Élucider le métabolisme du 2,4-dibromophénol chez les plantes

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode simple et efficace pour l’identification des métabolites du 2,4-dibromophénol chez les plantes.

Résumé

Les cultures peuvent être largement exposées aux polluants organiques, car le sol est un puits important pour les polluants rejetés dans l’environnement. Cela crée une exposition humaine potentielle par la consommation d’aliments polluants accumulés. L’élucidation de l’absorption et du métabolisme des xénobiotiques dans les cultures est essentielle pour l’évaluation du risque d’exposition alimentaire chez l’homme. Cependant, pour de telles expériences, l’utilisation de plantes intactes nécessite des expériences à long terme et des protocoles complexes de préparation d’échantillons qui peuvent être affectés par divers facteurs. Les cultures de callosités végétales combinées à la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) peuvent fournir une solution pour l’identification précise et rapide des métabolites des xénobiotiques dans les plantes, car elles peuvent éviter les interférences du microenvironnement microbien ou fongique, raccourcir la durée du traitement et simplifier l’effet de matrice des plantes intactes. Le 2,4-dibromophénol, un retardateur de flamme et un perturbateur endocrinien typique, a été choisi comme substance modèle en raison de sa présence répandue dans le sol et de son potentiel d’absorption par les plantes. Ici, des callosités végétales ont été générées à partir de graines d’asepsie et exposées à un milieu de culture stérile contenant du 2,4-dibromophénol. Les résultats ont montré que huit métabolites du 2,4-dibromophénol ont été identifiés dans les tissus calleux des plantes après 120 h d’incubation. Cela indique que le 2,4-dibromophénol a été rapidement métabolisé dans les tissus calleux des plantes. Ainsi, la plateforme de culture de callosités végétales est une méthode efficace pour évaluer l’absorption et le métabolisme des xénobiotiques chez les plantes.

Introduction

Un nombre croissant de polluants organiques ont été rejetés dans l’environnement en raison des activités anthropiques ^1,2, et le sol est considéré comme un puits important pour ces contaminants ^3,4. Les contaminants présents dans le sol peuvent être absorbés par les plantes et potentiellement transférés à des organismes de niveau trophique supérieur le long des chaînes alimentaires, en pénétrant directement dans le corps humain par la consommation des cultures, ce qui entraîne une exposition involontaire ^5,6. Les plantes utilisent différentes voies pour métaboliser les xénobiotiques à des fins de détoxification⁷ ; Il est important d’élucider le métabolisme des xénobiotiques, car ils contrôlent le devenir réel des contaminants dans les plantes. Comme les métabolites peuvent être excrétés par les feuilles (dans l’atmosphère) ou les racines, la détermination des métabolites dans les toutes premières phases de l’exposition offre donc la possibilité de tester un nombre étendu de métabolites⁸. Cependant, les études utilisant des plantes intactes nécessitent des expériences à long terme et des protocoles complexes de préparation d’échantillons qui peuvent être affectés par divers facteurs.

Les cultures de callosités végétales sont donc une bonne alternative pour étudier le métabolisme des xénobiotiques in planta, car elles peuvent réduire considérablement le temps de traitement. Ces cultures excluent les interférences microbiennes et la dégradation photochimique, simplifient l’effet matriciel des plantes intactes, standardisent les conditions de culture et nécessitent moins d’efforts expérimentaux. Les cultures de callosités végétales ont été appliquées avec succès comme approche alternative dans les études métaboliques du triclosan⁹, du nonylphénol¹⁰ et du tébuconazole⁸. Ces études ont montré que les schémas métaboliques dans les cultures de callosités étaient similaires à ceux des plantes intactes. Cette étude propose une méthode d’identification efficace et précise des métabolites des xénobiotiques chez les plantes sans protocoles complexes et chronophages. Ici, nous utilisons des cultures de callosités végétales en combinaison avec la spectrométrie de masse à haute résolution pour l’analyse des métabolites avec des signaux de faible intensité^11,12.

À cette fin, des suspensions de callosités de carotte (Daucus carota var. sativus) ont été exposées à 100 μg/L de 2,4-dibromophénol pendant 120 h dans un agitateur à 130 tr/min et à 26 °C. Le 2,4-dibromophénol a été choisi en raison de son activité endocrinienne perturbatrice¹³ et de sa présence répandue dans le sol¹⁴. Les métabolites ont été extraits et analysés par spectrométrie de masse à haute résolution. Le protocole proposé ici permet d’étudier le métabolisme in planta d’autres types de composés organiques qui peuvent être ionisés.

Protocole

1. Différenciation des callosités de la carotte

REMARQUE : Autoclaver tous les équipements utilisés ici et effectuer toutes les opérations dans un établi ultra-propre stérilisé aux UV.

1. Vernaliser les graines en immergeant les graines de carotte uniformes (Daucus carota var. sativus) dans de l’eau déminéralisée à 4 °C pendant 16 h.
2. Stérilisez les graines vernalisées en surface avec de l’éthanol à 75 % pendant 20 minutes, puis rincez-les trois fois avec de l’eau déminéralisée stérile dans des conditions aseptiques.
3. Stérilisez ensuite les graines avec 20 % de H2 O₂ pendant 20 min et lavez-les six fois avec de l’eau déminéralisée stérilisée dans des conditions aseptiques.
4. Faire germer les graines de manière aseptique en les semant sur un milieu MS sans hormones (pH 5,8, autoclavé à 121 °C pendant 20 min) contenant 1% d’agar-gel, et en incubant à 26 °C avec une photopériode de 16 h (350 μmol/m²s) pendant 15 jours.
5. Obtenir les explants en coupant l’hypocotyle et le cotylédon des plantules en petits morceaux (0,5 cm).
6. Transformer les explants en boîtes de Pétri (deux à quatre explants par boîte) contenant 15 à 20 mL de milieu MS aseptique complété par de l’auximone (acide 2,4-dichlorophénoxyacétique ; 1 mg/L) et de la phytokinine (6-benzylaminopurine ; 0,5 mg/L) dans des conditions aseptiques.
7. Incuber les explants dans l’obscurité à 26 °C pendant 3-4 semaines pour induire le durillon.
8. Séparez les tissus calleux (environ 1 cm de diamètre) formés à partir des explants initiaux à l’aide d’un scalpel stérile et d’une pince.
   REMARQUE : Les tissus calleux nouvellement formés sont de couleur blanche à jaune crème et s’attachent lâchement aux explants initiaux.

2. Traitement au 2,4-dibromophénol

1. Dissoudre 1 μg de 2,4-dibromophénol dans 10 mL de milieu MS liquide aseptique (la concentration finale de 2,4-dibromophénol est de 100 ppb, pH 5,6-7,0).
2. Ajouter 3 g de callosité de carotte fraîche (étape 1.8) dans des flacons en verre contenant la solution de 2,4-dibromophénol préparée (à partir de l’étape 2.1) dans des conditions aseptiques. Considérez cela comme le traitement au 2,4-dibromophénol.
   REMARQUE : Les flacons en verre ont été autoclavés et scellés à l’aide d’un film de paraffine.
3. Inclure un milieu témoin contenant uniquement la solution de 2,4-dibromophénol (préparée à l’étape 2.1) pour évaluer la dégradation abiotique du 2,4-dibromophénol.
4. Inclure un témoin vierge contenant uniquement le cal de la carotte (pas de solution de 2,4-dibromophénol) pour vérifier toute contamination potentielle.
   1. Préparer le témoin à blanc contenant la carotte en ajoutant 3 g de callosités de carottes fraîches récoltées seulement dans 10 mL de milieu MS stérile.
5. Incuber le traitement au 2,4-dibromophénol et les témoins à milieu et à blanc à 130 tr/min et 26 °C dans l’obscurité dans un incubateur pendant 120 h.
6. Retirer les flacons en verre de l’incubateur pour prélever les échantillons du traitement au 2,4-dibromophénol et des contrôles après 120 h d’incubation.
   REMARQUE : Tous les échantillons ont été préparés en trois exemplaires.

3. Préparation de l’échantillon

1. Séparez soigneusement le cal du milieu MS par filtration avec des filtres en fibre de verre (0,45 μm) pour le traitement au 2,4-dibromophénol et les témoins. Récupérez les callosités après les avoir lavées trois fois avec de l’eau ultra-pure.
2. Lyophiliser le cal collecté avec de l’azote liquide, puis homogénéiser le cal collecté (0,2 g) avec un broyeur de tissus à haut débit à 70 Hz pendant 3 min.
3. Augmenter le cal homogénéisé en ajoutant 50 μL de substitut 4-n-NP-d₄ à 25 mg/L à l’aide d’une microseringue en verre, puis en faisant tourner le vortex pendant 1 min.
4. Ponifier les échantillons avec 5 mL de méthanol/eau (1 :1, v/v) dans un ultrasonicateur (150 W, 40 kHz) rempli d’eau glacée pendant 30 min, pour en extraire le 2,4-dibromophénol et les métabolites.
5. Centrifuger les suspensions à 8 000 x g à 4 °C pendant 10 min et recueillir les surnageants par pipetage.
   1. Répétez trois fois les processus d’extraction de l’échantillon de callosité et combinez les extraits.
6. Faire passer les extraits dans des cartouches d’extraction en phase solide équilibrée lipophile (HLB SPE) avec un débit de 1 mL/min.
   REMARQUE : Les cartouches HLB SPE ont été prétraitées séquentiellement avec 6 mL de méthanol et 6 mL d’eau pour éliminer toute interférence.
7. Éluer les analytes en faisant passer 6 mL de méthanol à travers les cartouches HLB SPE. Ensuite, concentrer les éluants obtenus à 1 mL sous un léger jet d’azote gazeux pour l’analyse instrumentale.
8. Injecter 10 μL d’éluants résultants dans l’UPLC-Q-TOF-MS pour l’analyse du 2,4-dibromophénol et de leurs métabolites¹⁵.
   1. Filtrer tous les échantillons à l’aide d’une membrane en nylon de 0,22 μm avant l’analyse instrumentale.

4. Analyse instrumentale

NOTE : Les analyses du 2,4-dibromophénol et de leurs métabolites ont été réalisées sur un chromatographe liquide à ultra-performance (UPLC) en combinaison avec un spectromètre de masse micrOTOF-QII équipé d’une ionisation par électropulvérisation (ESI), fonctionnant en mode d’ions positifs et négatifs.

1. Ouvrez la porte de la colonne chauffante et installez la colonne UPLC en connectant l’entrée de la colonne à la vanne d’injection et la sortie de la colonne à l’entrée du spectromètre de masse.
   NOTE : Une colonne C18 (50 mm x 2,1 mm ; granulométrie de 1,7 μm) a été utilisée pour la séparation des analytes à 40 °C.
2. Connectez la phase mobile A (eau ultra-pure) et la phase mobile B (méthanol de qualité chromatographique) à l’instrument en insérant l’extrémité des tubes de solvant A et B dans les bouteilles de solvant correspondantes, respectivement.
   1. Filtrer toutes les phases mobiles (500 ml pour chacune) à travers un filtre de 0,22 μm et soniser pendant plus de 30 min.
3. Dans la fenêtre du logiciel, cliquez sur Instrument | Méthode d’entrée pour modifier les conditions du chromatogramme en phase liquide.
   1. Régler les conditions de gradient de la phase mobile B comme suit : un débit de 1,0 mL/min ; 0 à 0,5 min, 5 % ; 0,5 à 3,5 min, 5 % à 50 % ; 3,5 à 6,5 min, 50 % à 100 % ; 6,5 à 7 min, 100 % ; 7 à 10 min, 100 % à 5 %.
   2. Réglez le débit d’injection des échantillons dans l’UPLC-Q-TOF-MS sur 0,2 mL/min.
      REMARQUE : L’injection de l’échantillon est programmée à l’aide d’un échantillonneur entièrement automatique.
4. Dans la fenêtre du logiciel, sélectionnez Méthode MS puis paramétrez les paramètres de Q-TOF-MS : un débit de gaz desséchant (N₂) de 8 L/min, une température de 300-350 °C ; une tension capillaire de 4 500 V ; une énergie de collision de 5 à 45 V ; et une plage de balayage complète de 40 à 800 Da.
5. Placez les flacons d’échantillons aux emplacements correspondants des plateaux d’échantillons par numéro de série et réinsérez les plateaux d’échantillons dans la chambre d’échantillonnage.
   REMARQUE : Gardez les plateaux d’échantillons à plat et assurez-vous que la porte de la chambre d’échantillon est fermée.
6. Dans la fenêtre du logiciel, sélectionnez Fichier | Nouveau pour créer une base de données. Nommez la base de données.
7. Chargez l’exemple de programme créé ci-dessus en sélectionnant Fichier MS | Fichier d’entrée | Injecter du volume.
8. Enregistrez la base de données dans le dossier d’exemple du projet en cliquant sur Fichier | Sauvegarder.
9. Sélectionnez Exécuter | Démarrez dans la fenêtre principale du logiciel, puis sélectionnez Acquérir des exemples de données et cliquez sur OK dans la fenêtre de la liste d’exemples de démarrage exécutée pour collecter les données.
   REMARQUE : Le chromatogramme en temps réel peut être visualisé en cliquant sur Chromatogramme | Mise à jour en temps réel pendant le processus d’acquisition des données.
10. Traitez les données dans le logiciel en sélectionnant la ligne de données cible et en cliquant sur la fenêtre Chromatogramme pour afficher le chromatogramme MS Scan.
11. Dans la fenêtre Chromatogramme , cliquez sur Affichage | TIC | ScanWaveDS | Ajouter une trace | OK pour obtenir les spectres de masse de balayage fille.
12. Identifier les métabolites en comparant les chromatogrammes du traitement au 2,4-dibromophénol et des témoins.
13. Élucider les métabolites candidats par le temps de rétention, la masse et les modèles de fragmentation^16,17.
    NOTA : L’erreur de précision de masse entre les valeurs expérimentales de m/z des ions parents des métabolites candidats et leur m/z théorique correspondante doit être inférieure à 10 ppm.

Résultats

Les étapes du protocole sont illustrées à la figure 1. En suivant le protocole, nous avons comparé le chromatogramme de l’extrait de callosité de carotte du traitement au 2,4-dibromophénol aux témoins, et avons trouvé huit pics distincts qui sont présents dans le traitement au 2,4-dibromophénol mais absents chez les témoins (Figure 2). Cela indique qu’un total de huit métabolites du 2,4-dibromophénol (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 et ...

Discussion

Ce protocole a été développé pour identifier efficacement la biotransformation des xénobiotiques chez les plantes. L’étape critique de ce protocole est la culture du cal de la plante. La partie la plus difficile est la différenciation et le maintien du cal de la plante, car le cal de la plante est facilement infecté et développé en tissus végétaux. Par conséquent, il est important de s’assurer que tout l’équipement utilisé est autoclavé et que toutes les opérations sont effectuées dans des conditi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-dichlorophenoxyacetic acid	WAKO	1 mg/L
20% H2O2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10011218-500ML
4-n-NP, >99%	Dr. Ehrenstorfer GmbH
4-n-NP-d4	Pointe-Claire
6-benzylaminopurine	WAKO	0.5 mg/L
75% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	1269101-500ML
7890A-5975 gas chromatography	Agilent
ACQULTY ultra-performance liquid chromatography	Waters
Amber glass vials	Waters
Artificial climate incubator	Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD	RDN-1000A-4
Autoclaves	STIK	MJ-Series
C18 column	ACQUITY UPLC BEH
Centrifuge	Thermo Fisher
DB-5MS capillary column	Agilent
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	40071190-4L
Freeze dryer	SCIENTZ
High-throughput tissue grinder	SCIENTZ
Methanol	Sigma-Aldrich
MicrOTOF-QII mass spectrometer	Bruker Daltonics
Milli-Q system	Millipore	MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium	HOPEBIO	HB8469-7
N-hexane	Sigma-Aldrich	H109658-4L
Nitrogen blowing instrument	AOSHENG	MD200-2
NP isomers, >99%	Dr. Ehrenstorfer GmbH
Oasis HLB cartridges	Waters	60 mg/3 mL
Research plus	Eppendorf		100-1000 µL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)	Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators	Shanghai bluepard instruments Co.,ltd.	THZ-98AB
Solid phase extractor	AUTO SCIENCE
Ultrasound machine	ZKI	UC-6
UV-sterilized ultra-clean workbench	AIRTECH