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摘要

该协议详细介绍了高通量结晶筛选，范围从1，536微测定板制备到6周实验时间窗口结束。包括有关样品设置、获得的成像以及用户如何使用支持人工智能的图形用户界面进行分析以快速有效地识别大分子结晶条件的详细信息。

摘要

X射线晶体学是识别大分子结构最常用的技术，但是将蛋白质结晶成适合衍射的有序晶格的关键步骤仍然具有挑战性。生物分子的结晶在很大程度上是由实验定义的，这个过程可能是劳动密集型的，对资源有限机构的研究人员来说是令人望而却步的。在国家高通量结晶 （HTX） 中心，已经实施了高度可重复的方法以促进晶体生长，包括自动化高通量 1，536 孔微批次油下板设置，旨在对广泛的结晶参数进行采样。在 6 周内使用最先进的成像模式监测板，以深入了解晶体生长情况，并准确区分有价值的晶体命中。此外，实施用于识别晶体命中的训练有素的人工智能评分算法，再加上用于查看实验图像的开源、用户友好界面，简化了分析晶体生长图像的过程。这里描述了用于制备混合物和结晶板、对板进行成像以及识别命中的关键程序和仪器，以确保可重复性并增加成功结晶的可能性。

引言

即使在结构生物学方法取得巨大进步的时代，X射线晶体学仍然是生成高质量大分子结构模型的可靠和流行的方法。存入蛋白质数据库 （PDB） 的所有三维结构模型中超过 85% 来自基于晶体的结构方法（截至 2023 年 1 月）。1 此外，X射线晶体学对于解决蛋白质配体结构仍然是必不可少的，蛋白质配体结构是药物发现和开发过程的关键组成部分2。尽管半个多世纪以来蛋白质结晶一直是占主导地位的结构生物学技术，但基于物理性质3 或序列4，5 预测结晶可能性的方法仍处于起步阶段。

对结晶条件的预测更加模糊;即使在预测可能的结晶条件方面，即使对于模型蛋白6，7，也取得了有限的进展。其他研究试图根据蛋白质同源性和从PDB8，9，10开采的条件来确定结晶条件。然而，在PDB中发现的预测能力是有限的，因为只有最终的，成功的结晶条件被沉积，这必然会错过微调晶体生长所需的通常广泛的优化实验。此外，许多 PDB 条目缺少包含这些详细信息的元数据，包括鸡尾酒配方、结晶格式、温度和结晶时间11，12。因此，对于许多感兴趣的蛋白质，确定结晶条件的最容易获得的方法是通过实验，在广泛的化学可能性中使用尽可能多的条件。

已经探索了几种使结晶筛选尽可能富有成效和彻底的方法，包括稀疏基质13，不完全因子筛选14，添加剂15，16，晶种17和成核剂18。豪普特曼-伍德沃德医学研究所 （HWI） 的国家 HTX 中心开发了一种使用微批次油下方法进行结晶筛选的有效管道19，该方法利用自动液体处理和成像模式来简化初始结晶条件的识别，使用相对最小的样品和混合物体积（图 1).这套 1，536 种独特的鸡尾酒基于先前确定的有利于蛋白质晶体生长的条件，并且设计为化学多样性，以便对各种可能的结晶条件进行采样20，21，22。结晶条件的广泛采样增加了观察一个或多个结晶导联的可能性。

文献中很少出现关于筛查需要多少条件的正式分析。一项研究侧重于不同屏幕的抽样布局，发现组件的随机抽样（类似于不完整的因子）代表了最彻底和最有效的抽样方法23。另一项关于筛选的研究指出，在很多情况下，非常彻底的1，536个筛选只产生了一个晶体命中24，最近的一项研究强调，大多数商业筛选对已知与筛选命中25相关的结晶空间进行了采样。由于晶体内固有的无序、衍射限制或晶体缺陷，并非所有结晶引线都能产生适合数据收集的衍射质量晶体;因此，为条件投下更宽的网具有提供替代晶型以进行优化的额外好处。

蛋白质结晶实验的形式也对筛选的成功有影响。蒸汽扩散是高通量结晶应用中最常用的设置，用于最先进的结晶中心，包括汉堡EMBL和巴斯德研究所高通量筛选中心26，27，28。HTX中心使用微批次油下法;虽然不太常用，但它是一种稳健的方法，可最大限度地减少样品和结晶混合物的消耗20，21，22。微批次油下法的一个优点，特别是在使用高粘度石蜡油时，是在实验过程中液滴内仅发生轻微蒸发，这意味着在液滴混合时达到平衡浓度。如果在微批次油下法中观察到积极的结晶结果，则这些条件的再现通常比在蒸汽扩散设置中更直接，在蒸汽扩散设置中，结晶发生在结晶液滴和储层之间平衡期间的某个未定义点。命中的重现性对于高通量结晶方法来说是可取的，这些方法会产生非常微小的蛋白质晶体，通常需要针对单晶X射线实验进行优化。

可溶性蛋白质的高通量结晶筛选由内部制备的混合物、现成的商业筛选和内部修饰的商业筛选22组成。鸡尾酒最初是使用不完全阶乘策略开发的，使用以前成功的结晶鸡尾酒20。筛选中市售的试剂包括聚合物阵列、结晶盐、PEG和离子组合以及利用稀疏基质和不完整因子方法的筛选。还有一些试剂在包含在筛选之前经过修饰：添加剂筛选、pH 和缓冲筛选、离子液体添加剂筛选和聚合物筛选。

1，536 种结晶混合物利用了已知结晶条件和策略的强大功能，以及微批次油下系统的优势，以生成采用自动液体处理、自动明场成像和手性晶体二阶非线性成像 （SONICC） 的管道。液体处理和成像的自动化提供了更少的湿实验室时间和更高的可重复性的好处。自动化结晶筛选的高通量特性要求晶体生长监测过程的自动化。这些进步是通过最先进的成像技术实现的，以协助识别阳性晶体撞击。板的标准明场成像以及用于增强检测的多光子方法均通过带有SONICC的晶体成像系统使用（图2）。SONICC结合了二次谐波发生（SHG）29显微镜和紫外双光子激发荧光（UV-TPEF）30显微镜，以检测非常小的晶体以及被沉淀物遮挡的晶体。SONICC成像可告知孔是否含有蛋白质（通过UV-TPEF）和晶体（通过SHG）。除了蛋白质晶体的阳性鉴定外，还可以使用最先进的成像方法获得其他信息。添加样品前仅鸡尾酒成像作为阴性对照;这些图像可以在添加样品之前识别孔的外观，包括盐晶体和碎片。此外，SHG 和 UV-TPEF 成像有助于区分蛋白质晶体和盐晶体，并可用于可视化蛋白质-核酸复合材料31。

通过成像进行重复监测的高通量结晶实验会产生大量需要检查的图像。已经开发了自动晶体评分方法，以减轻用户的负担并增加识别正晶体命中的可能性。HTX中心参与了MAchine结晶结果识别（MARCO）评分算法的开发，这是一种经过训练的深度卷积神经网络架构，由学术，非营利，政府和行业合作伙伴组成的联盟开发，用于对明场井图像进行分类32。该算法是在来自多个机构的结晶实验中使用不同的结晶方法和不同的成像仪对近五十万张明场图像进行训练的。该算法输出一个概率分数，指示给定图像是否属于四个可能的图像类：“晶体”、“透明”、“沉淀”和“其他”。MARCO报告的分类准确率为94.5%。通过实现该算法并提供图形用户界面 （GUI） 的软件进一步增强了晶体检测，用于访问和简单的图像查看，并通过支持 AI 的评分功能启用32，33。MARCO Polo GUI 旨在与 HTX 中心的成像和数据管理系统的设置无缝协作，以识别 1，536 孔筛选中的命中率，并人工参与检查排序列表的输出。此外，作为GitHub上提供的开源软件，GUI可以随时修改，以反映其他实验室组的特定需求。

这里描述了使用机器人液体处理来输送鸡尾酒和蛋白质的高通量微批次油下实验的过程。HTX中心拥有一系列其他机构所没有的独特仪器和资源，旨在为感兴趣的用户提供筛查服务和教育资源。展示机器人支持的高通量技术的方法和能力将使社区能够了解可用技术并为自己的结构确定工作做出决策。

研究方案

1. 为16个96孔深井块准备或购买鸡尾酒

  1. 通过将分液到 96 孔深井 （DW） 块中来制备内部生成的化学混合物。使用机器人液体处理器分配和混合盐、缓冲液、聚合物和水的储备溶液。
  2. 使用机器人液体处理器或多通道移液器制备内部改性化学混合物，将其他组件添加到已商业购买的 96 孔 DW 块筛中。
  3. 购买市售的 DW 块。
  4. 将标记的96孔DW块在-20°C下储存12-18个月。
    注意：在步骤1.1中准备的鸡尾酒。和 1.2.填充 10/16 96 孔 DW 模块，并使用购买的 5/16 96 孔 DW 模块。在1，536孔板分液时，在筛网中设置一个96孔DW模块，以避免添加剂筛沉淀（参见第3节）。

2. 将鸡尾酒分配到 384 孔板中

  1. 将96孔DW块在4°C下解冻过夜。在开始制备384孔板之前，将其置于室温（20-23°C）。
    注意：室温适合准备鸡尾酒盘。制备这些板的主要问题是避免沉淀物，沉淀物会堵塞液体处理设备并导致鸡尾酒成分浓度的不可预测的变化。
  2. 根据需要通过倒置彻底混合块，以溶解任何持久的不透明沉淀物。如果任何孔含有沉淀物，请将块加热至30°C溶解。
  3. 使用配备 96 注射器或移液器头的液体处理机器人将来自四个 96 孔 DW 模块的 50 μL 鸡尾酒溶液输送到一个 384 孔板中。将四个 96 孔 DW 模块冲压到 384 孔板中，以便填充象限（例如，96-DW1 的 A1 到 384 板的 A1，96-DW2 的 A1 到 384 板的 B1 等）（图3）。
  4. 将 16 个 96 孔 DW 模块中的 15 个输送到 384 孔板进行存储。
  5. 将384孔板在-20°C下储存长达6个月，用于制备1，536孔板。

3. 用油和结晶混合物制备 1，536 孔板

  1. 使用具有缓慢抽吸和输送能力的机器人液体处理系统将 5 μL 石蜡油输送到 1，536 孔板的每个孔中。将油板在4°C下储存长达6个月。
  2. 将第2节的384孔板在4°C下解冻过夜。倒置板以混合溶液并溶解沉淀物。将板在30°C孵育以溶解持久性沉淀物。
  3. 为了制备添加剂筛选组件，请使用含有0.1 M HEPES pH 6.8，30%PEG3350的最终96孔DW模块，通过使用液体处理机器人或多通道移液器与商业添加剂筛选混合。
  4. 通过在适当的384孔板中将步骤3.3中制备的缓冲PEG3350溶液和添加剂筛选的1：1混合物分配至最终体积为50μL来制备添加剂筛选溶液。
  5. 使用配备 384 注射器或移液器头的液体处理机器人将 200 nL 的鸡尾酒溶液输送到 1，536 孔板的每个孔中。将四个 384 孔板压入 1，536 孔板中，以便填充象限（例如，1，536 孔板的 384 板 A1 至 A1，384 孔板的 A2 至 A3，1，536 孔板的 A2 等）（图3）。
  6. 将板以150 ×g 离心5分钟，然后在4°C下储存长达4周。

4. 样品提交

  1. 要提交样品，请在即将进行的筛选运行的预订截止日期之前发送预订电子邮件。包括筛选实验的数量、名称、PI 和机构，以及样品的任何特殊处理要求。筛查运行大约每月进行一次，每年运行 12 次。
  2. 在运送样品之前填写样品提交表格。
    1. 对于新用户，请选择一个 密码 ，该密码将用于下载第 7 节中的结晶图像。
    2. 对于已建立的用户，请使用现有密码或在此步骤中更改 密码 。
  3. 将样品提交到 1.5 mL 管中。确保大分子均匀且充分浓缩以促进结晶。使用通常由硫酸铵或PEG 4，000组成的预结晶测试，通过观察测试的样品浓度是否导致清晰的液滴或沉淀34来研究适当的样品浓度。
    注意：在提交样品之前可以进行适当的质量测试以检查纯度和均匀性，包括SDS-PAGE，凝胶过滤和动态光散射（DLS）等。即使是微小杂质的存在也会影响结晶。目前需要 500 μL 的样品体积来设置一个 1，536 孔板。测试正在进行中，以减少样品量要求。
    1. 避免使用大于50 mM的缓冲液浓度以及可能在筛网内结晶的磷酸盐。
    2. 避免使用过量的增溶剂，包括甘油浓度大于10%w/v。
  4. 使用干冰、湿冰或密封容器中的冷却包包装样品以安全地保持适当的温度。
  5. 在运行期间的周一至周三隔夜运送样品优先权。
  6. 样品发货后，通过电子邮件发送跟踪号。

5. 准备好的 1，536 孔板中的样品设置

  1. 打开样品包装并立即在用户要求的温度下孵育。
  2. 解冻后，在室温下以10，000× g 离心样品2分钟。在设置之前目视观察样品，以确定样品的沉淀、颜色和状况。
  3. 将1，536孔板加热至23°C，并以150 ×g 离心5分钟。使用明场成像作为阴性对照对仅鸡尾酒板进行成像。
    注意：在样品设置之前，所有板都使用明场成像成像，这使得在添加样品作为阴性对照之前能够识别其中已经有晶体或碎片的孔。此外，它能够识别 尚未 交付结晶混合物的井。将板加热至室温可消除板表面的冷凝，从而获得清晰的图像。
  4. 使用液体处理机器人将 200 nL 样品分配到 1，536 孔板中的每个孔中。以150× g 离心板，并在4°C，14°C或23°C下孵育板。
    注意：微量油下实验可以通过将蛋白质和混合物分配到所需油下来手动设置。但是，建议使用不少于1 μL的每种蛋白质和混合物，以获得可重复的结果。

6. 监测 1，536 孔板的晶体形成

  1. 将样品添加到 1，536 孔板后，在第 1 天和第 1 周、第 2 周、第 3 周、第 4 周和第 6 周使用明场成像成像。
  2. 对于在23°C孵育的板，在4周时间点和在14°C或4°C孵育的板的6周时间点使用SHG和UV-TPEF进行SONICC成像。
    注意：SONICC成像的时间安排在高通量1，536显微测定板的4周和6周时间点，因为通常，晶体会在这些时间点出现。为了在油或蒸汽扩散实验下对96孔微批次进行修改，建议在时间窗口的早期进行SONICC成像。
  3. 访问已使用内部LIMS系统自动传输到用户帐户的实验图像。通过自动 htslab 电子邮件守护程序 通知 用户已发生映像。

7. 图像分析

  1. 从 HWI ftp 站点检索每个.rar文件的放映图像。
    注意： 从 1，536 屏幕输出的图像会产生许多包含明场图像、SHG 图像和 UV-TPEF 图像的文件。每个成像模式或时间点都是一个单独的.rar文件。解压缩后，每个.rar文件都包含使用特定成像模式在特定时间点的 1，536 孔板的每个孔的图像。
    1. 使用 FileZilla 客户端或其他选项访问 ftp 数据。
      注意：建议使用 FileZilla 客户端来管理大型文件传输量，以最大程度地减少计算崩溃。
      1. 如果需要在用户计算机上安装 FileZilla 客户端，请下载 FileZilla 软件。
      2. 如果 FileZilla 客户端已安装或在安装时，请单击 FileZilla 图标 以打开软件。
      3. 通过输入主机 ftp 网站、用户名和密码从 FileZilla 登录到远程 ftp 服务器。
      4. 将.rar文件下载到所需的目录。
  2. 使用 AI 支持的开源 GUI 查看、评分和分析结晶图像。
    注意：GUI 可以在大多数 Windows、Mac 和 Linux 操作系统 （OS） 上使用，特定于操作系统的下载说明位于 GitHub 站点上。MARCO Polo 是一个开源 GUI，它整合了来自 HTX 中心实施的高通量 1，536 结晶屏幕的元数据。任何人都可以从 GitHub 下载它进行修改，以反映其他实验室组的特定需求。
    1. 下载.rar文件后，在 GUI 中打开该文件（请参阅 补充图 S1）。
      1. 单击 导入，从下拉菜单中选择 图像 ，然后选择 从 Rar 存档/目录。
      2. 单击弹出窗口中的 “浏览 文件夹”，然后导航到包含图像的文件夹。
      3. 选择所需的文件，然后单击“ 打开”导入到 GUI 中。等待文件出现在 “所选路径 ”窗口中。选择要下载到 GUI 中的一个或多个文件，然后单击导入 运行。
    2. 在GUI的 幻灯片查看器 窗口中查看第一个孔的图像，方法是单击样品名称左侧的 > 符号，然后双击它来选择适当的读数（读数按图像明场，UV-TPEF或SHG的日期和类型列出）。
    3. 通过调整整个窗口的大小来放大图像。“图像详细信息”框包含有关 图像 的信息，包括评分信息（在读取评分之前为空）。“鸡尾酒详细信息”框包含有关 鸡尾酒 组件的元数据。
    4. 通过单击导航面板中的“下一步”按钮或按键盘上的向右箭头键移动到下一个井。通过在“按井号”窗口中输入井号导航到特定井。
    5. 通过选中“ 显示所有日期 ”框来查看所有读数（导入到 GUI 中的读数）。
    6. 通过选中“显示所有光谱”框来查看 所有光谱 （导入到 GUI 中的光谱）。单击交换频谱按钮可单独查看每个 频谱 图像。
  3. 使用 MARCO 算法对晶体图像进行评分，方法是首先从窗口左侧的列表中突出显示特定运行。接下来，单击“ 分类选定的运行 ”按钮。在所有 1，536 孔的成像读数评分后，在 “图像详细信息 ”窗口中查看 MARCO 评分信息。
    注：分类通常需要 2-5 分钟，具体取决于计算机速度和可用内存。该算法生成的分数将内容分类为“晶体”、“清除”、“沉淀”或“其他”类。与每个井的分类相关联的数值反映了井包含该类对象的可能性。
    1. 通过在 “图像过滤 ”面板中勾选所需的框并单击“ 提交过滤器 ”按钮，查看评分图像的子集。例如，仅查看被MARCO分类为水晶的图像，方法是勾选 水晶 和 MARCO 框，然后单击 提交过滤器。
  4. 手动对晶体图像进行评分以生成“人类评分”集。通过单击相应的按钮为井分配分数（“晶体”、“清除”、“沉淀”或“其他”按钮位于窗口底部的 分类 面板中）。或者，使用键盘上的数字键盘分配分数（1 = “水晶”，2 = “清除”，3 = “沉淀”，4 = “其他”）。通过勾选收藏夹将人工评分的图像指定为“收藏 夹”？ 箱。
    注意：仅查看被人类分类为水晶的图像，方法是勾选水晶和人体框，然后单击提交过滤器。单击“过滤”面板中的“收藏夹”框可进一步缩小返回的图像范围，仅返回也是收藏夹的人工评分水晶图像。
  5. 使用“板查看器”选项卡一次查看多个孔。在“控制面板”的第二个“印版查看器”选项卡上，从“每个印版的图像”部分的下拉菜单中选择 16、64 或 96 张图像。 使用“图像过滤”选项卡可将不感兴趣的图像灰化。选择“应用筛选器”框以筛选图像。
    注意：例如，选择“人类”和“水晶”框，只有那些被人类评分为水晶的井才容易看到。
    1. 在“ 板查看器 ”选项卡中导航，方法是单击 “下一步 ”按钮以查看下一组 16/64/96 图像。默认情况下，计分为晶体的图像为红色，计分为清晰的影像为蓝色，计分为沉淀的图像为绿色，计分为其他的图像为橙色。使用下拉菜单更改颜色。
    2. 通过勾选 标签选项卡上的各个 框来选择要显示在孔上的信息。
    3. 单击“保存视图”以 保存当前视图 的图像文件。
    4. 单击交换 光谱 以在明场、SHG 和 UV-TPEF 图像之间切换多孔图像。
  6. 单击导出，然后从下拉菜单中选择适当的文件类型以导出评分文件以用于其他程序。
    注意：CSV（逗号分隔值）文件与电子表格程序（如 Microsoft Excel 或 Google 表格）兼容。JSON（JavaScript Object Notation）文件可以用大多数文本编辑器打开。PPTX（PowerPoint 演示文稿）可用于显示来自 Polo 的图像，包括明场、UV-TPEF 和 SHG 图像的比较。文件以.xtal格式保存，以便在马可波罗GUI中重新打开。
    1. 通过单击页面顶部的“文件”，然后选择“保存运行”或“将运行另存为”来保存 .xtal 格式的文件。提供文件名和目录位置。
    2. 打开 .xtal 格式文件，方法是单击“ 导入 ”并选择“ 图像 ”，然后选择 “从保存的运行”。浏览相应的文件位置，单击文件名，然后单击“ 打开”。

代表性结果

1，536孔晶体筛选实验的结果包括在第0天（阴性对照），第1天，第1周，第2周，第3周，第4周和第6周收集的七个完整的明场图像集（图4）。对于在23°C孵育的板，在4周时间点收集SONICC图像，对于在4°C或14°C孵育的板，在6周时间点收集SONICC图像。 总之，一旦样品发货，用户可以预期在到达后 1 天内设置好他们的板。图像将在收集时上传。结晶筛选实验在6周后结束。

1，536孔板设置允许在同一板内进行所有筛选实验，从而限制样品消耗并促进成像和成像模式之间的直接比较。单一鸡尾酒条件下晶体生长时间过程的代表性结果如图4所示。在整个实验过程中，自动板成像允许通过明场成像识别快速和缓慢生长的晶体。UV-TPEF和SHG成像允许交叉验证通过明场成像观察到的命中，并表明观察到的晶体分别是蛋白质和结晶（图5A，B）。此外，SONICC成像能够识别被沉淀物或薄膜（图5C）视觉遮挡的晶体或可能被误认为沉淀物的微晶体（图5D）。对于某些晶体，缺少SHG信号并不表示不合格，因为某些点基不产生SHG信号35，36，如图5C中的四方thaumatin晶体所示。相反，对于缺乏色氨酸残基的蛋白质，应该预料到缺乏UV-TPEF信号。观察UV-TPEF和SHG信号也有助于识别非蛋白质盐晶体，这些晶体将出现在明场中并表现出强烈的正SHG信号，但缺乏UV-TPEF信号（图5E）。

MARCO Polo GUI 简化了印版设置的图像分析，它还捆绑了来自 HWI 服务器的 ftp 数据传输（作为使用 FileZilla 传输文件的替代方案）。MARCO Polo GUI 允许轻松导航的板和图像查看，并使用 MARCO 算法执行计算图像评分，以便可以从 HTX 中心快速下载、查看和分析图像结果。在 MARCO Polo GUI 中实施的 MARCO 评分算法能够在不到 5 分钟的时间内对整个 1，536 孔板的图像进行评分。被 MARCO 算法标记为晶体的图像随后可以通过 Polo GUI 进行排序以进行显示。由于 MARCO 算法针对晶体识别和最小化误报进行了优化，以免错过任何正命中，因此评分可能会导致误报标志。然而，MARCO能够通过将注意力集中在含有晶体的高概率的孔上来限制需要检查的图像集，从而大大减少了用户的数据处理负担。该算法在用户友好的MARCO Polo观看平台中便捷实现，能够根据MARCO分数对图像进行排序，大大提高了用户快速分析数据集和准确确定水晶命中的能力。

figure-representative results-1530
图 1：在 HTX 中心进行的高通量 1，536 孔结晶筛选实验示意图。 （1） 在此步骤中，向每个孔中加入 5 μL 石蜡油和 200 nL 鸡尾酒（方案步骤 3.1 和步骤 3.5）。右边显示了一口只装有油和鸡尾酒的井的卡通插图以及一张代表性图像。（2） 样品到达 HTX 中心（协议步骤 5.1）。3）在此步骤中，向每个孔中加入200nL样品（协议步骤5.4）。（4）使用明场成像随时间监测所有1，536个孔，5）以及UV-TPEF和SHG模式（协议步骤6）。6） 支持 AI 的开源 GUI 用于查看、评分和分析结晶图像（协议步骤 7）。缩写：HTX = 高通量结晶;UV-TPEF = UV-双光子激发荧光;SHG = 二次谐波产生;人工智能=人工智能;GUI = 图形用户界面。请点击此处查看此图的大图。

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图 2：包含筛选实验的单个 1，536 孔板，使用明场、UV-TPEF 和 SHG 成像成像。 1，536孔板以美国便士的比例显示（顶部）。每个筛选实验在设置前成像一次，在添加样品后用明场成像成像六次（总共七个明场图像集，左）。板在 4 周或 6 周时进行 UV-TPEF（中）和 SHG（右）成像。缩写：UV-TPEF = UV-双光子激发荧光;SHG = 二次谐波产生。 请点击此处查看此图的大图。

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图 3：显示如何生成 1，536 孔板的示意图。 16 个 96 孔 DW 模块用于冲压出四个 384 孔板，每个 384 孔板的每个象限都填充分配结晶混合物。四个 96 孔 DW 模块填充一个 384 孔板（中间）。四个 384 孔板用于冲压出单个 1，536 孔板（右）。缩写：DW = 深井。 请点击此处查看此图的大图。

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图 4：1，536 孔筛选实验中单个孔的代表性时间过程。 在样品设置之前（第0天）对板进行成像，并在第1天、第1周、第2周、第3周、第4周和第6周进行明场成像。将孵育在23°C的板在第4周用SONICC成像。比例尺 = 80 μm（明场），200 μm（SHG，UV-TPEF）。缩写：SONICC = 手性晶体的二阶非线性成像;UV-TPEF = UV-双光子激发荧光;SHG = 二次谐波产生。 请点击此处查看此图的大图。

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图 5：HT 1，536 晶体筛选实验的代表性成像结果。 显示了五个示例孔的明场、UV-TPEF 和 SHG 成像结果。（一，二）通过明场、UV-TPEF 和 SHG 成像观察到的蛋白质晶体在所有三种成像模式中都清晰可见。（C）在明场成像中被薄膜遮挡的蛋白质晶体通过UV-TPEF成像可见;由于点群不相容，SHG成像无法观察到晶体。（D）通过UV-TPEF和SHG成像验证的微晶体示例，否则可能被认为是沉淀物。（E）盐晶体的例子，通过明场和SHG成像看起来是结晶的，但没有表现出UV-TPEF信号。比例尺 = 200 μm。孔径 = 0.9 毫米。缩写：UV-TPEF = UV-双光子激发荧光;SHG = 二次谐波产生。 请点击此处查看此图的大图。

补充图S1：在马可波罗中打开图像文件。图像文件可以在马可波罗 GUI 中打开，方法是导航到导入 | 顶部的“图像”选项卡 （a）。请注意，文件也可以通过 From FTP 工具直接在 MARCO Polo （a） 中传输，也可以按照协议步骤 7.2 中的说明通过 FileZilla 传输。要导入已下载的文件，请选择“图像 | 来自 RAR 存档/目录。在出现的弹出窗口中，选择浏览文件夹 （b），然后导航到保存板图像文件的文件目录。文件位于“选定路径”窗口 （c） 中后，突出显示一个文件，然后单击“导入运行”（d）。马可波罗 GUI 将识别正确的鸡尾酒文件元数据，以便与图像一起导入。请点击此处下载此文件。

讨论

该方法描述了一种用于蛋白质结晶筛选的高通量管道，只需 500 μL 样品即可进行 1，536 次油下微批次形式的单独结晶实验。该管道依靠液体处理机器人来快速、可重复地帮助实验设置，以及计算图像分析资源 MARCO Polo，该资源定制用于使用 MARCO 算法分析 1，536 孔板图像，以识别和隔离晶体命中。

单个筛选液滴的小体积（总共 400 nL，样品：混合物的比例为 1：1）意味着需要极小的样品体积来识别阳性结晶条件。这些小液滴必然会产生传统循环无法捕获的小晶体。已经开发出从1，536个盘子中收获的方法37;此外，带有晶体的板已直接用于同步加速器源，用于 原位 数据收集38。如果开发出一种可靠的方法来收获这些晶体，同步加速器技术和微聚焦光束的进步将进一步获得有用的数据集。此外，获得的晶体可能用作优化工作的种子。

SONICC成像在识别小蛋白质晶体和隐藏在沉淀物下的蛋白质晶体方面显然具有优势。尽管有这些优点，但并非所有样品类型都适合SHG和UV-TPEF成像。例如，具有很少或没有芳香色氨酸残基的蛋白质将显示模糊的UV-TPEF信号。此外，特定空间群中的晶体，包括中心对称群或点群432，将无法通过SHG成像检测到。带有荧光团的样品有时会干扰SHG信号，导致信号抵消或强度增加，这意味着需要仔细解释含金属蛋白质和含荧光部分的蛋白质的SHG信号。然而，在许多情况下，可以合理化SHG或UV-TPEF信号的缺失，并且缺乏这些信号并不一定排除蛋白质晶体的存在。

微批次油下形式为用于高通量晶体学的更常见的蒸汽扩散方法提供了一种替代方案。重要的是，结晶形式会影响命中识别39，这为使用不同的结晶形式进行高通量筛选工作提供了理由。自动成像和支持SONICC的模式有助于在整个6周的实验时间过程中快速鉴定蛋白质晶体。最后，MARCO Polo GUI使用户能够快速分析来自1，536个条件的图像，以识别有希望的命中井以进行优化。HTX中心的功能，包括机器人驱动的高通量实验装置，加上最先进的成像和计算分析工具，使研究人员能够有效地解决基于晶体的结构工作的主要瓶颈：寻找结晶条件，从而为结构生物学界做出了重大贡献。

披露声明

作者没有相互竞争的经济利益或其他利益冲突。

致谢

我们要感谢我们的用户将他们的宝贵样品委托给我们进行晶体筛选，并提供重要的反馈和要求，帮助我们完善和发展我们的资源，以更好地为结构生物学界服务。我们还要感谢Ethan Holleman，Lisa J Keefe博士和Erica Duguid博士，他们推动了MARCO Polo GUI的发展。我们要感谢 HWI 同事的支持和建议，尤其是戴安娜 CF Monteiro 博士。我们感谢美国国立卫生研究院的资金支持，R24GM141256。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1536 Well Imp@ct LBR LoBaseGreiner Bio-One790 801
Acetic acidHampton ResearchHR2-853
AlumaSeal II Sealing FilmHampton ResearchHR8-069
Ammonium bromideMolecular DimensionsMD2-100-247
Ammonium chlorideHampton ResearchHR2-691
Ammonium hydroxideHampton ResearchHR2-855
Ammonium nitrateHampton ResearchHR2-665
Ammonium phosphate dibasicHampton ResearchHR2-629
Ammonium phosphate monobasicHampton ResearchHR2-555
Ammonium sulfateHampton ResearchHR2-541
Ammonium thiocyanateMolecular DimensionsMD2-100-301
Bicine pH 9.0Hampton ResearchHR2-723
Bis-tris propane pH 7.0Hampton ResearchHR2-993-08
Calcium acetateHampton ResearchHR2-567
Calcium chloride dihydrateHampton ResearchHR2-557
CAPS pH 10.0Rigaku Reagentsnone given
ClearSeal FilmHampton ResearchHR4-521
Cobalt sulfate heptahydrateMolecular DimensionsMD2-100-42
Crystal Screen HT screenHampton ResearchHR2-130
FormulatorFormulatrix
GlycerolHampton ResearchHR2-623
Gryphon liquid handling robotArt Robbins Instruments
HEPES pH 7.0Hampton ResearchHR2-902-03
HEPES pH 7.5Hampton ResearchHR2-902-08
HWI HTX Center sample submission formhttps://hwi.buffalo.edu/high-throughput-crystallization-screening-center-sample-submission-form/    
Hydrochloric acidHampton ResearchHR2-581
Index HT screenHampton ResearchHR2-134
Ionic Liquid screenHampton ResearchHR2-214
Lithium bromideMolecular DimensionsMD2-100-312
Lithium chlorideHampton ResearchHR2-631
Lithium sulfate monohydrateHampton ResearchHR2-545
Magnesium acetate tetrahydrateHampton ResearchHR2-561
Magnesium chloride hexahydrateHampton ResearchHR2-559
Magnesium nitrate hexahydrateHampton ResearchHR2-657
Magnesium sulfate heptahydrateHampton ResearchHR2-821
Manganese chloride tetrahydrateMillipore Sigma63535-50G
Manganese sulfate monohydrateMolecular DimensionsMD2-100-310
MARCO Polo GUI downloadhttps://hauptman-woodward.github.io/Marco_Polo/
Matrix Platemate 2 x 3 liquid handling robotThermo Scientific
MES pH 6.0Hampton ResearchHR2-943-09
Mosquito liquid handling robotSPTLabtech
Paraffin Oil/White Mineral Oil Saybolt Viscosity 340-365 at 100 °F Sigma AldrichPX0045-3
PEG 1000Hampton ResearchHR2-523
PEG 2000Hampton ResearchHR2-592
PEG 20000Hampton ResearchHR2-609
PEG 3350Hampton ResearchHR2-527
PEG 400Hampton ResearchHR2-603
PEG 4000Hampton ResearchHR2-529
PEG 6000Hampton ResearchHR2-533
PEG 8000Hampton ResearchHR2-535
PEG/Ion HT screenHampton ResearchHR2-139
PEGRx HT screenHampton ResearchHR2-086
Plate reservationshtslab@hwi.buffalo.edu
Potassium acetateHampton ResearchHR2-671
Potassium bromideHampton ResearchHR2-779
Potassium carbonateMolecular DimensionsMD2-100-311
Potassium chlorideHampton ResearchHR2-649
Potassium nitrateHampton ResearchHR2-663
Potassium phosphate dibasicHampton ResearchHR2-635
Potassium phosphate-monobasicHampton ResearchHR2-553
Potassium phosphate-tribasicMolecular DimensionsMD2-100-309
Potassium thiocyanateHampton ResearchHR2-695
Rock Imager 1000 with SONICCFormulatrix
Rock Imager 54Formulatrix
Rubidium chlorideMillipore SigmaR2252-10G
SaltRx HT screenHampton ResearchHR2-136
Silver Bullets screenHampton ResearchHR2-096
Slice pH screenHampton ResearchHR2-070
Sodium acetate pH 5.0Hampton ResearchHR2-933-15
Sodium bromideHampton ResearchHR2-699
Sodium chlorideHampton ResearchHR2-637
Sodium citrate pH 4.2Hampton ResearchHR2-935-01
Sodium citrate pH 5.6Hampton ResearchHR2-735
Sodium hydroxideHampton ResearchHR2-583
Sodium molybdate dihydrateMolecular DimensionsMD2-100-207
Sodium nitrateHampton ResearchHR2-661
Sodium phosphate monobasicHampton ResearchHR2-551
Sodium thiosulfate pentahydrateMolecular DimensionsMD-100-307
StockOptions Polymer screenHampton ResearchHR2-227
Tacsimate pH 7Hampton ResearchHR2-755
TAPS pH 9.0bioWORLD40121071
Tris pH 8Hampton ResearchHR2-900-11
Tris pH 8.5Hampton ResearchHR2-725
ViaFLO 384Integra
ViaFLO 384 384 channel pipettor head (0.5-12.5µL)Integra
ViaFLO 384 96 channel pipettor head (300µL)Integra
Zinc acetate dihydrateHampton ResearchHR2-563

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