نظام تسجيل تخطيط كهربية الدماغ منخفض التكلفة جنبا إلى جنب مع ملف بحجم ملليمتر لتحفيز دماغ الفأر عبر الجمجمة في الجسم الحي

Summary

يقترح نظام تسجيل كهربية الدماغ منخفض التكلفة مع ملف بحجم المليمتر لدفع التحفيز المغناطيسي عبر الجمجمة لدماغ الفأر في الجسم الحي. باستخدام أقطاب كهربائية لولبية تقليدية مع ركيزة صفيف متعددة الأقطاب مصنوعة خصيصا ومرنة ومتعددة الأقطاب ، يمكن إجراء تسجيل متعدد المواقع من دماغ الفأر استجابة للتحفيز المغناطيسي عبر الجمجمة.

Abstract

يقترح هنا نظام تسجيل تخطيط كهربية الدماغ (EEG) منخفض التكلفة لدفع التحفيز المغناطيسي عبر الجمجمة (TMS) لدماغ الفأر في الجسم الحي ، باستخدام ملف بحجم المليمتر. باستخدام الأقطاب اللولبية التقليدية جنبا إلى جنب مع ركيزة صفيف متعددة الأقطاب الكهربائية مصنوعة خصيصا ومرنة ، يمكن إجراء تسجيل متعدد المواقع من دماغ الماوس. بالإضافة إلى ذلك ، نوضح كيف يتم إنتاج ملف بحجم ملليمتر باستخدام معدات منخفضة التكلفة توجد عادة في المختبرات. كما يتم تقديم الإجراءات العملية لتصنيع ركيزة الصفيف المرنة متعددة الأقطاب الكهربائية وتقنية الزرع الجراحي للأقطاب اللولبية ، وهي ضرورية لإنتاج إشارات EEG منخفضة الضوضاء. على الرغم من أن المنهجية مفيدة للتسجيل من دماغ أي صغير ، فإن هذا التقرير يركز على تنفيذ القطب في جمجمة فأر مخدرة. علاوة على ذلك ، يمكن تمديد هذه الطريقة بسهولة إلى صغير مستيقظ متصل بكابلات مربوطة عبر محول مشترك ويتم تثبيته بجهاز TMS على الرأس أثناء التسجيل. تم وصف الإصدار الحالي من نظام EEG-TMS ، والذي يمكن أن يتضمن 32 قناة EEG كحد أقصى (يتم تقديم جهاز به 16 قناة كمثال به عدد أقل من القنوات) وجهاز قناة TMS واحد. بالإضافة إلى ذلك ، يتم الإبلاغ لفترة وجيزة عن النتائج النموذجية التي تم الحصول عليها من خلال تطبيق نظام EEG-TMS على الفئران المخدرة.

Introduction

يعد التحفيز المغناطيسي عبر الجمجمة (TMS) أداة واعدة لعلوم الدماغ البشري والتطبيق السريري وأبحاث النماذج الحيوانية بسبب غزوها غير / المنخفض. خلال المرحلة المبكرة من تطبيقات TMS ، اقتصر قياس التأثير القشري استجابة ل TMS أحادي النبض ومزدوج النبضة في البشر والحيوانات على القشرة الحركية. اقتصر الناتج القابل للقياس بسهولة على الجهود الحركية المستحثة والجهود الكهرومغناطيسية المستحثة التي تشمل القشرة الحركية ^1,2. لتوسيع مناطق الدماغ التي يمكن قياسها عن طريق تعديل TMS ، تم دمج تسجيل تخطيط كهربية الدماغ (EEG) مع TMS أحادي النبضة والمزدوجة كطريقة مفيدة للفحص المباشر للاستثارة والاتصال والديناميكيات الزمانية المكانية للمناطق في جميع أنحاء الدماغ^{بأكمله 3}،^4،5. وهكذا ، تم استخدام التطبيق المتزامن لتسجيل TMS و EEG (TMS-EEG) على الدماغ لاستكشاف مختلف مناطق الدماغ القشرية السطحية للإنسان والحيوان للتحقيق في الدوائر العصبية داخل القشرة (انظر Tremblay et ^al.6). علاوة على ذلك ، يمكن استخدام أنظمة TMS-EEG لفحص الخصائص الزمانية المكانية القشرية الإضافية ، بما في ذلك انتشار الإشارات إلى مناطق قشرية أخرى وتوليد نشاط تذبذبي ^7,8.

ومع ذلك ، فإن آلية عمل TMS في الدماغ لا تزال تخمينية بسبب عدم غزو TMS ، مما يحد من معرفتنا بكيفية عمل الدماغ أثناء تطبيقات TMS. لذلك ، فإن الدراسات الانتقالية الغازية في الحيوانات التي تتراوح من القوارض إلى البشر لها أهمية حاسمة لفهم آلية تأثيرات TMS على الدوائر العصبية ونشاطها. على وجه الخصوص ، بالنسبة لتجارب TMS-EEG المدمجة في الحيوانات ، لم يتم تطوير نظام التحفيز والقياس المتزامن بشكل مكثف للحيوانات الصغيرة. لذلك ، يطلب من التجريبيين بناء مثل هذا النظام عن طريق التجربة والخطأ وفقا لمتطلباتهم التجريبية المحددة. بالإضافة إلى ذلك ، تعد نماذج الفئران مفيدة من بين نماذج الأنواع الحيوانية الأخرى في الجسم الحي لأن العديد من سلالات الفئران المحورة وراثيا والمعزولة عن الإجهاد متاحة كموارد بيولوجية. وبالتالي ، فإن طريقة ملائمة لبناء نظام قياس مشترك TMS-EEG للفئران سيكون مرغوبا فيه للعديد من الباحثين في علم الأعصاب.

تقترح هذه الدراسة طريقة مشتركة بين TMS-EEG يمكن تطبيقها للتحفيز والتسجيل المتزامن لدماغ الفأر ، وهو النوع الرئيسي من الحيوانات المعدلة وراثيا المستخدمة في البحث ، والتي يمكن بناؤها بسهولة في مختبرات علم الأعصاب النموذجية. أولا ، يتم وصف نظام تسجيل EEG منخفض التكلفة باستخدام أقطاب لولبية تقليدية وركيزة مرنة لتعيين موضع صفيف قطب كهربائي بشكل متكرر في كل تجربة. ثانيا ، يتم إنشاء نظام تحفيز مغناطيسي باستخدام ملف بحجم المليمتر ، والذي يمكن بسهولة تصنيعه حسب الطلب في المختبرات النموذجية. ثالثا ، يسجل النظام المشترك TMS-EEG النشاط العصبي استجابة للتحفيز الصوتي والمغناطيسي. يمكن أن تكشف الطريقة المقدمة في هذه الدراسة عن الآليات التي تولد اضطرابات محددة في الحيوانات الصغيرة ، ويمكن ترجمة النتائج التي تم الحصول عليها في النماذج الحيوانية لفهم الاضطرابات البشرية المقابلة.

Protocol

في الدراسة الحالية ، تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات باتباع دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر وبموافقة من اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة هوكايدو. تم استخدام الفئران C57BL / 6J ، اثنان من الذكور وثلاث إناث ، من 8 إلى 10 أسابيع ، في هذه الدراسة. هذا هو الإجراء النهائي. تم الحصول على الحيوانات من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).

1. تصميم وبناء صفيف مرن ثنائي الأبعاد

1. قم بإعداد العدد المطلوب من الأقطاب اللولبية المصغرة (غير القابل للصدأ ، SUS XM7 ؛ انظر جدول المواد) مع الخصائص الهيكلية التالية لاستخدامها كأقطاب تسجيل ومرجعية EEG: القطر الاسمي وطول العنق وقطر الرأس 0.6 مم و 1.5 مم و 1.1 مم على التوالي (الشكل 1 أ).
   ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام 16 قطبا لولبيا مصغرا.
2. قم بإعداد مخطط لمخطط دائرة مطبوعة على ركيزة مرنة باتباع الخطوات أدناه.
   1. قم بإنشاء نمط وسادة قطب كهربائي ثنائي الأبعاد (2D) على ركيزة مرنة (الحجم الكامل ، 41.2 مم × 19.9 مم ؛ انظر جدول المواد) لقراءة الأقطاب اللولبية. تصميم ترتيب القطب 2D. يوضح الشكل 1B الترتيبات المحددة المستخدمة في هذه الدراسة والإحداثيات النسبية من نقطة خط الأساس (علامة الصليب عند الأصل [0 ، 0]).
      ملاحظة: في هذه الدراسة ، لتسجيل النشاط العصبي في القشرة السمعية داخل الفص الصدغي ، كان وضع القطب في الاتجاه الجانبي إلى الإنسي (الأفقي) أطول من ذلك في الاتجاه من المنقار إلى الذيلية (الرأسي) (الشكل 1 ب).
   2. تأكد من أنه بالنسبة لأقطاب تسجيل EEG ، فإن كل وسادة نحاسية (انظر جدول المواد) على الركيزة المرنة لها شكل حلقة بقطر خارجي 1.3 مم وقطر داخلي 0.8 مم (الشكل 1C ، يسار). اصنع ثقبا صغيرا (قطره 0.8 مم) في الوسط ليمر كل قطب لولبي عبر الركيزة. بالنسبة للأقطاب الكهربائية المرجعية ، يجب أن يكون لكل وسادة نحاسية شكل مربع بطول جانبي يبلغ 1.4 مم ؛ وبالمثل ، قم بعمل ثقب صغير (قطره 0.8 مم) في الوسط لكل برغي ليمر عبر الوسادة المربعة على الركيزة (الشكل 1C ، يمين).
   3. بعد ذلك ، لحام موصل مثبت على السطح (الشكل 1D ، يسار) ، تصميم منصات القراءة (صفيف 2D) المؤدي إلى الموصل (الشكل 1D ، يمين). على سبيل المثال ، استخدم موصلا به 2 × 10 دبابيس ومسافة 1.27 مم بين المسامير المجاورة (الشكل 1D ، يمين).
   4. قم بتوصيل وسادات القطب اللولبي ووسادات الموصل باستخدام كل من الطبقة السطحية والخلفية بعرض خط 0.03 مم وفاصل خط 0.03 مم (خطوط رفيعة في الشكل 1E).
   5. علاوة على ذلك ، لتوصيل القنوات المرجعية والأرضية بمكبر الصوت ، قم بتوصيل وسادات الأقطاب الكهربائية للمرجع والأقطاب الأرضية بالجزء المعزول في الجزء الخارجي من مصفوفة 2D المرنة (مستطيلان رأسيان يشار إليهما ب "G" و "HR" في الجزء السفلي من الشكل 1E). بعد تحديد القنوات المرجعية والأرضية ، تذكر لحام وسادات القطب الكهربائي بالموصلات المقابلة (انظر الخطوة 2.1).
   6. صمم بشكل صحيح منطقة مكشوفة غير مغطاة بطبقة حماية (طبقة بوليميد). قم بتعريض وسادات الموصل في الطبقة السطحية أثناء تعريض وسادات القطب اللولبي في كل من الطبقات السطحية والخلفية. يتم توضيح تصميم القطب الكهربائي بالكامل وأحجامه ومجموعة 2D المرنة المصنعة في الشكل 1E ، وتظهر صورة الركيزة المصنعة في الشكل 1F.
   7. في جزء القطب العلوي (جزء الرأس) من صفيف 2D المرن ، تأكد من أن الهيكل ثلاثي الطبقات من أعلى إلى أسفل يتكون مما يلي (سمك إجمالي 49.0 ميكرومتر): طبقة نحاسية علوية (سمك 12.0 ميكرومتر) ، طبقة متوسطة من بوليميد أساسي (25.0 ميكرومتر) ، وطبقة نحاسية سفلية (12.0 ميكرومتر) (الشكل 1G ، أعلى).
   8. حفر الطبقات النحاسية على السطح العلوي والسفلي للركيزة ، على سبيل المثال ، باستخدام النقش الرطب وتقنية التصنيع القياسية⁹.
   9. في الجزء السفلي المربع (جزء الموصل) من صفيف 2D المرن ، تأكد من أن الهيكل المكون من ست طبقات يتكون من ثلاث طبقات ، بما في ذلك طبقة نحاسية علوية (سمك 12.0 ميكرومتر) ، وطبقة بوليميد متوسطة النواة (25.0 ميكرومتر) ، وطبقة نحاسية سفلية (12.0 ميكرومتر) ، والتي تقع في طبقات بوليميد واقية ، بما في ذلك الطبقات العلوية والسفلية (كلاهما 12.5 ميكرومتر). قم بتوصيل لوح بوليميد 2 مم من الأسفل كمادة تقوية (الشكل 1 جرام ، أسفل).
      ملاحظة: للحفاظ على المرونة ، لا يتم تثبيت لوحة البوليميد المقواة على جزء الرقبة من صفيف 2D المرن بين جزء الرأس والموصل.
   10. وبالمثل ، في جزء الموصل ، قم بحفر طبقات النحاس والبوليميد الواقية في الأعلى باستخدام النقش الرطب وتقنية التصنيع القياسية.
       ملاحظة: الوزن الإجمالي لجهاز الصفيف 2D المصنع والمرن ، بما في ذلك الموصل ، هو 0.84 جم. بعد تصميم تخطيط لمصفوفة 2D مرنة ، يوصى أحيانا باستخدام الركائز من الشركة المصنعة التجارية (انظر جدول المواد) للراحة.

الشكل 1: الأجزاء المكونة للمصفوفة المرنة ثنائية الأبعاد (2D) لتسجيل تخطيط كهربية الدماغ (EEG) والجهاز المصنع بما في ذلك المصفوفة. أ: القطب اللولبي المصغر المضمن في جمجمة الفأر. (ب) وسادات الأقطاب الكهربائية المصممة لقياس نشاط الدماغ (الدوائر الخضراء) والقناة المرجعية (المربع في أسفل اليمين). يتم عرض الإحداثيات النسبية لمنصات القطب من نقطة مرجعية (علامة متقاطعة) عند الأصل (0 ، 0) ؛ الحجم بالمليمترات موضح بين قوسين. الإحداثيات المركزية لمنصات القطب متناظرة فيما يتعلق بالمحور الرأسي الذي يمر عبر العلامة المتقاطعة. (ج) وسادات الأقطاب الكهربائية وثقوب الحفر لقطب التسجيل (يسار) وقطب مرجعي (يمين) موضحة. (د) موصل مثبت على السطح (2 × 10 دبابيس) يستخدم للصفيف 2D المرن (يسار) ونمط وحجم الوسادات المصممة على الركيزة (يمين). (ه) مخطط مصمم بحجم كل جزء بالملليمترات. (F) صورة لركيزة ملفقة موضحة بالمخطط في E. (ز) هيكل طبقة صفيف 2D مرنة (أجزاء الرأس والموصل). يتم توضيح المناظر العلوية والجانبية لوسادات القطب اللولبي (أعلى) ووسادات القراءة (أسفل). يتكون الرأس وأجزاء الموصل من هيكل ثلاثي الطبقات (أعلى) وهيكل من ست طبقات (أسفل) ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، يتكون جزء الرقبة من هيكل من خمس طبقات. يتم تثبيت طبقة بوليميد واقية على السطح العلوي والخلفي ، ولا يتم تثبيت لوح بوليميد التسليح على جزء الرقبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. بناء المحول ورسم خرائط القنوات

1. قم بإجراء بناء المحول باتباع الخطوات أدناه.
   1. انشر تدفق اللحام على دبوس 2 × 10 ، وموصل التثبيت على السطح (الشكل 1D ، يسار) ووسادات الموصل للصفيف ثنائي الأبعاد (الشكل 1D ، يمين) (انظر جدول المواد) على الركيزة المرنة.
   2. قم بلحام 2 × 10 دبوس ، موصل مثبت على السطح بمنصات الموصل. على وجه الخصوص ، تأكد من الاتصال بين الوسادتين في الجزء السفلي من الصفيف ثنائي الأبعاد ودبابيس الموصل المستخدمة كقنوات مرجعية وأرضية (الشكل 2A).
   3. قم بتوصيل كل من الوسادتين بأسلاك الرصاص الفردية لتغذية إشارات خط الأساس بنقطة خارجية (على سبيل المثال ، نقطة أرضية متصلة بالقناة الأرضية لنظام القياس ؛ الشكل 2 أ).
      ملاحظة: ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، تم استخدام إحدى وسادات الأقطاب الكهربائية الدائرية ذات الأقطاب اللولبية كقطب كهربائي مرجعي بدلا من قطب كهربائي مربع في جزء الموصل.
   4. بعد اللحام ، قم بتغطية نقاط اللحام باستخدام راتنجات الايبوكسي (انظر جدول المواد) لحماية النقاط المكشوفة ومنع الدوائر القصيرة.
2. ثبت كبل الموصل ومضخم الرأس باتباع الخطوات أدناه.
   1. قم بإعداد موصل إزاحة العزل (IDC) ب 2 × 10 دبابيس ومسافة 1.27 مم (الشكل 2B ، أعلى اليسار) وكابل شريط مسطح مكون من 20 سنا (انظر جدول المواد) بمسافة 0.635 مم (الشكل 2B ، أسفل اليسار). اقطع كابل الشريط المسطح إلى الطول المطلوب (على سبيل المثال ، 40 سم).
   2. قم بتجعيد IDC وأحد طرفي كبل الشريط المسطح باستخدام أداة العقص IDC (الشكل 2B ، أعلى اليمين) (انظر جدول المواد).
   3. افصل كل سطر من الطرف الآخر من الكابل حتى 15 مم تقريبا من طرف الطرف باستخدام قاطع. قم بتجريد العزل 3 مم من طرف الطرف.
   4. قم بتوصيل IDC المجعد بكابل الشريط المسطح وموصل 2 × 10 دبوس ملحوم بالركيزة المرنة (الشكل 2C).
   5. تأكد من المراسلات بين قطب التسجيل والخط المنفصل للكابل. تأكد من أن كل سطر مستخدم لا ينتج عنه خطأ اتصال غير صحيح.
   6. قم بلحام الأسلاك النحاسية المكشوفة للخطوط الفردية المقابلة لإخراج كل قطب كهربائي إلى موصل 20 سنا (1.25 مم) لنظام القياس ، بما في ذلك مكبر الصوت الرئيسي (الشكل 2B ، أسفل اليمين).
   7. بعد اللحام ، تأكد من التوصيل بين وسادات القطب اللولبي ودبابيس الموصل باستخدام جهاز اختبار (على سبيل المثال ، مقياس LCR ؛ انظر جدول المواد).
   8. قم بتغطية نقاط اللحام باستخدام راتنجات الايبوكسي وشريط الحماية لحمايتها من التلف ومنع ملامسة خطوط الإشارة الأخرى.
   9. باستخدام راتنجات الايبوكسي ، قم بلصق قضيب رفيع من الفولاذ المقاوم للصدأ (القطر: 1.1-1.2 مم ؛ الطول: 100 مم) بالجانب الخلفي من جزء الموصل من مجموعة 2D على الركيزة المرنة.
      ملاحظة: يمكن الإمساك بهذا القضيب المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ بواسطة حامل مناور دقيق أثناء التجارب (الشكل 2C).
   10. أخيرا ، تأكد من التعيين بين الأقطاب اللولبية وقنوات خرج الإشارة (الشكل 2D).

الشكل 2: بناء المحول لمصفوفة قطب كهربائي ثنائي الأبعاد (2D) على الركيزة المرنة وتسجيل تعيين القناة. (أ) في جزء الموصل ، يتم توصيل القنوات المرجعية والأرضية بوسادات القطب السفلي بأسلاك الرصاص. إذا تم تحديد القنوات المرجعية والأرضية مسبقا ، فيجب توصيل القنوات بمنصات القطب السفلي المقابلة أثناء مرحلة التصميم. في مثل هذه الحالات ، لا يلزم لحام أسلاك الرصاص بالقنوات ومنصات الأقطاب الكهربائية. (B) يتم تجعيد موصلات العزل والإزاحة (أعلى اليسار) إلى أحد طرفي الكبل المسطح (أسفل اليسار) لربط موصل مضخم القياس (أعلى اليمين). يتم لحام جميع الخطوط التي تتوافق مع القنوات المراد استخدامها بالموصلات الخضراء (أسفل اليمين). في هذه الحالة ، نظرا لأن كل موصل أخضر متصل بمضخم الرأس مخصص لقياس ثماني قنوات ، فهناك حاجة إلى موصلين على الأقل لتسجيل إشارات نشاط الدماغ المكونة من 16 قناة. النقاط الملحومة مغطاة براتنجات الايبوكسي وشريط التدريع لمنع ملامسة خطوط الإشارة الأخرى. (ج) يتم وضع الموصل والكابل المصنع على سطح ركيزة الصفيف 2D المرنة. يتم توصيل قضيب رفيع من الفولاذ المقاوم للصدأ بالجانب الخلفي من الركيزة المرنة. (د) المواقع المكانية لقنوات التسجيل على سطح دماغ الفأر وخرائط القنوات لكل نقطة لنظام القياس. في هذه الحالة ، هناك 16 قناة تسجيل بأقطاب لولبية (دوائر حمراء) ، على الرغم من أن العدد الإجمالي لمواقع التسجيل الممكنة هو 32. تظهر القنوات ال 16 الأخرى غير المسجلة أيضا على شكل دوائر خضراء على سطح الدماغ. في مخطط رسم الخرائط ، يشير "G" و "R" إلى القنوات المصممة للأقطاب الكهربائية الأرضية والمرجعية ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. جراحة الحيوان

1. تحضير البيئة الجراحية المعقمة.
   1. ارتداء معدات واقية ، مثل قفازات اللاتكس ، أثناء الإجراء التجريبي بأكمله الذي يشمل الحيوانات.
   2. تعقيم الجهاز التجسيمي والأدوات الجراحية (انظر جدول المواد).
   3. بعد تعقيم الأدوات الجراحية ، اغسلها باستخدام محلول ملحي معقم.
2. تخدير الحيوانات.
   1. قياس وزن الماوس قبل الجراحة. يتم تطبيق كبريتات الأتروبين (0.04 ملغم/كغ؛ انظر جدول المواد) عن طريق الحقن داخل الصفاق.
   2. تخدير الفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق لخليط من ميديتوميدين (0.3 مجم / كجم) ، ميدازولام (4.0 مجم / كجم) ، وبوتورفانول (5.0 مجم / كجم).
   3. تأكد من عمق المخدر بمستوى الاستجابة عن طريق الضغط على إصبع القدم.
      ملاحظة: سوف يزول التخدير بعد حوالي 40 دقيقة. إذا استجاب الفأر لقرصة إصبع القدم ، فقم بتطبيق نفس الجرعة من خليط التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق.
3. الاستعداد المسبق لجراحة زرع القطب الكهربائي.
   1. قطع شعيرات الماوس لمنع الإحساس باللمس.
   2. تليين كلتا العينين مع مرهم العيون لمنع الجفاف. أغلق الجفون لعرقلة حاسة البصر والحفاظ على الإغلاق عن طريق التصاق الجفون العلوية والسفلية بشريط إصلاح.
   3. حلق الشعر على رأس الماوس باستخدام كليبرز كهربائي. أدخل مقياس حرارة في المستقيم وحافظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية باستخدام وسادة التدفئة.
   4. تطبيق ليدوكائين هيدروكلوريد كمخدر موضعي موضعي لجزء فروة رأس الفأر الذي سيتم شقه.
   5. شق فروة رأس الفأر باستخدام مشرط أو مقص جراحي في اتجاه منشد إلى ذيلي (حجم المنطقة: 7 × 10 مم²).
   6. قرصة فروة الرأس بالقرب من الجزء المحفور مع ملاقط ورفع. قم بإزالة الغشاء المرئي على الجمجمة باستخدام مشرط أو مقص جراحي. لا تكسر الأوعية الدموية حول العينين أثناء العملية.
   7. أمسك الجلد بالقرب من مركزي خط شق فروة الرأس بالملقط وقم بتوسيع الجزء المقطوع لكشف الجزء العلوي من الجمجمة على نطاق واسع.
   8. تأكد من الإزالة الكاملة لجميع الأغشية الموجودة على سطح الجمجمة والأنسجة المحيطة بلامدا باستخدام مقص جراحي.
   9. بلل سطح الجمجمة بمحلول ملحي فسيولوجي لتعزيز رؤية سطح الدماغ تحت الجمجمة وتحديد موقع الجيب المستعرض.
      ملاحظة: عند زرع أقطاب كهربائية لولبية في الجمجمة ، تذكر عدم تضمينها فوق الجيب المستعرض وفي الجيب المستعرض.

4. زرع القطب

1. قم بتوصيل قضيب الفولاذ المقاوم للصدأ المثبت على صفيف القطب 2D على الجانب الخلفي من الركيزة المرنة بمعالج دقيق. ضع الركيزة المرنة على الجمجمة.
2. اضبط موقع القنوات (Chs) 3 و 14 (الشكل 2D) على المصفوفة لتلائم القولون السفلي.
   ملاحظة: يقع القولون السفلي على طول الجيب المستعرض. نوصي بتأكيد موقع القولون السفلي باستخدام أطلس دماغ الماوس مقدما.
3. ارسم دوائر صغيرة في مواقع Chs 3 و 8 و 9 و 14 (الشكل 2 د) على الجمجمة بعلامة دائمة لاستخدامها كمعالم مستهدفة.
4. تجفيف سطح الجمجمة لتعزيز الالتصاق بالأسمنت السني وعزل مجموعة القطب الكهربائي 2D كهربائيا على الركيزة المرنة من جمجمة الفأر.
5. ضع أسمنت الأسنان (سمك 1 مم تقريبا ؛ انظر جدول المواد) على سطح الجمجمة. بعد وضع الأسمنت السني ، انتظر حوالي 30 دقيقة حتى يتم علاجه.
6. قم بمحاذاة الركيزة المرنة وفقا للعلامات الدائرية الصغيرة على سطح الجمجمة.
7. قم بمحاذاة طرف مثقاب الأسنان مع كل فتحة وسادة قطب كهربائي على الركيزة المرنة. حفر بعناية في الجمجمة من خلال كل من ثقوب وسادة القطب.
8. قم بربط كل من الأقطاب اللولبية المصغرة من خلال الثقوب المحفورة في الجمجمة باستخدام مفك براغي مخصص للبراغي المصغرة.
9. تجعيد رأس القطب اللولبي ووسادة القطب بإحكام. أخيرا ، قم بقياس الموصلية بين كل قطب كهربائي لولبي والموصل باستخدام معدات الاختبار (على سبيل المثال ، مقياس LCR) لتأكيد التوصيل الكهربائي.

5. تصميم وبناء لفائف صغيرة

1. صمم قرصا على شكل دونات (انظر ملف الترميز التكميلي 1) به فتحة في الوسط (القطر الداخلي: 2 مم ؛ القطر الخارجي: 7 مم ؛ السماكة: 1 مم) باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) (انظر جدول المواد).
2. باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد ، اطبع قرصين (الشكل 3A ، يسار) مصنوعين من مادة غير مقاومة للحرارة (على سبيل المثال ، خيوط حمض اللبنيك المتعدد) ؛ المواد غير المقاومة للحرارة ليست ضرورية دائما (انظر أدناه).
3. قم بقص قضيب permalloy-45 (القطر: 2 مم ؛ انظر جدول المواد) لتشكيل عمود قصير (الطول: 60 مم).
4. أدخل العمود في كل فتحة من القرصين المطبوعين ثلاثي الأبعاد (الشكل 3 أ ، يمين). ضع قرصا واحدا في نهاية العمود والآخر 11 مم من النهاية ، مما ينتج عنه مسافة 10 مم بين القرصين. التمسك الأقراص مع الغراء الفوري ( انظر جدول المواد).
5. قم بتوصيل نهاية العمود بدون قرص بسائق تصادم (الشكل 3 ب). نعلق مغناطيس صغير إلى رمح permalloy-45. ضع مستشعر تأثير القاعة بالقرب من المغناطيس على بعد 5 مم من العمود. قم بتوصيل مستشعر تأثير القاعة بنظام الحصول على البيانات (DAQ ؛ انظر جدول المواد).
6. لحساب عدد الدورات ، قم بإعداد برنامج كمبيوتر (انظر جدول المواد) يحلل إشارات الخرج من مستشعر تأثير القاعة من خلال نظام DAQ.
7. قم بتوصيل سلك نحاسي رفيع (قطر: 0.16 مم) بالعمود والتزم بالطرف العلوي من السلك بالغراء الفوري.
8. باستخدام سائق التصادم ، قم بلف السلك النحاسي لمدة 1000 دورة بين القرصين. على الرغم من أن سرعة الدوران تعسفية ، إلا أنه يتم استخدام ما يقرب من 5 دورات في الثانية. ثم ، التمسك سلك الجرح مع الغراء الفوري.
9. افصل القرصين عن العمود. إذا كانت الأقراص ملتصقة بقوة بالعمود ، فقم بإذابة الأقراص باستخدام مسدس حراري.
10. قم بتغطية الملف براتنجات الايبوكسي لعزل السطح وتأمينه. ثم ، قم بقطع جزء العمود غير المقطوع كفائض.
11. تأكد من أن الملف الذي تم الحصول عليه يبلغ ارتفاعه 10 مم وقطره 6 مم (الشكل 3 ب ، يسار). لمعالجة الملف ، إما أن تقوم ببناء حامل ملف (الشكل 3C ، يمين) أو لصق قضيب من الفولاذ المقاوم للصدأ بالملف (غير موضح هنا).
12. قم بقياس مقاومة ومحاثة الملف باستخدام مقياس LCR (انظر جدول المواد). على سبيل المثال ، كان للملف المستخدم هنا مقاومة تيار مستمر (DC) تبلغ 18.3 Ω ومحاثة تبلغ 7.9 mH عند إدخال تيار متردد (AC) 1 كيلو هرتز. يتم عرض خصائص AC (المقاومة والحث) في الشكل 3D.
13. استخدم مولد دالة لتطبيق موجة مربعة ثنائية القطب على الملف. السعة النموذجية لجهد الدخل هي 20 فولت من خلال مصدر طاقة ثنائي القطب مع كسب 10x ، بعد خرج مولد 2 فولت. شكل الموجة الناتج هو موجة مربعة ثنائية القطب بسعة تقريبية تبلغ 20 فولت (أي جهد من الذروة إلى الذروة يبلغ 40 فولت) (الشكل 3E).
14. قم بقياس كثافة التدفق المغناطيسي باستخدام مستشعر تأثير القاعة ونظام DAQ. في هذه الحالة ، على سبيل المثال ، كانت كثافة التدفق المغناطيسي (B) للملف 113.6 ±2.5 mT (متوسط ± SEM) عندما كان قاع الملف ملامسا لمستشعر تأثير القاعة (الشكل 3F).

الشكل 3: ملف صغير للتحفيز المغناطيسي. (أ) قرص مطبوع ثلاثي الأبعاد (3D) (يسار). يتم الالتزام بقرصين متطابقين بعمود permalloy-45 ؛ أحدهما في نهاية العمود ، والآخر على بعد 10 مم (يمين). (ب) الإعداد للف الملف. يتم توصيل عمود 60 مم مع القرصين بسائق صدمة. يتم وضع مستشعر تأثير القاعة بالقرب من المغناطيس الصغير المتصل بالعمود. يتم لف السلك النحاسي بين القرصين. (ج) الملف المبني. يبلغ ارتفاع الملف 10 مم وقطره 6 مم وله 1000 لفة من الأسلاك النحاسية. يظهر الجانب الأيمن من الشكل الملف الذي تم التلاعب به بواسطة حامل ملف مطبوع 3D. (د) خصائص التيار المتردد للملف المسجل بواسطة مقياس LCR: المقاومة (العليا) مقابل تردد المدخلات الجيبية ؛ (أسفل) الحث مقابل تردد الإدخال. الملف النموذجي له مقاومة ومحاثة 21.6 و 7.9 mH ، على التوالي ، عند 1 كيلو هرتز من مدخلات التيار المتردد. (ه) شكل موجي مستطيل ثنائي الطور يستخدم كمدخل ملف مسجل بواسطة راسم الذبذبات. (F) العلاقة بين كثافة التدفق المغناطيسي والمسافة بين الملف المبني ومستشعر تأثير القاعة. تم تسجيل كثافة التدفق المغناطيسي بواسطة خمسة مستشعرات مختلفة لتأثير القاعة ، مرة واحدة لكل مستشعر. يتم رسم متوسط خمسة قياسات ، وتمثل أشرطة الخطأ الأخطاء القياسية للمتوسط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. نظام وإجراءات تسجيل الإشارة

1. قم بتوصيل صفيف 2D المرن بنظام التسجيل (انظر جدول المواد) باستخدام كابل الشريط المسطح.
2. قم بتوصيل قضيب الفولاذ المقاوم للصدأ المثبت على الملف بجهاز معالجة دقيق (انظر جدول المواد).
3. ضع الملف فوق bregma واضبط الموضع في الاتجاه الذيلي لتحديد النقطة البؤرية فوق القولون السفلي. النقطة المحورية للمجال الكهربائي المنبعث هي خط الوسط لمنطقة الجرح على السطح السفلي للملف (أي 1 مم من الحافة إلى المركز).
4. قم بإعداد نظام تحفيز يتكون من مصدر طاقة ثنائي القطب ومولد وظيفي (انظر جدول المواد) وقم بتوصيل الملف بالنظام.
5. قم بتوصيل كبل بين طرف الإدخال الخاص بمولد الوظائف وطرف الإخراج لنظام DAQ لتطبيق إشارات الزناد على مولد الوظائف من نظام DAQ. قم بإعداد برنامج كمبيوتر مناسب لإشارات الزناد لبدء المحفزات. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتوصيل نظام DAQ بنظام التسجيل لتوفير أوقات التحفيز كطوابع زمنية.
6. ابدأ عملية الاستحواذ لنظام التسجيل.
   ملاحظة: إذا كان نظام التسجيل يلتقط ضوضاء، فابحث عن مصدر الضوضاء وقللها.
7. اختبر التحفيز المغناطيسي عن طريق تشغيل نظام التحفيز.
   ملاحظة: إذا كانت الضوضاء الناتجة عن التحفيز المغناطيسي تشبع نطاق القياس ، فاضبط النطاق بشكل صحيح. بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من أن نظام التسجيل يحفظ الطوابع الزمنية للتحفيز بشكل صحيح.
8. ابدأ في تسجيل بيانات الاستجابة وابدأ جلسات التحفيز. أوقف التسجيل عند اكتمال كل جلسة تحفيز. حفظ جميع البيانات المسجلة للتحليل اللاحق.
   ملاحظة: لأداء جميع الظروف التجريبية بخمس شدة مغناطيسية مختلفة ، على سبيل المثال ، كان إجمالي الوقت المطلوب لجميع الجلسات حوالي 75 دقيقة. عادة ما يتم تحديد نقطة النهاية بعد انتهاء جميع جلسات التسجيل. ومع ذلك ، عندما أظهرت الحيوانات علامات سريرية بما في ذلك السعال وصعوبة التنفس واللهاث ، تم إنهاء الجلسة التجريبية على الفور. بالنسبة للقتل الرحيم ، تم إجراء قطع الرأس باستخدام مقص حاد ونظيف بينما كانت الحيوانات تحت التخدير.

7. تحليل البيانات

1. قم بتصفية إشارة النطاق العريض (الخام) باستخدام مرشح ترددات منخفضة بتردد انقطاع يبلغ 200 هرتز.
2. اجمع الأشكال الموجية التي تمت تصفيتها خلال نافذة زمنية حول كل طابع زمني للتحفيز. متوسط الأشكال الموجية للحصول على الأشكال الموجية المحتملة المرتبطة بالحدث (ERP) (الشكل 4 والشكل 5).

النتائج

يتم عرض عينة بيانات EEG المسجلة في الفئران C57BL / 6J المخدرة مع الركيزة المرنة جنبا إلى جنب مع الأقطاب اللولبية أدناه.

وكمثال نموذجي، يظهر متوسط أشكال موجات EEG المتولدة استجابة لتحفيز الصوت (انفجار نغمة 8 كيلو هرتز، ومستوى ضغط صوت 80 ديسيبل [SPL]) ل 60 تجربة مع محفزات متطابقة (

Discussion

تتناول هذه الدراسة نظام تسجيل EEG متعدد المواقع جنبا إلى جنب مع نظام تحفيز مغناطيسي مصمم للحيوانات الصغيرة ، بما في ذلك الفئران. النظام الذي تم إنشاؤه منخفض التكلفة ويمكن بناؤه بسهولة في المختبرات الفسيولوجية ، ويمكنه توسيع إعدادات القياس الحالية. الإجراء الجراحي اللازم للحصول على البيان?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	Zhejiang Flashforge 3D Technology Co., Ltd	FFD-101	The printer used for 3D-printing the donut-shaped disks
ATROPINE SULFATE  0.5 mg	NIPRO ES PHARMA CO., LTD.	-	Atropine sulfate
Bipolar amplifier	NF Corp.	KIT61380	For amplifying waveforms for coil input
Butorphanol	Meiji Seika Pharma Co., Ltd., Tokyo, Japan	-	For anathesis of animals
Commercial manufacturer of flexible 2D array	p-ban.com Corp.	-	URL: https://www.p-ban.com/
Computer prograom to analyze output signals	Natinal Instruments	NI-DAQ and  NI-DAQmx Python	To analyze output signals from the hall-effect sensor
Connector	Harwin Inc.	G125-FV12005L0P	For connector to conect to the measuring system
Copper pad	p-ban.com Corp.	copper	Copper pad on each substrate
Copper wire	Kyowa Harmonet Ltd.	P644432	The windings of the coil
DAQ board	National Instruments Corp.	USB-6343	For measuring the magnitic flux density of the coil
Dental cement	SHOFU INC.	Quick Resin	Self-Curing Orthodontic Resin
ECoG electrode	NeuroNexus Inc.	HC32	For reference to design of the flexible 2D array
Epoxy resin	Konishi Co. Ltd.	#16123	For coil construction
Ethyl Carbamate	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.	050-05821	For urethan anesthesia
Flat ribbon cable	Oki Electric Cable Co., Ltd.	FLEX-B2(20)-7/0.1 20028 5m	For cable to connect between surface-mount connector and measuring sysytem
flexible substrate	p-ban.com Corp.	polyimide	Baseplate of flexible substrate
Function generator	NF Corp.	WF1947	For generating waveforms for coil input
Hall-effect sensor	Honeywell International Inc.	SS94A2D	For measuring the magnitic flux density of the coil
IDC crimping tool	Pro'sKit Industries Co.	6PK-214	To crimp the IDC and one end of the flat ribbon cable; Flat cable connector crimping tool
Instant glue	Konishi Co. Ltd.	#04612	For coil construction
Insulation-displacement connector (IDC )	Uxcell Japan	B07GDDG3XG	2 × 10 pins and a 1.27 mm pitch
LCR meter	NF Corp.	ZM2376	For measuring the AC properties of the coil
Manipulator	NARISHIGE Group.	SM-15L	For manipulating the coil
Medetomidine	Kobayashi Kako, Fukui, Japan	-	For anathesis of animals
Midazolam	Astellas Pharma, Tokyo, Japan	-	For anathesis of animals
Miniature screw	KOFUSEIBYO Co., Ltd.	S0.6*1.5	For EEG-senseing and reference electrode
Mouse	Japan SLC, Inc.	C57BL/6J (C57BL/6JJmsSlc)	Experimental animal
Permalloy-45 rod	The Nilaco Corp.	780544	The core of the coil
Recording system	Plexon Inc.	OmniPlex	For EEG data acquisition
Stainless wire	Wakisangyo Co., Ltd.	HW-136	For grasp by manipulator
Stereotaxic apparatus	NARISHIGE Group.	SR-5M-HT	To fix a mouse head
Surface-mount connector	Useconn Electronics Ltd.	PH127-2x10MG	For connector to mount on the flexible 2D array
Testing equipment (LCR meter)	NF Corp.	ZM2372	Contact check and impedance measurements
White PLA filament	Zhejiang Flashforge 3D Technology Co., Ltd	PLA-F13	The material used for 3D-printing the donut-shaped disks
Xylocaine Jelly 2%	Sandoz Pharma Co., Ltd.	-	lidocaine hydrochloride