يفصل هذا البروتوكول فحص التبلور عالي الإنتاجية ، بدءا من إعداد لوحة المقايسة الدقيقة 1,536 إلى نهاية نافذة زمنية تجريبية مدتها 6 أسابيع. يتم تضمين تفاصيل حول إعداد العينة ، والتصوير الذي تم الحصول عليه ، وكيف يمكن للمستخدمين إجراء التحليلات باستخدام واجهة مستخدم رسومية مدعومة بالذكاء الاصطناعي لتحديد ظروف التبلور الجزيئي بسرعة وكفاءة.
علم البلورات بالأشعة السينية هو الأسلوب الأكثر استخداما لتمييز الهياكل الجزيئية الكبيرة ، لكن الخطوة الحاسمة المتمثلة في بلورة البروتين إلى شبكة مرتبة قابلة للحيود لا تزال صعبة. يتم تعريف تبلور الجزيئات الحيوية إلى حد كبير تجريبيا ، ويمكن أن تكون هذه العملية كثيفة العمالة ومانعة للباحثين في المؤسسات المحدودة الموارد. في المركز الوطني للتبلور عالي الإنتاجية (HTX) ، تم تنفيذ طرق قابلة للتكرار بدرجة عالية لتسهيل نمو البلورات ، بما في ذلك إعداد آلي عالي الإنتاجية يبلغ 1536 بئرا من الألواح الدقيقة تحت الزيت مصمم لأخذ عينات واسعة من معلمات التبلور. تتم مراقبة الصفائح باستخدام أحدث طرق التصوير على مدار 6 أسابيع لتوفير نظرة ثاقبة لنمو البلورات ، وكذلك لتمييز ضربات الكريستال القيمة بدقة. علاوة على ذلك ، فإن تنفيذ خوارزمية تسجيل الذكاء الاصطناعي المدربة لتحديد نتائج الكريستال ، إلى جانب واجهة مفتوحة المصدر وسهلة الاستخدام لعرض الصور التجريبية ، يبسط عملية تحليل صور نمو البلورات. هنا ، يتم وصف الإجراءات والأجهزة الرئيسية لإعداد الكوكتيلات وألواح التبلور ، وتصوير الألواح ، وتحديد النتائج بطريقة تضمن التكاثر وتزيد من احتمالية التبلور الناجح.
حتى في عصر التقدم الهائل في أساليب البيولوجيا الهيكلية ، لا يزال علم البلورات بالأشعة السينية طريقة موثوقة وشائعة لتوليد نماذج هيكلية عالية الجودة للجزيئات الكبيرة. أكثر من 85٪ من جميع النماذج الهيكلية ثلاثية الأبعاد المودعة في بنك بيانات البروتين (PDB) هي من الطرق الهيكلية القائمة على الكريستال (اعتبارا من يناير 2023). 1 علاوة على ذلك ، يظل علم البلورات بالأشعة السينية لا غنى عنه لحل هياكل البروتين ، وهو عنصر حاسم في عملية اكتشاف الأدويةوتطويرها 2. على الرغم من أن تبلور البروتين ظل تقنية البيولوجيا الهيكلية السائدة لأكثر من نصف قرن ، إلا أن طرق التنبؤ باحتمالية التبلور بناء على الخصائص الفيزيائية3 أو التسلسل 4,5 لا تزال في مهدها.
التنبؤ بظروف التبلور أكثر غموضا. تم إحراز تقدم محدود للتنبؤ بظروف التبلور المحتملة حتى بالنسبة للبروتيناتالنموذجية 6,7. حاولت دراسات أخرى تحديد ظروف التبلور بناء على تماثل البروتين والظروف المستخرجة من PDB8،9،10. ومع ذلك ، فإن القدرة التنبؤية التي يمكن العثور عليها في PDB محدودة ، حيث يتم إيداع شروط التبلور النهائية الناجحة فقط ، والتي ، بالضرورة ، تفوت تجارب التحسين الشاملة في كثير من الأحيان المطلوبة لضبط نمو البلورات. علاوة على ذلك ، تفتقر العديد من إدخالات PDB إلى البيانات الوصفية التي تحتوي على هذه التفاصيل ، بما في ذلك صيغ الكوكتيل وتنسيق التبلور ودرجة الحرارة والوقت اللازم لبلورة11,12. لذلك ، بالنسبة للعديد من البروتينات ذات الأهمية ، فإن الطريقة الأكثر سهولة لتحديد ظروف التبلور هي تجريبيا ، باستخدام أكبر عدد ممكن من الظروف عبر مجموعة واسعة من الاحتمالات الكيميائية.
تم استكشاف العديد من الأساليب لجعل فحص التبلور مثمرا وشاملا قدر الإمكان لإحداث تأثير كبير ، بما في ذلك المصفوفات المتفرقة 13 ، والفحص العاملي غير المكتمل 14 ، والمواد المضافة 15،16 ، والبذر 17 ، وعوامل النواة 18. طور المركز الوطني HTX في معهد هاوبتمان وودوارد للبحوث الطبية (HWI) خط أنابيب فعالا لفحص التبلور باستخدام نهج الدفعات الدقيقةتحت النفط 19 ، والذي يستخدم طرق معالجة السوائل والتصوير الآلي لتبسيط تحديد ظروف التبلور الأولية باستخدام الحد الأدنى نسبيا من أحجام العينات والكوكتيل (الشكل 1). تعتمد المجموعة المكونة من 1536 كوكتيلا فريدا على الظروف التي تم تحديدها مسبقا على أنها مواتية لنمو بلورات البروتين وهي مصممة لتكون متنوعة كيميائيا من أجل أخذ عينات من مجموعة كبيرة من ظروف التبلور المحتملة20،21،22. يزيد أخذ العينات الواسع لظروف التبلور من احتمال ملاحظة واحد أو أكثر من خيوط التبلور.
ظهرت في الأدبيات تحليلات رسمية قليلة لعدد الحالات اللازمة للفحص. ركزت إحدى الدراسات على تخطيط أخذ العينات لشاشات مختلفة ووجدت أن أخذ العينات العشوائية للمكونات (على غرار عامل غير مكتمل) يمثل طريقة أخذ العينات الأكثر شمولاوكفاءة 23. أشارت دراسة أخرى للفحص إلى أنه كانت هناك العديد من الحالات التي أسفرت فيها الشاشة الشاملة للغاية البالغ عددها 1,536 عن إصابة بلورة واحدة فقطب 24 ، وأبرزت دراسة حديثة جدا أن معظم الشاشات التجارية تقلل من مساحة التبلور المعروفة بأنها مرتبطة بفحص25. لن تسفر جميع خيوط التبلور عن بلورة ذات جودة حيود مناسبة لجمع البيانات بسبب الاضطراب المتأصل داخل البلورة أو قيود الحيود أو العيوب البلورية ؛ لذلك ، فإن صب شبكة أوسع للظروف له فائدة إضافية تتمثل في توفير أشكال بلورية بديلة للتحسين.
شكل تجارب بلورة البروتين له أيضا تأثير على نجاح الشاشة. نشر البخار هو الإعداد الأكثر استخداما لتطبيقات التبلور عالية الإنتاجية ويستخدم في أحدث مراكز التبلور ، بما في ذلك مراكز الفحص عالية الإنتاجية EMBL Hamburg و Institut Pasteur26،27،28. يستخدم مركز HTX طريقة الدفعة الدقيقة تحت النفط. على الرغم من أنها أقل استخداما ، إلا أنها طريقة قوية تقلل من استهلاك كوكتيلات العينة والتبلور20،21،22. تتمثل إحدى مزايا طريقة الدفعة الدقيقة تحت الزيت ، خاصة عند استخدام زيت البارافين عالي اللزوجة ، في حدوث تبخر طفيف فقط داخل القطرة أثناء التجربة ، مما يعني أن تركيز التوازن يتحقق عند خلط القطرة. إذا لوحظت نتائج تبلور إيجابية في طريقة الدفعة الدقيقة تحت الزيت ، فإن تكاثر هذه الظروف عادة ما يكون أكثر وضوحا من إعدادات انتشار البخار ، حيث يحدث التبلور في نقطة غير محددة أثناء التوازن بين قطرة التبلور والخزان. إن استنساخ الضربات أمر مرغوب فيه لنهج التبلور عالي الإنتاجية ، والتي تنتج بلورات بروتينية صغيرة للغاية تحتاج عادة إلى تحسينها لتجارب الأشعة السينية أحادية البلورة.
تتكون شاشة التبلور عالية الإنتاجية للبروتينات القابلة للذوبان من الكوكتيلات التي يتم إعدادها داخليا ، والشاشات التجارية الجاهزة ، والشاشات التجارية المعدلة داخليا22. تم تطوير الكوكتيلات في البداية باستخدام استراتيجية عاملية غير مكتملة باستخدام كوكتيلات التبلور الناجحة سابقا20. تشمل الكواشف الموجودة في الشاشة المتوفرة تجاريا صفائف من البوليمرات وأملاح التبلور و PEG ومجموعات الأيونات والشاشات التي تستخدم مصفوفة متفرقة ونهج عاملية غير مكتملة. هناك أيضا كواشف يتم تعديلها قبل تضمينها في الشاشة: شاشة مضافة ، وشاشة الأس الهيدروجيني والعازلة ، وشاشة مضافة سائلة أيونية ، وشاشة بوليمر.
تم الاستفادة من قوة ظروف واستراتيجيات التبلور المعروفة في 1,536 كوكتيل تبلور ، إلى جانب فوائد نظام microbatch-under-oil لإنشاء خط أنابيب يستخدم المعالجة الآلية للسوائل ، والتصوير الآلي للحقول الساطعة ، والتصوير غير الخطي من الدرجة الثانية للبلورات الشريانية (SONICC). توفر أتمتة كل من معالجة السوائل والتصوير فوائد ساعات عمل أقل في المختبر الرطب وقابلية استنساخ أعلى. تتطلب الطبيعة عالية الإنتاجية لفحص التبلور الآلي أتمتة عملية مراقبة نمو البلورات. يتم تحقيق هذه التطورات من خلال أحدث تقنيات التصوير للمساعدة في تحديد نتائج الكريستال الإيجابية. يتم استخدام كل من التصوير القياسي للألواح ، بالإضافة إلى طرق الفوتون المتعددة للكشف المحسن ، عبر نظام تصوير بلوري مع SONICC (الشكل 2). تجمع SONICC بين الفحص المجهري للجيل التوافقي الثاني (SHG)29 والفحص المجهري الفلوري المثار ثنائي الفوتون فوق البنفسجي (UV-TPEF)30 للكشف عن البلورات الصغيرة جدا ، وكذلك تلك التي تحجبها الراسبات. يعلم تصوير SONICC ما إذا كانت الآبار تحتوي على البروتين (عبر UV-TPEF) والبلورات (عبر SHG). بالإضافة إلى التحديد الإيجابي لبلورات البروتين ، يمكن أيضا الحصول على معلومات إضافية باستخدام أحدث طرق التصوير. يعمل التصوير بالكوكتيل فقط قبل إضافة العينة كعنصر تحكم سلبي ؛ يمكن لهذه الصور تحديد مظهر البئر قبل إضافة العينة ، بما في ذلك من حيث بلورات الملح والحطام. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد التصوير SHG و UV-TPEF على تمييز بلورات البروتين عن بلورات الملح ويمكن استخدامه لتصور المواد المعقدة للحمض النوويالبروتيني 31.
تؤدي تجارب التبلور عالية الإنتاجية التي تخضع للمراقبة المتكررة عبر التصوير إلى حجم كبير جدا من الصور التي تحتاج إلى فحص. تم تطوير طرق تسجيل الكريستال الآلية لتقليل العبء على المستخدم وزيادة احتمالية تحديد ضربات الكريستال الإيجابية. شارك مركز HTX في تطوير خوارزمية تسجيل MAchine للتعرف على نتائج التبلور (MARCO) ، وهي بنية شبكة عصبية تلافيفية عميقة مدربة طورها اتحاد من الشركاء الأكاديميين وغير الربحيين والحكوميين والصناعة لتصنيف صور بئر برايتفيلد32. تم تدريب الخوارزمية على ما يقرب من نصف مليون صورة برايت فيلد من تجارب التبلور من مؤسسات متعددة باستخدام طرق تبلور مختلفة وأجهزة تصوير مختلفة. تنتج الخوارزمية درجة احتمالية تشير إلى ما إذا كانت صورة معينة تقع في أربع فئات صور محتملة: "بلوري" و "واضح" و "راسب" و "آخر". تم الإبلاغ عن دقة تصنيف MARCO بنسبة 94.5٪. يتم تحسين اكتشاف الكريستال بشكل أكبر من خلال برنامج ينفذ الخوارزمية ويوفر واجهة مستخدم رسومية (GUI) لعرض الصور بسهولة ويمكن الوصول إليها ، ويتم تمكينها من خلال إمكانات التسجيل التي تدعم الذكاء الاصطناعي32,33. تم تصميم واجهة المستخدم الرسومية MARCO Polo للعمل بسلاسة مع إعداد نظام التصوير وإدارة البيانات في مركز HTX لتحديد النتائج في شاشة 1,536 بئرا ، مع مشاركة بشرية لفحص مخرجات القوائم التي تم فرزها. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن البرامج مفتوحة المصدر متاحة على GitHub ، فإن واجهة المستخدم الرسومية متاحة بسهولة للتعديل لتعكس الاحتياجات المحددة لمجموعات المختبرات الأخرى.
هنا ، يتم وصف عملية إعداد تجربة microbatch عالية الإنتاجية تحت النفط باستخدام معالجة السوائل الروبوتية لتقديم كل من الكوكتيل والبروتين. يحتوي مركز HTX على مجموعة فريدة من الأجهزة والموارد التي لا توجد في المؤسسات الأخرى ، بهدف توفير خدمات الفحص والموارد التعليمية للمستخدمين المهتمين. إن إظهار أساليب وقدرات التقنيات عالية الإنتاجية التي تدعم الروبوتات سيمكن المجتمع من معرفة التقنيات المتاحة واتخاذ القرارات لجهود تحديد الهيكل الخاصة بهم.
1. إعداد أو شراء الكوكتيلات لستة عشر كتلة بئر عميقة 96 بئرا
2. توزيع الكوكتيلات على أطباق 384 بئر
3. تحضير ألواح 1536 بئرا بكوكتيلات الزيت والتبلور
4. تقديم عينة
5. إعداد العينة في لوحات 1536 بئر المعدة
6. مراقبة 1536 لوحة بئر لتشكيل الكريستال
7. تحليل الصور
تتكون نتائج تجربة فحص الكريستال التي يبلغ عددها 1536 بئرا من سبع مجموعات كاملة من صور برايت فيلد تم جمعها في اليوم 0 (التحكم السلبي) ، واليوم 1 ، والأسبوع 1 ، والأسبوع 2 ، والأسبوع 3 ، والأسبوع 4 ، والأسبوع 6 (الشكل 4). يتم جمع صور SONICC عند نقطة زمنية مدتها 4 أسابيع للألواح المحتضنة عند 23 درجة مئوية وفي نقطة زمنية مدتها 6 أسابيع للألواح المحتضنة عند 4 درجات مئوية أو 14 درجة مئوية. إجمالا ، بمجرد شحن العينة ، يمكن للمستخدمين توقع إعداد لوحاتهم في غضون يوم 1 من الوصول. سيتم تحميل الصور عند جمعها. تنتهي تجربة فحص التبلور بعد 6 أسابيع.
يسمح إعداد اللوحة المكونة من 1536 بئرا بإجراء جميع تجارب الفحص داخل نفس اللوحة ، مما يحد من استهلاك العينة ويسهل التصوير والمقارنة المباشرة بين طرق التصوير. يتم عرض النتائج التمثيلية للمسار الزمني لنمو البلورة لحالة كوكتيل واحدة في الشكل 4. يسمح التصوير الآلي للوحة طوال فترة التجربة بتحديد البلورات سريعة النمو والبطيئة النمو عن طريق التصوير الساطع. يسمح التصوير بالأشعة فوق البنفسجية TPEF و SHG بالتحقق المتقاطع من النتائج التي لوحظها التصوير الساطع ويشير إلى أن البلورات المرصودة بروتينية وبلورية ، على التوالي (الشكل 5 أ ، ب). علاوة على ذلك ، يتيح التصوير بالموجات فوق الصوتية تحديد البلورات التي تحجبها بصريا الرواسب أو الأفلام (الشكل 5C) أو البلورات الدقيقة التي قد يتم الخلط بينها وبين الراسبات (الشكل 5D). بالنسبة لبعض البلورات ، لا يتم استبعاد عدم وجود إشارة SHG ، لأن بعض مجموعات النقاط لا تنتج إشارة SHG35,36 ، كما يتضح من بلورة الثوماتين رباعية الزوايا في الشكل 5C. وعلى العكس من ذلك، ينبغي توقع عدم وجود إشارة للأشعة فوق البنفسجية - TPEF للبروتينات التي تفتقر إلى بقايا التربتوفان. تسهل مراقبة إشارات UV-TPEF و SHG أيضا تحديد بلورات الملح غير البروتينية ، والتي ستظهر في برايتفيلد وتظهر إشارة SHG إيجابية قوية ولكنها ستفتقر إلى إشارة UV-TPEF (الشكل 5E).
يتم تبسيط تحليل الصور لإعداد اللوحة باستخدام واجهة المستخدم الرسومية MARCO Polo ، والتي تجمع أيضا نقل بيانات ftp من خوادم HWI (كبديل لنقل الملفات باستخدام FileZilla). تسمح واجهة المستخدم الرسومية MARCO Polo بعرض اللوحة والصور بسهولة ويقوم بتسجيل الصور الحسابية باستخدام خوارزمية MARCO بحيث يمكن تنزيل نتائج الصور وعرضها وتحليلها بسرعة من مركز HTX. خوارزمية تسجيل MARCO ، كما تم تنفيذها في واجهة المستخدم الرسومية MARCO Polo ، قادرة على تسجيل الصور من لوحة 1536 بئرا بأكملها في أقل من 5 دقائق. يمكن بعد ذلك فرز الصور التي تم وضع علامة عليها على أنها بلورية بواسطة خوارزمية MARCO بواسطة واجهة المستخدم الرسومية Polo للعرض. نظرا لأنه تم تحسين خوارزمية MARCO لتحديد الكريستال وتقليل السلبيات الخاطئة حتى لا تفوت أي نتائج إيجابية ، يمكن أن يؤدي التسجيل إلى علامات إيجابية خاطئة. ومع ذلك ، فإن قدرة MARCO على الحد من مجموعة الصور التي تحتاج إلى فحص من خلال تركيز الانتباه على الآبار ذات الاحتمال الكبير لاحتواء البلورات تؤدي إلى انخفاض كبير في عبء معالجة البيانات للمستخدمين. إن التنفيذ المريح للخوارزمية في منصة عرض MARCO Polo سهلة الاستخدام ، مع قدرتها على فرز الصور بناء على درجات MARCO ، يحسن بشكل كبير من قدرة المستخدم على تحليل مجموعة البيانات بسرعة وتحديد نتائج الكريستال بدقة.
الشكل 1: رسم تخطيطي لتجربة فحص تبلور عالية الإنتاجية تبلغ 1536 بئرا تم إجراؤها في مركز HTX. (1) في هذه الخطوة ، تتم إضافة 5 ميكرولتر من زيت البارافين و 200 نانولتر من الكوكتيل إلى كل بئر (خطوة البروتوكول 3.1 والخطوة 3.5). يظهر رسم كاريكاتوري لبئر واحد يحتوي فقط على الزيت والكوكتيل وصورة تمثيلية على اليمين. (2) تصل العينات إلى مركز HTX (خطوة البروتوكول 5.1). 3) في هذه الخطوة ، تتم إضافة 200 نانولتر من العينة إلى كل بئر (خطوة البروتوكول 5.4). (4) تتم مراقبة جميع الآبار البالغ عددها 1536 بئرا بمرور الوقت باستخدام التصوير الساطع ، 5) بالإضافة إلى طرق UV-TPEF و SHG (خطوة البروتوكول 6). 6) يتم استخدام واجهة المستخدم الرسومية مفتوحة المصدر التي تدعم الذكاء الاصطناعي لعرض صور التبلور وتسجيلها وتحليلها (خطوة البروتوكول 7). الاختصارات: HTX = تبلور عالي الإنتاجية ؛ UV-TPEF = مضان متحمس للأشعة فوق البنفسجية ثنائية الفوتون ؛ SHG = الجيل التوافقي الثاني ؛ الذكاء الاصطناعي = الذكاء الاصطناعي. واجهة المستخدم الرسومية = واجهة مستخدم رسومية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: لوحة واحدة من 1536 بئرا تحتوي على تجارب فحص ، تم تصويرها باستخدام التصوير الساطع والأشعة فوق البنفسجية TPEF و SHG. يتم عرض لوحات 1,536 بئرا مع قرش أمريكي للمقياس (أعلى). يتم تصوير كل تجربة فحص مرة واحدة قبل الإعداد وست مرات بعد إضافة العينة باستخدام تصوير برايت فيلد (إجمالي سبع مجموعات صور برايت فيلد ، على اليسار). تخضع الصفائح للتصوير بالأشعة فوق البنفسجية UV-TPEF (في الوسط) و SHG (على اليمين) في 4 أسابيع أو 6 أسابيع. الاختصارات: UV-TPEF = UV-two-الفوتون متحمس مضان. SHG = الجيل التوافقي الثاني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: رسم تخطيطي يوضح كيفية إنشاء ألواح الآبار البالغ عددها 1536 بئرا. يتم استخدام ستة عشر كتلة DW ذات 96 بئرا للقضاء على أربع لوحات 384 بئرا ، مع ملء كل ربع من كل لوحة 384 بئرا عن طريق توزيع كوكتيلات التبلور. تملأ أربع كتل DW ذات 96 بئرا لوحة واحدة من 384 بئرا (في المنتصف). يتم استخدام أربع لوحات من 384 بئرا للقضاء على اللوحة المفردة المكونة من 1536 بئرا (يمين). اختصار: DW = بئر عميق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مسار زمني تمثيلي لبئر واحد في تجربة فحص 1536 بئرا. يتم تصوير اللوحات قبل إعداد العينة (اليوم 0) ، وكذلك مع تصوير برايت فيلد في اليوم 1 والأسبوع 1 والأسبوع 2 والأسبوع 3 والأسبوع 4 والأسبوع 6. يتم تصوير الصفائح المحتضنة عند 23 درجة مئوية باستخدام SONICC في الأسبوع 4. قضبان المقياس = 80 ميكرومتر (برايتفيلد) ، 200 ميكرومتر (SHG ، UV-TPEF). الاختصارات: SONICC = التصوير غير الخطي من الدرجة الثانية للبلورات الشريانية ؛ UV-TPEF = مضان متحمس للأشعة فوق البنفسجية ثنائية الفوتون ؛ SHG = الجيل التوافقي الثاني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: نتائج التصوير التمثيلي لتجارب فحص الكريستال HT 1,536. يتم عرض نتائج التصوير Brightfield و UV-TPEF و SHG لخمسة آبار نموذجية. (أ، ب) بلورات البروتين التي لوحظها التصوير برايتفيلد والأشعة فوق البنفسجية TPEF و SHG واضحة بوضوح في جميع طرق التصوير الثلاثة. (ج) يمكن رؤية بلورة بروتينية محجوبة بفيلم في التصوير الساطع عن طريق التصوير بالأشعة فوق البنفسجية TPEF ؛ لا يتم ملاحظة البلورة بواسطة تصوير SHG بسبب عدم توافق مجموعة النقاط. (د) مثال على البلورات الدقيقة التي تم التحقق منها بواسطة التصوير بالأشعة فوق البنفسجية TPEF و SHG والتي يمكن اعتبارها راسبة. (ه) مثال على بلورات الملح التي تظهر بلورية بواسطة التصوير الساطع و SHG ولكنها لا تظهر إشارة UV-TPEF. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. قطر البئر = 0.9 مم. الاختصارات: UV-TPEF = UV-two-الفوتون متحمس مضان. SHG = الجيل التوافقي الثاني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي S1: فتح ملفات الصور في MARCO Polo. يمكن فتح ملفات الصور داخل واجهة المستخدم الرسومية MARCO Polo بالانتقال إلى ملف استيراد |علامة التبويب "الصور" في الجزء العلوي (أ). لاحظ أنه يمكن أيضا نقل الملفات عبر أداة From FTP مباشرة في MARCO Polo (a) أو يمكن نقلها عبر FileZilla كما هو موضح في خطوة البروتوكول 7.2. لاستيراد الملفات التي تم تنزيلها بالفعل، اختر الصور | من أرشيف / دليل rar. في النافذة المنبثقة التي تظهر، حدد استعراض للوصول إلى المجلد (ب)، وانتقل إلى دليل الملفات حيث يتم حفظ ملفات صور اللوحة. بمجرد أن تكون الملفات في نافذة المسارات المحددة (ج) ، قم بتمييز ملف ، وانقر فوق استيراد عمليات (د). ستحدد واجهة المستخدم الرسومية MARCO Polo البيانات الوصفية الصحيحة لملف الكوكتيل لاستيرادها مع الصور. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
تصف الطريقة خط أنابيب عالي الإنتاجية لفحص بلورة البروتين الذي يتطلب أقل من 500 ميكرولتر من العينة ل 1536 تجربة تبلور فردية في شكل دفعة صغيرة تحت النفط. يعتمد خط الأنابيب على روبوتات معالجة السوائل للمساعدة بسرعة وبشكل متكرر في الإعداد التجريبي ، بالإضافة إلى مورد تحليل الصور الحسابية MARCO Polo ، والذي تم تخصيصه لتحليل صور لوحة 1,536 بئرا باستخدام خوارزمية MARCO لتحديد وعزل ضربات الكريستال.
الحجم الصغير لقطرات الفحص الفردية (إجمالي 400 نانولتر مع نسبة 1: 1 من العينة: كوكتيل) يعني أن أحجام العينات الصغيرة للغاية مطلوبة لتحديد ظروف التبلور الإيجابية. تنتج أحجام القطرات الصغيرة هذه بالضرورة بلورات صغيرة لا يمكن صيدها بواسطة الحلقات التقليدية. تم تطوير طرق للحصاد من 1536 لوحة37 ؛ بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام الألواح ذات البلورات مباشرة في مصادر السنكروترون لجمع البيانات في الموقع 38. إذا تم تطوير طريقة قوية لحصاد هذه البلورات ، فإن التقدم في تكنولوجيا السنكروترون والحزم الدقيقة التركيز ستمكن من الحصول على مجموعات بيانات مفيدة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام البلورات التي تم الحصول عليها كبذور لجهود التحسين.
من الواضح أن التصوير بالموجات فوق الصوتية الصوتية مفيد في تحديد كل من بلورات البروتين الصغيرة وبلورات البروتين المخبأة تحت الراسب. على الرغم من هذه المزايا ، ليست كل أنواع العينات قابلة للتصوير SHG و UV-TPEF. على سبيل المثال ، ستظهر البروتينات التي تحتوي على القليل من بقايا التربتوفان العطرية أو لا تحتوي على أي منها إشارة غامضة للأشعة فوق البنفسجية. علاوة على ذلك ، لن يتم اكتشاف البلورات في مجموعات فضائية محددة ، بما في ذلك المجموعات المركزية المتماثلة أو المجموعة النقطية 432 ، بواسطة تصوير SHG. تتداخل العينات التي تحتوي على الفلوروفورات أحيانا مع إشارة SHG ، مما يؤدي إلى إلغاء الإشارة أو زيادة شدتها ، مما يعني أن التفسير الدقيق لإشارات SHG مطلوب للبروتينات المحتوية على المعادن والبروتينات التي تحتوي على شقوق الفلورسنت. ومع ذلك ، في كثير من الحالات ، من الممكن ترشيد عدم وجود إشارة SHG أو UV-TPEF ، ولا ينبغي أن يؤدي عدم وجود هذه الإشارات بالضرورة إلى استبعاد وجود بلورة بروتينية.
يوفر تنسيق microbatch-under-oil بديلا لطريقة انتشار البخار الأكثر شيوعا المستخدمة في علم البلورات عالي الإنتاجية. والأهم من ذلك أن شكل التبلور يؤثر على التحديد39، مما يوفر الأساس المنطقي لاستخدام أشكال التبلور المختلفة لجهود الفرز عالية الإنتاجية. يساعد التصوير الآلي والطرائق التي تدعم SONICC في التعرف السريع على بلورات البروتين طوال الدورة الزمنية التجريبية التي تبلغ مدتها 6 أسابيع. وأخيرا، تتيح واجهة المستخدم الرسومية MARCO Polo للمستخدمين تحليل الصور بسرعة من 1,536 حالة لتحديد الآبار الواعدة للتحسين. توفر القدرات في مركز HTX ، بما في ذلك الإعداد التجريبي عالي الإنتاجية الذي يدعم الروبوتات ، إلى جانب أحدث أدوات التصوير والحوسبة للتحليلات ، مساهمة كبيرة في مجتمع البيولوجيا الهيكلية من خلال تمكين الباحثين من معالجة عنق الزجاجة الأساسي بشكل فعال في العمل الهيكلي القائم على البلورات: إيجاد ظروف التبلور.
ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر.
نود أن نعرب عن امتناننا لمستخدمينا على تكليف عيناتهم الثمينة لنا بفحص الكريستال ، وكذلك لتقديم ملاحظات وطلبات نقدية ساعدتنا في تحسين وتطوير مواردنا لخدمة مجتمع البيولوجيا الهيكلية بشكل أفضل. نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لإيثان هولمان والدكتورة ليزا جيه كيف والدكتورة إيريكا دوجويد ، الذين قادوا تطوير واجهة المستخدم الرسومية MARCO Polo. نود أن نشكر زملاء HWI على دعمهم واقتراحاتهم ، وخاصة الدكتورة ديانا سي إف مونتيرو. نحن نعترف بدعم التمويل من المعاهد الوطنية للصحة ، R24GM141256.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1536 Well Imp@ct LBR LoBase | Greiner Bio-One | 790 801 | |
Acetic acid | Hampton Research | HR2-853 | |
AlumaSeal II Sealing Film | Hampton Research | HR8-069 | |
Ammonium bromide | Molecular Dimensions | MD2-100-247 | |
Ammonium chloride | Hampton Research | HR2-691 | |
Ammonium hydroxide | Hampton Research | HR2-855 | |
Ammonium nitrate | Hampton Research | HR2-665 | |
Ammonium phosphate dibasic | Hampton Research | HR2-629 | |
Ammonium phosphate monobasic | Hampton Research | HR2-555 | |
Ammonium sulfate | Hampton Research | HR2-541 | |
Ammonium thiocyanate | Molecular Dimensions | MD2-100-301 | |
Bicine pH 9.0 | Hampton Research | HR2-723 | |
Bis-tris propane pH 7.0 | Hampton Research | HR2-993-08 | |
Calcium acetate | Hampton Research | HR2-567 | |
Calcium chloride dihydrate | Hampton Research | HR2-557 | |
CAPS pH 10.0 | Rigaku Reagents | none given | |
ClearSeal Film | Hampton Research | HR4-521 | |
Cobalt sulfate heptahydrate | Molecular Dimensions | MD2-100-42 | |
Crystal Screen HT screen | Hampton Research | HR2-130 | |
Formulator | Formulatrix | ||
Glycerol | Hampton Research | HR2-623 | |
Gryphon liquid handling robot | Art Robbins Instruments | ||
HEPES pH 7.0 | Hampton Research | HR2-902-03 | |
HEPES pH 7.5 | Hampton Research | HR2-902-08 | |
HWI HTX Center sample submission form | https://hwi.buffalo.edu/high-throughput-crystallization-screening-center-sample-submission-form/ | ||
Hydrochloric acid | Hampton Research | HR2-581 | |
Index HT screen | Hampton Research | HR2-134 | |
Ionic Liquid screen | Hampton Research | HR2-214 | |
Lithium bromide | Molecular Dimensions | MD2-100-312 | |
Lithium chloride | Hampton Research | HR2-631 | |
Lithium sulfate monohydrate | Hampton Research | HR2-545 | |
Magnesium acetate tetrahydrate | Hampton Research | HR2-561 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Hampton Research | HR2-559 | |
Magnesium nitrate hexahydrate | Hampton Research | HR2-657 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Hampton Research | HR2-821 | |
Manganese chloride tetrahydrate | Millipore Sigma | 63535-50G | |
Manganese sulfate monohydrate | Molecular Dimensions | MD2-100-310 | |
MARCO Polo GUI download | https://hauptman-woodward.github.io/Marco_Polo/ | ||
Matrix Platemate 2 x 3 liquid handling robot | Thermo Scientific | ||
MES pH 6.0 | Hampton Research | HR2-943-09 | |
Mosquito liquid handling robot | SPTLabtech | ||
Paraffin Oil/White Mineral Oil Saybolt Viscosity 340-365 at 100 °F | Sigma Aldrich | PX0045-3 | |
PEG 1000 | Hampton Research | HR2-523 | |
PEG 2000 | Hampton Research | HR2-592 | |
PEG 20000 | Hampton Research | HR2-609 | |
PEG 3350 | Hampton Research | HR2-527 | |
PEG 400 | Hampton Research | HR2-603 | |
PEG 4000 | Hampton Research | HR2-529 | |
PEG 6000 | Hampton Research | HR2-533 | |
PEG 8000 | Hampton Research | HR2-535 | |
PEG/Ion HT screen | Hampton Research | HR2-139 | |
PEGRx HT screen | Hampton Research | HR2-086 | |
Plate reservations | htslab@hwi.buffalo.edu | ||
Potassium acetate | Hampton Research | HR2-671 | |
Potassium bromide | Hampton Research | HR2-779 | |
Potassium carbonate | Molecular Dimensions | MD2-100-311 | |
Potassium chloride | Hampton Research | HR2-649 | |
Potassium nitrate | Hampton Research | HR2-663 | |
Potassium phosphate dibasic | Hampton Research | HR2-635 | |
Potassium phosphate-monobasic | Hampton Research | HR2-553 | |
Potassium phosphate-tribasic | Molecular Dimensions | MD2-100-309 | |
Potassium thiocyanate | Hampton Research | HR2-695 | |
Rock Imager 1000 with SONICC | Formulatrix | ||
Rock Imager 54 | Formulatrix | ||
Rubidium chloride | Millipore Sigma | R2252-10G | |
SaltRx HT screen | Hampton Research | HR2-136 | |
Silver Bullets screen | Hampton Research | HR2-096 | |
Slice pH screen | Hampton Research | HR2-070 | |
Sodium acetate pH 5.0 | Hampton Research | HR2-933-15 | |
Sodium bromide | Hampton Research | HR2-699 | |
Sodium chloride | Hampton Research | HR2-637 | |
Sodium citrate pH 4.2 | Hampton Research | HR2-935-01 | |
Sodium citrate pH 5.6 | Hampton Research | HR2-735 | |
Sodium hydroxide | Hampton Research | HR2-583 | |
Sodium molybdate dihydrate | Molecular Dimensions | MD2-100-207 | |
Sodium nitrate | Hampton Research | HR2-661 | |
Sodium phosphate monobasic | Hampton Research | HR2-551 | |
Sodium thiosulfate pentahydrate | Molecular Dimensions | MD-100-307 | |
StockOptions Polymer screen | Hampton Research | HR2-227 | |
Tacsimate pH 7 | Hampton Research | HR2-755 | |
TAPS pH 9.0 | bioWORLD | 40121071 | |
Tris pH 8 | Hampton Research | HR2-900-11 | |
Tris pH 8.5 | Hampton Research | HR2-725 | |
ViaFLO 384 | Integra | ||
ViaFLO 384 384 channel pipettor head (0.5-12.5µL) | Integra | ||
ViaFLO 384 96 channel pipettor head (300µL) | Integra | ||
Zinc acetate dihydrate | Hampton Research | HR2-563 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved