثبيت عمود UPLC عن طريق توصيل مدخل العمود بصمام الحقن ومخرج العمود بمدخل مطياف الكتلة.
    ملاحظة: استخدم عمود C18 (50 مم × 2.1 مم؛ حجم جسيمات 1.7 ميكرومتر) لفصل المواد المراد تحليلها عند 40 درجة مئوية.
  2. قم بتوصيل المرحلة المتنقلة A (الماء عالي النقاء) والمرحلة المتنقلة B (الميثانول من الدرجة اللونية) بالجهاز عن طريق إدخال نهاية أنابيب المذيبات A و B في زجاجات المذيبات المقابلة ، على التوالي.
    1. قم بتصفية جميع المراحل المتنقلة (500 مل لكل منها) من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر ، وصوتنة لأكثر من 30 دقيقة.
  3. في نافذة البرنامج ، انقر فوق أداة | طريقة المدخل لتحرير شروط الكروماتوجرام السائل.
    1. اضبط شروط التدرج للمرحلة المتنقلة B على النحو التالي: معدل تدفق قدره 1.0 مل / دقيقة ؛ 0-0.5 دقيقة ، 5٪ ؛ 0.5-3.5 دقيقة ، 5٪ إلى 50٪ ؛ 3.5-6.5 دقيقة ، 50٪ إلى 100٪ ؛ 6.5-7 دقائق ، 100٪ ؛ 7-10 دقائق ، 100٪ إلى 5٪.
    2. اضبط معدل حقن العينات في UPLC-Q-TOF-MS على أنه 0.2 مل / دقيقة.
      ملاحظة: تتم برمجة حقن العينة باستخدام جهاز أخذ عينات أوتوماتيكي بالكامل.
  4. في نافذة البرنامج ، حدد طريقة MS ثم قم بإعداد معلمات Q-TOF-MS: معدل تدفق غاز التجفيف (N2) 8 لتر / دقيقة ، درجة حرارة 300-350 درجة مئوية ؛ جهد شعري يبلغ 4500 فولت ؛ طاقة تصادم من 5-45 فولت ؛ ومجموعة مسح كاملة من 40-800 دا.
  5. ضع قوارير العينة في المواقع المقابلة لصواني العينات حسب الرقم التسلسلي، وأعد إدخال صواني العينات في حجرة العينة.
    ملاحظة: حافظ على صواني العينات مسطحة وتأكد من إغلاق باب حجرة العينة.
  6. في نافذة البرنامج، حدد ملف | جديد لإنشاء قاعدة بيانات. قم بتسمية قاعدة البيانات.
  7. قم بتحميل نموذج البرنامج الذي تم إنشاؤه أعلاه عن طريق تحديد MS File | ملف مدخل | حجم الحقن.
  8. احفظ قاعدة البيانات في المجلد النموذجي للمشروع بالنقر فوق ملف | حفظ.
  9. حدد تشغيل | ابدأ في النافذة الرئيسية للبرنامج، ثم حدد الحصول على بيانات نموذجية وانقر فوق موافق في نافذة بدء تشغيل قائمة العينة لجمع البيانات.
    ملاحظة: يمكن عرض مخطط كروماتوجرام في الوقت الفعلي بالنقر فوق كروماتوجرام | التحديث في الوقت الفعلي أثناء عملية الحصول على البيانات.
  10. قم بمعالجة البيانات في البرنامج عن طريق تحديد صف البيانات الهدف والنقر فوق نافذة Chromatogram لعرض مخطط كروماتوجرام مسح MS.
  11. في نافذة Chromatogram ، انقر فوق العرض | تيك | ScanWaveDS | إضافة أثر | موافق للحصول على ابنة مسح أطياف الكتلة.
  12. حدد المستقلبات من خلال مقارنة الكروماتوجرامات الخاصة بمعالجة 2،4-ثنائي برومو فينول والشواهد.
  13. توضيح المرشحين الأيض من خلال وقت الاحتفاظ والكتلة وأنماط التجزئة16,17.
    ملاحظة: يجب أن يكون خطأ دقة الكتلة بين قيم m/z التجريبية للأيونات الأم للمرشحين الأيضيين إلى النظرية المقابلة لها m/z أقل من 10 جزء في المليون.

النتائج

يوضح الشكل 1 خطوات البروتوكول. باتباع البروتوكول ، قارنا الكروماتوجرام لمستخلص الكالس الجزري من معالجة 2،4-ثنائي برومو فينول بالشواهد ، ووجدنا ثماني قمم متميزة موجودة في معالجة 2،4-ثنائي برومو فينول ولكنها غائبة في الضوابط (الشكل 2). يشير هذا إلى أن ما مجموعه ...

Discussion

تم تطوير هذا البروتوكول لتحديد التحول الحيوي للأجانب في النباتات بكفاءة. الخطوة الحاسمة لهذا البروتوكول هي ثقافة الكالس النباتي. الجزء الأصعب هو تمايز وصيانة الكالس النباتي ، لأن الكالس النباتي يصاب بسهولة ويتطور إلى أنسجة نباتية. لذلك ، من المهم التأكد من تعقيم جميع المعدات المستخدمة ، ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (21976160) ومشروع أبحاث تطبيق تكنولوجيا الرفاهية العامة بمقاطعة تشجيانغ (LGF21B070006).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2,4-dichlorophenoxyacetic acidWAKO1 mg/L
20% H2O2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10011218-500ML
4-n-NP, >99%Dr. Ehrenstorfer GmbH
4-n-NP-d4Pointe-Claire
6-benzylaminopurineWAKO0.5 mg/L
75% ethanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.1269101-500ML
7890A-5975 gas chromatographyAgilent
ACQULTY ultra-performance liquid chromatographyWaters
Amber glass vialsWaters
Artificial climate incubatorNingbo DongNan Lab Equipment Co.,LTDRDN-1000A-4
AutoclavesSTIKMJ-Series
C18 columnACQUITY UPLC BEH
CentrifugeThermo Fisher
DB-5MS capillary columnAgilent
DichloromethaneSigma-Aldrich40071190-4L
Freeze dryerSCIENTZ 
High-throughput tissue grinderSCIENTZ 
MethanolSigma-Aldrich
MicrOTOF-QII mass spectrometerBruker Daltonics
Milli-Q systemMilliporeMS1922801-4L
Murashige & Skoog mediumHOPEBIOHB8469-7
N-hexaneSigma-AldrichH109658-4L
Nitrogen blowing instrument AOSHENGMD200-2
NP isomers, >99%Dr. Ehrenstorfer GmbH
Oasis HLB cartridgesWaters60 mg/3 mL
Research plusEppendorf100-1000 µL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking IncubatorsShanghai bluepard instruments Co.,ltd.THZ-98AB
Solid phase extractorAUTO SCIENCE
Ultrasound machineZKIUC-6
UV-sterilized ultra-clean workbenchAIRTECH

References

  1. Chakraborty, P., et al. Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities. Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).
  2. Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments. Science of the Total Environment. 711, 135048 (2020).
  3. Xu, Y. W., et al. Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil. Chemosphere. 277, 130232 (2021).
  4. Cai, Q. Y., et al. Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).
  5. Wang, S. Y., et al. et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation. Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).
  6. Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).
  7. Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. Pesticide metabolism in plants and microorganisms. Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).
  8. Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).
  9. Macherius, A., et al. Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment. Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).
  10. Sun, J. Q., et al. Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation. Environmental Pollution. 270, 116064 (2021).
  11. Schymanski, E. L., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).
  12. Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study. Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).
  13. Ren, Z., et al. Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China. Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).
  14. de Wit, C. A. An overview of brominated flame retardants in the environment. Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).
  15. Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).
  16. Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures. Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).
  17. Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go. Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).
  18. Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens. Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).
  19. Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).
  20. Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environmental Science & Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved