Elucidando o metabolismo do 2,4-dibromofenol em plantas

Resumo

O presente protocolo descreve um método simples e eficiente para a identificação de metabólitos do 2,4-dibromofenol em plantas.

Resumo

As culturas podem ser extensivamente expostas a poluentes orgânicos, uma vez que o solo é um importante sumidouro de poluentes descartados no meio ambiente. Isso cria exposição humana potencial através do consumo de alimentos acumulados por poluentes. A elucidação da absorção e metabolismo de xenobióticos em culturas é essencial para a avaliação do risco de exposição dietética em humanos. No entanto, para tais experimentos, o uso de plantas intactas requer experimentos de longo prazo e protocolos complexos de preparação de amostras que podem ser afetados por vários fatores. Culturas de calos vegetais combinadas com espectrometria de massas de alta resolução (HRMS) podem fornecer uma solução para a identificação precisa e econômica de metabólitos de xenobióticos em plantas, pois pode evitar a interferência do microambiente microbiano ou fúngico, encurtar a duração do tratamento e simplificar o efeito de matriz de plantas intactas. O 2,4-dibromofenol, um retardante de chama típico e desregulador endócrino, foi escolhido como substância modelo devido à sua ampla ocorrência no solo e ao seu potencial de absorção pelas plantas. Neste trabalho, calos vegetais foram gerados a partir de sementes de assepsia e expostos a meio de cultura estéril contendo 2,4-dibromofenol. Os resultados mostraram que oito metabólitos do 2,4-dibromofenol foram identificados nos tecidos do calo vegetal após 120 h de incubação. Isso indica que o 2,4-dibromofenol foi rapidamente metabolizado nos tecidos do calo vegetal. Assim, a plataforma de cultura de calos vegetais é um método eficaz para avaliar a absorção e o metabolismo de xenobióticos em plantas.

Introdução

Um número crescente de poluentes orgânicos tem sido descartado no meio ambiente devido às atividades antrópicas ^1,2, sendo o solo considerado um importante sumidouro desses contaminantes ^3,4. Os contaminantes presentes no solo podem ser absorvidos pelas plantas e potencialmente transferidos para organismos de nível trófico superior ao longo das cadeias alimentares, entrando diretamente no corpo humano por meio do consumo das culturas, levando consequentemente à exposição não intencional ^5,6. As plantas utilizam diferentes vias para metabolizar xenobióticos para desintoxicação⁷; A elucidação do metabolismo dos xenobióticos é importante, pois controla o real destino dos contaminantes nas plantas. Como os metabólitos podem ser excretados pelas folhas (para a atmosfera) ou pelas raízes, a determinação dos metabólitos nas fases iniciais de exposição oferece a possibilidade de testar um número extenso de metabólitos⁸. No entanto, estudos utilizando plantas intactas requerem experimentos de longa duração e protocolos complexos de preparo de amostras que podem ser afetados por vários fatores.

As culturas de calos vegetais, portanto, são uma boa alternativa para estudar o metabolismo de xenobióticos em planta, pois podem encurtar muito o tempo de tratamento. Essas culturas excluem a interferência microbiana e a degradação fotoquímica, simplificam o efeito de matriz de plantas intactas, padronizam as condições de cultivo e requerem menor esforço experimental. Culturas de calos vegetais têm sido aplicadas com sucesso como uma abordagem alternativa em estudos metabólicos de triclosan⁹, nonilfenol¹⁰ e tebuconazol⁸. Esses estudos mostraram que os padrões metabólicos nas culturas de calos foram semelhantes aos das plantas intactas. Este trabalho propõe um método para a identificação eficiente e precisa de metabólitos de xenobióticos em plantas sem protocolos complexos e demorados. Neste trabalho, utilizamos culturas de calos vegetais em combinação com espectrometria de massas de alta resolução para a análise de metabólitos com sinais de baixa intensidade^11,12.

Para tanto, suspensões de calos de cenoura (Daucus carota var. sativus) foram expostas a 100 μg/L de 2,4-dibromofenol por 120 h em agitador a 130 rpm e 26 °C. O 2,4-dibromofenol foi escolhido devido à sua atividade endócrina disruptiva¹³ e ampla ocorrência no solo¹⁴. Os metabólitos foram extraídos e analisados por espectrometria de massas de alta resolução. O protocolo aqui proposto pode investigar o metabolismo in planta de outros tipos de compostos orgânicos que podem ser ionizados.

Protocolo

1. Diferenciação do calo de cenoura

NOTA: Autoclave todos os equipamentos utilizados aqui e realize todas as operações em uma bancada ultralimpa esterilizada por UV.

1. Vernalizar as sementes imergindo as sementes uniformes de cenoura (Daucus carota var. sativus) em água deionizada a 4 °C por 16 h.
2. Esterilizar superficialmente as sementes vernalizadas com etanol 75% por 20 min e, em seguida, enxaguar três vezes com água deionizada estéril em condições assépticas.
3. Esterilizar as sementes com 20% H 2 O₂por 20 min e lavá-las com água deionizada esterilizada seis vezes em condições assépticas.
4. Germinar assepticamente as sementes semeando-as em meio MS livre de hormônios (pH 5,8, autoclavado a 121 °C por 20 min) contendo ágar-gel a 1% e incubando a 26 °C com fotoperíodo de 16 h (350 μmol/m²s) por 15 dias.
5. Obter os explantes cortando o hipocótilo e o cotilédone das mudas em pequenos pedaços (0,5 cm).
6. Transformar os explantes em placas de Petri (dois a quatro explantes por prato) contendo 15-20 mL de meio MS asséptico suplementado com auximona (ácido 2,4-diclorofenoxiacético; 1 mg/L) e fitocinina (6-benzilaminopurina; 0,5 mg/L) em condições assépticas.
7. Incubar os explantes no escuro a 26 °C durante 3-4 semanas para induzir o calo.
8. Separe os tecidos do calo (cerca de 1 cm de diâmetro) formados a partir dos explantes iniciais utilizando bisturi estéril e pinças.
   NOTA: Os tecidos do calo recém-formado são de cor branca a amarelo cremoso e se fixam vagamente aos explantes iniciais.

2. Tratamento com 2,4-dibromofenol

1. Dissolver 1 μg de 2,4-dibromofenol em 10 mL de meio MS líquido asséptico (a concentração final de 2,4-dibromofenol é de 100 ppb, pH 5,6-7,0).
2. Adicionar 3 g do calo fresco de cenoura (passo 1.8) em frascos de vidro contendo a solução preparada de 2,4-dibromofenol (do passo 2.1) em condições assépticas. Considere isso como o tratamento com 2,4-dibromofenol.
   OBS: Os frascos de vidro foram autoclavados e selados com filme de parafina.
3. Incluir um meio de controlo contendo apenas a solução de 2,4-dibromofenol (preparada no passo 2.1) para avaliar a degradação abiótica do 2,4-dibromofenol.
4. Incluir um controlo em branco contendo apenas o calo de cenoura (sem solução de 2,4-dibromofenol) para verificar se existe qualquer contaminação potencial.
   1. Preparar o controle em branco contendo cenoura adicionando 3 g de calo de cenoura fresco coletado apenas em 10 mL de meio MS estéril.
5. Incubar o tratamento com 2,4-dibromofenol e os controles médio e branco a 130 rpm e 26 °C no escuro em estufa por 120 h.
6. Retirar os frascos de vidro da incubadora para coletar as amostras do tratamento com 2,4-dibromofenol e controles após 120 h de incubação.
   OBS: Todas as amostras foram preparadas em triplicata.

3. Preparo da amostra

1. Separe cuidadosamente o calo do meio MS por filtração com filtros de fibra de vidro (0,45 μm) para o tratamento com 2,4-dibromofenol e os controles. Recolher o calo após lavar com água ultrapura três vezes.
2. Liofilizar o calo coletado com nitrogênio líquido e, posteriormente, homogeneizar o calo coletado (0,2 g) com um moedor de tecido de alto rendimento a 70 Hz por 3 min.
3. Cravar o calo homogeneizado adicionando 50 μL de 25 mg/L substituto 4-n-NP-d₄ com uma microseringa de vidro e, subsequentemente, vórtice por 1 min.
4. Sonicar as amostras com 5 mL de metanol/água (1:1, v/v) em um ultrasonicator (150 W, 40 kHz) preenchido com água gelada por 30 min, para extrair 2,4-dibromofenol e os metabólitos.
5. Centrifugar as suspensões a 8.000 x g a 4 °C durante 10 min e recolher os sobrenadantes por pipetagem.
   1. Repita os processos de extração para a amostra de calo três vezes e combine os extratos.
6. Passar os extratos através de cartuchos de extração em fase sólida hidrofílica lipofílica balanceada (HLB SPE) com vazão de 1 mL/min.
   OBS: Os cartuchos de SPE do HLB foram pré-tratados sequencialmente com 6 mL de metanol e 6 mL de água para remover quaisquer interferências.
7. Eluir os analitos passando 6 mL de metanol pelos cartuchos HLB SPE. Em seguida, concentrar os eluentes obtidos para 1 mL sob uma corrente suave de gás nitrogênio para análise instrumental.
8. Injetar 10 μL dos eluentes resultantes no UPLC-Q-TOF-MS para análise do 2,4-dibromofenol e seus metabólitos¹⁵.
   1. Filtrar todas as amostras com uma membrana de nylon de 0,22 μm antes da análise instrumental.

4. Análise instrumental

NOTA: As análises do 2,4-dibromofenol e seus metabólitos foram realizadas em um cromatógrafo líquido de ultra-eficiência (UPLC) em combinação com um espectrômetro de massas micrOTOF-QII equipado com uma ionização por eletrospray (ESI), operando nos modos de íons positivos e negativos.

1. Abra a porta do aquecedor de coluna e instale a coluna UPLC conectando a entrada da coluna à válvula de injeção e a saída da coluna à entrada do espectrômetro de massa.
   NOTA: Uma coluna C18 (50 mm x 2,1 mm; tamanho de partícula de 1,7 μm) foi usada para a separação dos analitos a 40 °C.
2. Conecte a fase A móvel (água ultrapura) e a fase B móvel (metanol grau cromatografia) ao instrumento inserindo a extremidade dos tubos de solvente A e B nas garrafas de solvente correspondentes, respectivamente.
   1. Filtrar todas as fases móveis (500 mL para cada) através de um filtro de 0,22 μm e sonicar por mais de 30 min.
3. Na janela do software, clique em Instrumento | Método de entrada para editar as condições do cromatograma líquido.
   1. Definir as condições de gradiente da fase móvel B da seguinte forma: fluxo de 1,0 mL/min; 0-0,5 min, 5%; 0,5-3,5 min, 5% a 50%; 3,5-6,5 min, 50% a 100%; 6,5-7 min, 100%; 7-10 min, 100% a 5%.
   2. Ajuste a taxa de injeção das amostras no UPLC-Q-TOF-MS como 0,2 mL/min.
      NOTA: A injeção da amostra é programada usando um amostrador totalmente automático.
4. Na janela do software, selecione Método MS e, em seguida, configure os parâmetros de Q-TOF-MS: uma taxa de fluxo de gás de secagem (N₂) de 8 L/min, uma temperatura de 300-350 °C; uma tensão capilar de 4.500 V; uma energia de colisão de 5-45 V; e uma faixa de varredura completa de 40-800 Da.
5. Coloque os frascos para injetáveis de amostra nos locais correspondentes dos tabuleiros de recolha de amostras por número de série e volte a introduzir os frascos de amostras na câmara de amostras.
   NOTA: Mantenha os tabuleiros de amostra planos e certifique-se de que a porta da câmara de amostras está fechada.
6. Na janela do software, selecione Arquivo | Novo para criar um banco de dados. Nomeie o banco de dados.
7. Carregue o programa de exemplo criado acima selecionando Arquivo MS | Arquivo de entrada | Volume de Injetagem.
8. Salve o banco de dados na pasta de exemplo do projeto clicando em Arquivo | Salve.
9. Selecione Executar | Inicie na janela principal do software e, em seguida, selecione Adquirir dados de exemplo e clique em OK na janela da execução da lista de exemplo inicial para coletar dados.
   NOTA: O cromatograma em tempo real pode ser visualizado clicando em Cromatograma | Atualização em tempo real durante o processo de aquisição de dados.
10. Processe os dados no software selecionando a linha de dados de destino e clicando na janela Cromatograma para visualizar o cromatograma de varredura MS.
11. Na janela Cromatograma , clique em Exibir | TIC | ScanWaveDS - Brasil | Adicionar rastreamento | OK para obter a filha digitalizar espectros de massa.
12. Identificar os metabolitos comparando os cromatogramas do tratamento com 2,4-dibromofenol e os controlos.
13. Elucidar os candidatos a metabólitos pelos padrões de tempo de retenção, massa e fragmentação^16,17.
    NOTA: O erro de precisão de massa entre os valores m/z experimentais dos iões precursores dos candidatos a metabolito para o seu correspondente m/z teórico deve ser inferior a 10 ppm.

Resultados

As etapas do protocolo estão representadas na Figura 1. Seguindo o protocolo, comparamos o cromatograma do extrato de calo de cenoura do tratamento com 2,4-dibromofenol com os controles, e encontramos oito picos distintos que estão presentes no tratamento com 2,4-dibromofenol, mas ausentes nos controles (Figura 2). Isso indica que um total de oito metabólitos de 2,4-dibromofenol (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 e M187) foram detectados com sucesso no...

Discussão

Este protocolo foi desenvolvido para identificar eficientemente a biotransformação de xenobióticos em plantas. A etapa crítica deste protocolo é o cultivo do calo vegetal. A parte mais difícil é a diferenciação e manutenção do calo vegetal, pois o calo vegetal é facilmente infectado e desenvolvido para os tecidos vegetais. Portanto, é importante certificar-se de que todos os equipamentos utilizados sejam autoclavados e que todas as operações sejam realizadas em condições assépticas. A diferenciação e ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-dichlorophenoxyacetic acid	WAKO	1 mg/L
20% H2O2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10011218-500ML
4-n-NP, >99%	Dr. Ehrenstorfer GmbH
4-n-NP-d4	Pointe-Claire
6-benzylaminopurine	WAKO	0.5 mg/L
75% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	1269101-500ML
7890A-5975 gas chromatography	Agilent
ACQULTY ultra-performance liquid chromatography	Waters
Amber glass vials	Waters
Artificial climate incubator	Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD	RDN-1000A-4
Autoclaves	STIK	MJ-Series
C18 column	ACQUITY UPLC BEH
Centrifuge	Thermo Fisher
DB-5MS capillary column	Agilent
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	40071190-4L
Freeze dryer	SCIENTZ
High-throughput tissue grinder	SCIENTZ
Methanol	Sigma-Aldrich
MicrOTOF-QII mass spectrometer	Bruker Daltonics
Milli-Q system	Millipore	MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium	HOPEBIO	HB8469-7
N-hexane	Sigma-Aldrich	H109658-4L
Nitrogen blowing instrument	AOSHENG	MD200-2
NP isomers, >99%	Dr. Ehrenstorfer GmbH
Oasis HLB cartridges	Waters	60 mg/3 mL
Research plus	Eppendorf		100-1000 µL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)	Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators	Shanghai bluepard instruments Co.,ltd.	THZ-98AB
Solid phase extractor	AUTO SCIENCE
Ultrasound machine	ZKI	UC-6
UV-sterilized ultra-clean workbench	AIRTECH