Elucidación del metabolismo del 2,4-dibromofenol en plantas

Resumen

El presente protocolo describe un método simple y eficiente para la identificación de metabolitos de 2,4-dibromofenol en plantas.

Resumen

Los cultivos pueden estar ampliamente expuestos a contaminantes orgánicos, ya que el suelo es un sumidero importante para los contaminantes desechados en el medio ambiente. Esto crea una exposición humana potencial a través del consumo de alimentos acumulados con contaminantes. Esclarecer la absorción y el metabolismo de los xenobióticos en los cultivos es esencial para evaluar el riesgo de exposición alimentaria en los seres humanos. Sin embargo, para tales experimentos, el uso de plantas intactas requiere experimentos a largo plazo y protocolos complejos de preparación de muestras que pueden verse afectados por varios factores. Los cultivos de callos vegetales combinados con espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) pueden proporcionar una solución para la identificación precisa y rápida de metabolitos de xenobióticos en plantas, ya que pueden evitar la interferencia del microambiente microbiano o fúngico, acortar la duración del tratamiento y simplificar el efecto matriz de las plantas intactas. El 2,4-dibromofenol, un retardante de llama y disruptor endocrino típico, se eligió como sustancia modelo debido a su presencia generalizada en el suelo y a su potencial de absorción por las plantas. En este trabajo, el callo vegetal se generó a partir de semillas de asepsia y se expuso a un medio de cultivo estéril que contenía 2,4-dibromofenol. Los resultados mostraron que se identificaron ocho metabolitos de 2,4-dibromofenol en los tejidos de callos de la planta después de 120 h de incubación. Esto indica que el 2,4-dibromofenol se metabolizó rápidamente en los tejidos callosos de las plantas. Por lo tanto, la plataforma de cultivo de callos vegetales es un método eficaz para evaluar la absorción y el metabolismo de los xenobióticos en las plantas.

Introducción

Un número cada vez mayor de contaminantes orgánicos han sido descartados en el medio ambiente debido a las actividades antropogénicas ^1,2, y el suelo se considera un importante sumidero de estos contaminantes ^3,4. Los contaminantes del suelo pueden ser absorbidos por las plantas y potencialmente transferidos a organismos de nivel trófico superior a lo largo de las cadenas alimentarias, entrando directamente en el cuerpo humano a través del consumo de cultivos, lo que conduce a una exposición no intencionada ^5,6. Las plantas utilizan diferentes vías para metabolizar los xenobióticos para la desintoxicación⁷; Dilucidar el metabolismo de los xenobióticos es importante, ya que controla el destino real de los contaminantes en las plantas. Dado que los metabolitos pueden ser excretados por las hojas (a la atmósfera) o las raíces, la determinación de los metabolitos en las primeras fases de la exposición ofrece la posibilidad de analizar un número prolongado de metabolitos⁸. Sin embargo, los estudios con plantas intactas requieren experimentos a largo plazo y protocolos complejos de preparación de muestras que pueden verse afectados por diversos factores.

Los cultivos de callos vegetales, por lo tanto, son una buena alternativa para estudiar el metabolismo de los xenobióticos en planta, ya que pueden acortar en gran medida el tiempo de tratamiento. Estos cultivos excluyen la interferencia microbiana y la degradación fotoquímica, simplifican el efecto matriz de las plantas intactas, estandarizan las condiciones de cultivo y requieren menos esfuerzo experimental. Los cultivos de callos vegetales se han aplicado con éxito como un enfoque alternativo en estudios metabólicos de triclosán⁹, nonilfenol¹⁰ y tebuconazol⁸. Estos estudios mostraron que los patrones metabólicos en los cultivos de callos eran similares a los de las plantas intactas. Este estudio propone un método para la identificación eficiente y precisa de metabolitos de xenobióticos en plantas sin protocolos complejos y que requieren mucho tiempo. Aquí, utilizamos cultivos de callos vegetales en combinación con espectrometría de masas de alta resolución para el análisis de metabolitos con señales de baja intensidad^11,12.

Con este fin, las suspensiones de callos de zanahoria (Daucus carota var. sativus) se expusieron a 100 μg/L de 2,4-dibromofenol durante 120 h en un agitador a 130 rpm y 26 °C. Se eligió el 2,4-dibromofenol debido a su actividad endocrina disruptiva¹³ y su presencia generalizada en el suelo¹⁴. Los metabolitos fueron extraídos y analizados por espectrometría de masas de alta resolución. El protocolo aquí propuesto puede investigar el metabolismo in planta de otros tipos de compuestos orgánicos que pueden ser ionizados.

Protocolo

1. Diferenciación del callo de zanahoria

NOTA: Autoclave todo el equipo utilizado aquí y realice todas las operaciones en un banco de trabajo ultralimpio esterilizado por UV.

1. Vernalizar las semillas sumergiendo las semillas uniformes de zanahoria (Daucus carota var. sativus) en agua desionizada a 4 °C durante 16 h.
2. Esterilizar las semillas vernalizadas con etanol al 75% durante 20 minutos y luego enjuagar tres veces con agua desionizada estéril en condiciones asépticas.
3. Esterilizar las semillas con 20% de H 2 O₂durante 20 min, y lavarlas con agua desionizada esterilizada seis veces en condiciones asépticas.
4. Germinar asépticamente las semillas sembrándolas en un medio MS libre de hormonas (pH 5,8, esterilizado en autoclave a 121 °C durante 20 min) que contenga agar-gel al 1%, e incubando a 26 °C con un fotoperiodo de 16 h (350 μmol/m²s) durante 15 días.
5. Obtener los explantes cortando el hipocótilo y el cotiledón de las plántulas en trozos pequeños (0,5 cm).
6. Transformar los explantes en placas de Petri (de dos a cuatro explantes por placa) que contengan 15-20 mL de medio MS aséptico suplementado con auximona (ácido 2,4-diclorofenoxiacético; 1 mg/L) y fitoquinina (6-bencilaminopurina; 0,5 mg/L) en condiciones asépticas.
7. Incubar los explantes en la oscuridad a 26 °C durante 3-4 semanas para inducir el callo.
8. Separe los tejidos callosos (alrededor de 1 cm de diámetro) formados a partir de los explantes iniciales con un bisturí estéril y fórzas.
   NOTA: Los tejidos de callo recién formados son de color blanco a amarillo cremoso y se adhieren libremente a los explantes iniciales.

2. Tratamiento con 2,4-dibromofenol

1. Disolver 1 μg de 2,4-dibromofenol en 10 ml de medio MS líquido aséptico (la concentración final de 2,4-dibromofenol es de 100 ppb, pH 5,6-7,0).
2. Añadir 3 g del callo de zanahoria fresca (paso 1.8) en frascos de vidrio que contengan la solución preparada de 2,4-dibromofenol (a partir del paso 2.1) en condiciones asépticas. Considéralo como el tratamiento con 2,4-dibromofenol.
   NOTA: Los frascos de vidrio se esterilizaron en autoclave y se sellaron con una película de parafina.
3. Incluir un medio testigo que contenga únicamente la solución de 2,4-dibromofenol (preparada en el paso 2.1) para evaluar la degradación abiótica del 2,4-dibromofenol.
4. Incluya un control en blanco que contenga solo el callo de zanahoria (sin solución de 2,4-dibromofenol) para verificar si hay cualquier contaminación potencial.
   1. Prepare el control en blanco que contiene zanahoria agregando 3 g de callo de zanahoria recién recolectado solo en 10 ml de medio MS estéril.
5. Incubar el tratamiento con 2,4-dibromofenol y los controles medio y blanco a 130 rpm y 26 °C en la oscuridad en una incubadora durante 120 h.
6. Retire los matraces de vidrio de la incubadora para recoger las muestras del tratamiento con 2,4-dibromofenol y los controles después de 120 h de incubación.
   NOTA: Todas las muestras se prepararon por triplicado.

3. Preparación de la muestra

1. Separe cuidadosamente el callo del medio MS mediante filtración con filtros de fibra de vidrio (0,45 μm) para el tratamiento con 2,4-dibromofenol y los controles. Recoja el callo después de lavarlo con agua ultrapura tres veces.
2. Liofilizar el callo recogido con nitrógeno líquido y, posteriormente, homogeneizar el callo recogido (0,2 g) con una trituradora de tejidos de alto rendimiento a 70 Hz durante 3 min.
3. Pinchar el callo homogeneizado añadiendo 50 μL de 4-n-NP-d₄ sustituto de 25 mg/L con una microjeringa de vidrio y posteriormente vórtice durante 1 min.
4. Sonicar las muestras con 5 mL de metanol/agua (1:1, v/v) en un ultrasonido (150 W, 40 kHz) lleno de agua helada durante 30 min, para extraer el 2,4-dibromofenol y los metabolitos.
5. Centrifugar las suspensiones a 8.000 x g a 4 °C durante 10 min, y recoger los sobrenadantes mediante pipeteo.
   1. Repita los procesos de extracción de la muestra de callo tres veces y combine los extractos.
6. Pasar los extractos a través de cartuchos de extracción en fase sólida balanceada lipofílica hidrófila (HLB SPE) con un caudal de 1 mL/min.
   NOTA: Los cartuchos HLB SPE fueron pretratados secuencialmente con 6 mL de metanol y 6 mL de agua para eliminar cualquier interferencia.
7. Eluir los analitos pasando 6 mL de metanol a través de los cartuchos HLB SPE. A continuación, concentrar los eluyentes obtenidos a 1 mL bajo una suave corriente de nitrógeno gaseoso para su análisis instrumental.
8. Inyectar 10 μL de eluyentes resultantes en la UPLC-Q-TOF-MS para el análisis de 2,4-dibromofenol y sus metabolitos¹⁵.
   1. Filtrar todas las muestras con una membrana de nailon de 0,22 μm antes del análisis instrumental.

4. Análisis instrumental

NOTA: Los análisis de 2,4-dibromofenol y sus metabolitos se realizaron en un cromatógrafo líquido de ultra rendimiento (UPLC) en combinación con un espectrómetro de masas micrOTOF-QII equipado con ionización por electrospray (ESI), que funciona en modo de iones positivos y negativos.

1. Abra la puerta del calentador de columna e instale la columna UPLC conectando la entrada de la columna a la válvula de inyección y la salida de la columna a la entrada del espectrómetro de masas.
   NOTA: Se utilizó una columna C18 (50 mm x 2,1 mm; tamaño de partícula de 1,7 μm) para la separación de analitos a 40 °C.
2. Conecte la fase móvil A (agua ultrapura) y la fase móvil B (metanol de grado cromatográfico) al instrumento insertando el extremo de los tubos de disolvente A y B en las botellas de disolvente correspondientes, respectivamente.
   1. Filtre todas las fases móviles (500 ml para cada una) a través de un filtro de 0,22 μm y sonique durante más de 30 minutos.
3. En la ventana del software, haga clic en Instrumento | Método de entrada para editar las condiciones del cromatograma líquido.
   1. Establezca las condiciones de gradiente de la fase móvil B de la siguiente manera: un caudal de 1,0 ml/min; 0-0,5 min, 5%; 0,5-3,5 min, 5% a 50%; 3,5-6,5 min, 50% a 100%; 6,5-7 min, 100%; 7-10 min, del 100% al 5%.
   2. Ajuste la velocidad de inyección de las muestras en el UPLC-Q-TOF-MS como 0,2 ml/min.
      NOTA: La inyección de la muestra se programa utilizando un muestreador totalmente automático.
4. En la ventana del software, seleccione Método MS y luego configure los parámetros de Q-TOF-MS: un caudal de gas de secado (N₂) de 8 L/min, una temperatura de 300-350 °C; una tensión capilar de 4.500 V; una energía de colisión de 5-45 V; y un rango de escaneo completo de 40-800 Da.
5. Coloque los viales de muestra en las ubicaciones correspondientes de las bandejas de muestras por número de serie y vuelva a insertar las bandejas de muestras en la cámara de muestras.
   NOTA: Mantenga las bandejas de muestras planas y asegúrese de que la puerta de la cámara de muestras esté cerrada.
6. En la ventana de software, seleccione Archivo | Nuevo para crear una base de datos. Asigne un nombre a la base de datos.
7. Cargue el programa de ejemplo creado anteriormente seleccionando Archivo MS | Archivo de entrada | Inyectar volumen.
8. Guarde la base de datos en la carpeta de ejemplo del proyecto haciendo clic en Archivo | Guardar.
9. Seleccione Ejecutar | Comience en la ventana principal del software y, a continuación, seleccione Adquirir datos de ejemplo y haga clic en Aceptar en la ventana de la lista de ejemplo de inicio para recopilar datos.
   NOTA: El cromatograma en tiempo real se puede ver haciendo clic en Cromatograma | Actualización en tiempo real durante el proceso de adquisición de datos.
10. Procese los datos en el software seleccionando la fila de datos de destino y haciendo clic en la ventana Cromatograma para ver el cromatograma de MS Scan.
11. En la ventana Cromatograma , haga clic en Visualización | TIC | ScanWaveDS | Agregar seguimiento | OK para obtener los espectros de masas de barrido secundarios.
12. Identificar los metabolitos comparando los cromatogramas del tratamiento con 2,4-dibromofenol y los controles.
13. Dilucidar los candidatos a metabolitos por el tiempo de retención, la masa y los patrones de fragmentación^16,17.
    NOTA: El error de precisión de masa entre los valores experimentales m/z de los iones progenitores de los metabolitos candidatos a su correspondiente m/z teórico debe ser inferior a 10 ppm.

Resultados

Los pasos del protocolo se muestran en la Figura 1. Siguiendo el protocolo, comparamos el cromatograma del extracto de callo de zanahoria del tratamiento con 2,4-dibromofenol con los controles, y encontramos ocho picos distintos que están presentes en el tratamiento con 2,4-dibromofenol pero ausentes en los controles (Figura 2). Esto indica que un total de ocho metabolitos de 2,4-dibromofenol (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 y M187) se detectaron con ?...

Discusión

Este protocolo fue desarrollado para identificar eficientemente la biotransformación de xenobióticos en plantas. El paso crítico de este protocolo es el cultivo del callo de la planta. La parte más difícil es la diferenciación y el mantenimiento del callo de la planta, porque el callo de la planta se infecta fácilmente y se convierte en tejidos vegetales. Por lo tanto, es importante asegurarse de que todos los equipos utilizados estén esterilizados en autoclave y que todas las operaciones se realicen en condicion...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-dichlorophenoxyacetic acid	WAKO	1 mg/L
20% H2O2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10011218-500ML
4-n-NP, >99%	Dr. Ehrenstorfer GmbH
4-n-NP-d4	Pointe-Claire
6-benzylaminopurine	WAKO	0.5 mg/L
75% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	1269101-500ML
7890A-5975 gas chromatography	Agilent
ACQULTY ultra-performance liquid chromatography	Waters
Amber glass vials	Waters
Artificial climate incubator	Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD	RDN-1000A-4
Autoclaves	STIK	MJ-Series
C18 column	ACQUITY UPLC BEH
Centrifuge	Thermo Fisher
DB-5MS capillary column	Agilent
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	40071190-4L
Freeze dryer	SCIENTZ
High-throughput tissue grinder	SCIENTZ
Methanol	Sigma-Aldrich
MicrOTOF-QII mass spectrometer	Bruker Daltonics
Milli-Q system	Millipore	MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium	HOPEBIO	HB8469-7
N-hexane	Sigma-Aldrich	H109658-4L
Nitrogen blowing instrument	AOSHENG	MD200-2
NP isomers, >99%	Dr. Ehrenstorfer GmbH
Oasis HLB cartridges	Waters	60 mg/3 mL
Research plus	Eppendorf		100-1000 µL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)	Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators	Shanghai bluepard instruments Co.,ltd.	THZ-98AB
Solid phase extractor	AUTO SCIENCE
Ultrasound machine	ZKI	UC-6
UV-sterilized ultra-clean workbench	AIRTECH