식물에서 2,4-dibromophenol의 대사 해명

요약

본 프로토콜은 식물에서 2,4-디브로모페놀 대사산물을 식별하기 위한 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다.

초록

토양은 환경으로 버려지는 오염 물질의 주요 흡수원이기 때문에 작물은 유기 오염 물질에 광범위하게 노출될 수 있습니다. 이것은 오염 물질이 축적된 식품의 섭취를 통해 잠재적인 인체 노출을 만듭니다. 작물에서 생체이물의 흡수와 대사를 밝히는 것은 인간의 식이 노출 위험을 평가하는 데 필수적입니다. 그러나 이러한 실험을 위해 온전한 식물을 사용하려면 다양한 요인의 영향을 받을 수 있는 장기간의 실험과 복잡한 샘플 준비 프로토콜이 필요합니다. 고분해능 질량분석법(HRMS)과 결합된 식물 캘러스 배양은 미생물 또는 곰팡이 미세 환경의 간섭을 피하고 처리 기간을 단축하며 온전한 식물의 매트릭스 효과를 단순화할 수 있기 때문에 식물에서 생체 이물 대사 산물을 정확하고 시간 절약적으로 식별할 수 있는 솔루션을 제공할 수 있습니다. 전형적인 난연제 및 내분비 교란 물질인 2,4-디브로모페놀은 토양에서 널리 발생하고 식물에 의한 흡수 가능성으로 인해 모델 물질로 선택되었습니다. 본원에서, 식물 캘러스는 무균 종자로부터 생성되었고, 멸균된 2,4-디브로모페놀-함유 배양 배지에 노출되었다. 그 결과 배양 120시간 후 식물 캘러스 조직에서 2,4-디브로모페놀의 8개 대사산물이 확인된 것으로 나타났습니다. 이는 2,4-디브로모페놀이 식물 캘러스 조직에서 빠르게 대사되었음을 나타냅니다. 따라서 식물 캘러스 배양 플랫폼은 식물에서 생체이물의 흡수와 대사를 평가하는 효과적인 방법입니다.

서문

인위적 활동으로 인해 점점 더 많은 수의 유기 오염 물질이 환경으로 버려지고 있으며^1,2, 토양은 이러한 오염 물질의 주요 흡수원으로 간주됩니다 ^3,4. 토양의 오염 물질은 식물에 의해 흡수될 수 있으며 작물 소비를 통해 인체에 직접 유입되어 결과적으로 의도하지 않은 노출로 이어짐으로써 먹이 사슬을 따라 더 높은 영양 수준의 유기체로 잠재적으로 옮겨질 수 있습니다 ^5,6. 식물은 해독을 위해 생체이물(xenobiotics)을 대사하기 위해 다양한 경로를 이용한다⁷; 생체이물의 신진대사를 밝히는 것은 식물에서 오염 물질의 실제 운명을 통제하기 때문에 중요합니다. 대사 산물은 잎에 의해 (대기로) 또는 뿌리로 배설될 수 있기 때문에, 노출 초기 단계에서 대사 산물을 결정하면 더 많은 수의 대사 산물을 검사할 수 있다⁸. 그러나 온전한 식물을 사용한 연구에는 다양한 요인의 영향을 받을 수 있는 장기간의 실험과 복잡한 샘플 준비 프로토콜이 필요합니다.

따라서 식물 캘러스 배양은 치료 시간을 크게 단축할 수 있기 때문에 플란타에서 생체이물의 대사를 연구하는 데 좋은 대안입니다. 이러한 배양은 미생물 간섭 및 광화학적 분해를 배제하고, 손상되지 않은 식물의 매트릭스 효과를 단순화하고, 재배 조건을 표준화하고, 실험 노력을 덜 필요로 합니다. 식물 캘러스 배양은 트리클로산 9, 노닐페놀¹⁰ 및 테부코나졸⁸의 대사 연구에서 대체 접근법으로 성공적으로 적용되었습니다. 이 연구는 캘러스 배양의 대사 패턴이 온전한 식물의 대사 패턴과 유사하다는 것을 보여주었습니다. 본 연구는 복잡하고 시간이 많이 소요되는 프로토콜 없이 식물에서 생체이물 대사산물을 효율적이고 정확하게 식별할 수 있는 방법을 제안한다. 여기에서 우리는 저강도 신호^11,12를 가진 대사 산물을 분석하기 위해 고분해능 질량 분석법과 함께 식물 캘러스 배양을 사용합니다.

이를 위해 당근(Daucus carota var. sativus) 캘러스 현탁액을 130rpm 및 26°C의 진탕기에서 120시간 동안 2,4-디브로모페놀 100μg/L에 노출시켰다. 2,4-디브로모페놀은 파괴적인 내분비 활동(endocrine activity)¹³ 과 토양(토양)에서의 광범위한 발생¹⁴ 때문에 선택되었다. 대사 산물을 추출하고 고해상도 질량 분석법으로 분석했습니다. 여기에서 제안된 프로토콜은 이온화될 수 있는 다른 유형의 유기 화합물의 플란타 대사를 조사할 수 있습니다.

프로토콜

1. 당근 캘러스의 차별화

알림: 여기에 사용된 모든 장비를 오토클레이브하고 UV 살균된 초청정 작업대에서 모든 작업을 수행합니다.

1. 균일 한 당근 씨앗 (Daucus carota var. sativus)을 4 ° C에서 16 시간 동안 탈 이온수에 담가 씨앗을 Vernalize합니다.
2. vernalized 종자를 75 % 에탄올로 20 분 동안 표면 살균 한 다음 무균 상태에서 멸균 된 탈 이온수로 3 회 헹굽니다.
3. 종자를 20%_H2O2로 20분 동안 추가로 멸균하고, 무균 조건 하에서 멸균된 탈이온수로 6회 세척한다.
4. 1% 한천 겔을 함유하는 호르몬이 없는 MS 배지(pH 5.8, 121°C에서 20분 동안 오토클레이브)에 파종하고 26°C에서 16시간 광주기(350μmol/^m2s)로 15일 동안 배양하여 종자를 무균적으로 발아시킵니다.
5. 묘목의 배축과 자엽을 작은 조각 (0.5cm)으로 잘라서 외식편을 얻습니다.
6. 외식편을 옥시몬(2,4-디클로로페녹시아세트산, 1mg/L) 및 피토키닌(6-벤질아미노퓨린, 0.5mg/L)이 보충된 15-20mL의 무균 MS 배지가 들어 있는 페트리 접시(접시당 2-4개의 외식편)로 변형시킵니다.
7. 외식편을 26°C의 암실에서 3-4주 동안 배양하여 캘러스를 유도합니다.
8. 멸균 메스와 집게를 사용하여 초기 외식편에서 형성된 캘러스 조직(직경 약 1cm)을 분리합니다.
   참고: 새로 형성된 캘러스 조직은 흰색에서 크림색의 노란색을 띠며 초기 외식편에 느슨하게 부착됩니다.

2. 2,4-디브로모페놀 처리

1. 2,4-디브로모페놀 1μg을 무균 액체 MS 배지 10mL에 녹입니다(2,4-디브로모페놀의 최종 농도는 100ppb, pH 5.6-7.0).
2. 무균 조건에서 준비된 2,4-디브로모페놀 용액(2.1단계)이 들어 있는 유리 플라스크에 신선한 당근 캘러스(1.8단계) 3g을 추가합니다. 이것을 2,4-디브로모페놀 처리로 생각하십시오.
   참고: 유리 플라스크는 파라핀 필름을 사용하여 오토클레이브되고 밀봉되었습니다.
3. 2,4-디브로모페놀의 비생물적 분해를 평가하기 위해 2,4-디브로모페놀 용액(단계 2.1에서 제조됨)만을 포함하는 배지 대조군을 포함시켰다.
4. 잠재적인 오염이 있는지 확인하기 위해 당근 캘러스만 포함된 빈 대조군(2,4-디브로모페놀 용액 없음)을 포함합니다.
   1. 새로 수집한 당근 캘러스 3g을 멸균 MS 배지 10mL에 추가하여 당근이 포함된 블랭크 대조군을 준비합니다.
5. 2,4-디브로모페놀 처리와 배지 및 블랭크 대조군을 130 rpm 및 26°C에서 120 시간 동안 인큐베이터에서 암실에서 인큐베이션한다.
6. 인큐베이터로부터 유리 플라스크를 꺼내어 120시간의 인큐베이션 후에 2,4-디브로모페놀 처리 및 대조군으로부터 샘플을 수집하였다.
   참고: 모든 샘플은 세 번 준비되었습니다.

3. 시료 전처리

1. 2,4-디브로모페놀 처리 및 대조군을 위해 유리 섬유 필터(0.45 μm)로 여과하여 MS 배지로부터 캘러스를 조심스럽게 분리한다. 초순수로 세 번 씻은 후 굳은살을 채취합니다.
2. 수집된 캘러스를 액체 질소로 동결건조시킨 후, 수집된 캘러스(0.2g)를 70Hz에서 3분 동안 고처리량 조직 분쇄기로 균질화합니다.
3. 유리 미세 주사기로 25mg/L 대리 4-n-NP-d₄ 50μL를 추가한 후 1분 동안 볼텍싱하여 균질화된 캘러스를 스파이크합니다.
4. 30분 동안 얼음물로 채워진 초음파 처리기(150W, 40kHz)에서 5mL의 메탄올/물(1:1, v/v)로 샘플을 초음파 처리하여 2,4-디브로모페놀과 대사 산물을 추출합니다.
5. 현탁액을 4°C에서 8,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고, 피펫팅에 의해 상층액을 수집한다.
   1. 캘러스 샘플에 대한 추출 과정을 세 번 반복하고 추출물을 결합합니다.
6. 추출물을 1mL/분의 유속으로 친수성 친유성 균형 고체상 추출(HLB SPE) 카트리지에 통과시킵니다.
   참고: HLB SPE 카트리지는 간섭을 제거하기 위해 메탄올 6mL와 물 6mL로 순차적으로 전처리되었습니다.
7. HLB SPE 카트리지를 통해 메탄올 6mL를 통과시켜 분석물을 용리합니다. 그런 다음 기기 분석을 위해 질소 가스의 부드러운 흐름 하에서 얻은 용리액을 1mL로 농축합니다.
8. 2,4-디브로모페놀 및 그 대사산물 분석을 위해 생성된 용리액 10μL을 UPLC-Q-TOF-MS에 주입합니다¹⁵.
   1. 기기 분석 전에 0.22μm 나일론 멤브레인으로 모든 시료를 여과합니다.

4. 기기 분석

참고: 2,4-디브로모페놀 및 그 대사 산물의 분석은 양이온 및 음이온 모드에서 작동하는 전기 분무 이온화(ESI)가 장착된 micrOTOF-QII 질량 분석기와 함께 초고성능 액체 크로마토그래프(UPLC)에서 수행되었습니다.

1. 컬럼 히터 도어를 열고 컬럼 입구를 주입 밸브에 연결하고 컬럼 출구를 질량분석기의 입구에 연결하여 UPLC 컬럼을 설치합니다.
   참고: C18 컬럼(50mm x 2.1mm, 입자 크기 1.7μm)을 사용하여 40°C에서 분석물을 분리했습니다.
2. 용매 튜브 A와 B의 끝을 각각 해당 용매 병에 삽입하여 이동상 A(초순수)와 이동상 B(크로마토그래피 등급 메탄올)를 기기에 연결합니다.
   1. 0.22μm 필터를 통해 모든 이동상(각각 500mL)을 여과하고 30분 이상 초음파 처리합니다.
3. 소프트웨어 창에서 Instrument | Inlet Method 를 사용하여 액체 크로마토그램에 대한 조건을 편집합니다.
   1. 이동상 B의 기울기 조건을 다음과 같이 설정하십시오: 1.0mL/min의 유속; 0-0.5분, 5%; 0.5-3.5분, 5%에서 50%; 3.5-6.5분, 50%에서 100%; 6.5-7분, 100%; 7-10분, 100%에서 5%.
   2. 샘플의 주입 속도를 UPLC-Q-TOF-MS로 0.2mL/분으로 설정합니다.
      알림: 샘플 주입은 완전 자동 샘플을 사용하여 프로그래밍됩니다.
4. 소프트웨어 창에서 MS Method를 선택한 다음 Q-TOF-MS의 매개변수를 설정합니다: 건조 가스(N₂) 유량 8L/min, 온도 300-350°C; 4,500V의 모세관 전압; 5-45V의 충돌 에너지; 40-800Da의 전체 스캔 범위.
5. 샘플 바이알을 일련 번호별로 샘플 트레이의 해당 위치에 놓고 샘플 트레이를 샘플 챔버에 다시 삽입합니다.
   알림: 샘플 트레이를 평평하게 유지하고 샘플 챔버의 도어가 닫혀 있는지 확인하십시오.
6. 소프트웨어 창에서 파일 | 새로 만들기 - 데이터베이스를 만듭니다. 데이터베이스의 이름을 지정합니다.
7. MS 파일 | 인렛 파일 | 볼륨을 주입합니다.
8. File | 구하다.
9. 실행 | 소프트웨어 주 창에서 시작한 다음 샘플 데이터 가져오기를 선택하고 데이터 수집을 위한 시작 샘플 목록 실행 창에서 확인을 클릭합니다.
   참고: 실시간 크로마토 그램은 크로마토그램 | 데이터 수집 프로세스 중 실시간 업데이트.
10. 대상 데이터 행을 선택하고 크로마토그램 창을 클릭하여 MS 스캔 크로마토그램 을 보고 소프트웨어에서 데이터를 처리합니다.
11. 크로마토그램(Chromatogram) 창에서 디스플레이(Display) | 틱 | 스캔웨이브DS | 추적 추가 | 딸 스캔 질량 스펙트럼을 얻기 위해 OK.
12. 2,4-dibromophenol 처리와 대조군의 크로마토그램을 비교하여 대사 산물을 식별합니다.
13. 머무름 시간, 질량 및 단편화 패턴^16,17에 의해 대사 산물 후보를 설명합니다.
    참고: 대사 산물 후보의 모이온의 실험 m/z 값과 해당 이론적 m/z 사이의 질량 정확도 오류는 10ppm 미만이어야 합니다.

결과

프로토콜의 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 프로토콜에 따라 2,4-디브로모페놀 처리의 당근 캘러스 추출물의 크로마토그램을 대조군과 비교한 결과 2,4-디브로모페놀 처리에는 존재하지만 대조군에는 없는 8개의 뚜렷한 피크를 발견했습니다(그림 2). 이는 2,4-디브로모페놀 처리된 당근 캘러스에서 총 8개의 2,4-디브로모페놀 대사산물(M562, M545, M661, M413, M...

토론

이 프로토콜은 식물에서 생체이물의 생체 변형을 효율적으로 식별하기 위해 개발되었습니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 식물 캘러스의 배양입니다. 가장 어려운 부분은 식물 캘러스의 분화와 유지인데, 식물 캘러스는 식물 조직에 쉽게 감염되어 발달하기 때문입니다. 따라서 사용되는 모든 장비가 고압 증기 멸균되어 있고 모든 작업이 무균 조건에서 수행되는지 확인하는 것이 중요합니다. ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-dichlorophenoxyacetic acid	WAKO	1 mg/L
20% H2O2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10011218-500ML
4-n-NP, >99%	Dr. Ehrenstorfer GmbH
4-n-NP-d4	Pointe-Claire
6-benzylaminopurine	WAKO	0.5 mg/L
75% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	1269101-500ML
7890A-5975 gas chromatography	Agilent
ACQULTY ultra-performance liquid chromatography	Waters
Amber glass vials	Waters
Artificial climate incubator	Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD	RDN-1000A-4
Autoclaves	STIK	MJ-Series
C18 column	ACQUITY UPLC BEH
Centrifuge	Thermo Fisher
DB-5MS capillary column	Agilent
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	40071190-4L
Freeze dryer	SCIENTZ
High-throughput tissue grinder	SCIENTZ
Methanol	Sigma-Aldrich
MicrOTOF-QII mass spectrometer	Bruker Daltonics
Milli-Q system	Millipore	MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium	HOPEBIO	HB8469-7
N-hexane	Sigma-Aldrich	H109658-4L
Nitrogen blowing instrument	AOSHENG	MD200-2
NP isomers, >99%	Dr. Ehrenstorfer GmbH
Oasis HLB cartridges	Waters	60 mg/3 mL
Research plus	Eppendorf		100-1000 µL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)	Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators	Shanghai bluepard instruments Co.,ltd.	THZ-98AB
Solid phase extractor	AUTO SCIENCE
Ultrasound machine	ZKI	UC-6
UV-sterilized ultra-clean workbench	AIRTECH