Sistema de registro electroencefalográfico de bajo costo combinado con una bobina de tamaño milimétrico para estimular transcranealmente el cerebro del ratón in vivo

Resumen

Se propone un sistema de registro electroencefalográfico de bajo costo combinado con una bobina de tamaño milimétrico para impulsar la estimulación magnética transcraneal del cerebro del ratón in vivo. Utilizando electrodos de tornillo convencionales con un sustrato de matriz de múltiples electrodos flexible hecho a medida, se puede llevar a cabo la grabación multisitio desde el cerebro del ratón en respuesta a la estimulación magnética transcraneal.

Resumen

Aquí se propone un sistema de registro electroencefalográfico (EEG) de bajo costo para impulsar la estimulación magnética transcraneal (TMS) del cerebro del ratón in vivo, utilizando una bobina de tamaño milimétrico. Utilizando electrodos de tornillo convencionales combinados con un sustrato de matriz de múltiples electrodos flexible hecho a medida, se puede llevar a cabo la grabación de múltiples sitios desde el cerebro del ratón. Además, explicamos cómo se produce una bobina de tamaño milimétrico utilizando equipos de bajo costo que generalmente se encuentran en los laboratorios. También se presentan procedimientos prácticos para fabricar el sustrato flexible de matriz multielectrodo y la técnica de implantación quirúrgica para electrodos de tornillo, que son necesarios para producir señales de EEG de bajo ruido. Aunque la metodología es útil para registrar desde el cerebro de cualquier animal pequeño, el presente informe se centra en la aplicación de electrodos en un cráneo de ratón anestesiado. Además, este método se puede extender fácilmente a un animal pequeño despierto que está conectado con cables atados a través de un adaptador común y fijado con un dispositivo TMS a la cabeza durante la grabación. Se describe la versión actual del sistema EEG-TMS, que puede incluir un máximo de 32 canales EEG (un dispositivo con 16 canales se presenta como un ejemplo con menos canales) y un dispositivo de canal TMS. Además, se informan brevemente los resultados típicos obtenidos por la aplicación del sistema EEG-TMS a ratones anestesiados.

Introducción

La estimulación magnética transcraneal (EMT) es una herramienta prometedora para la ciencia del cerebro humano, la aplicación clínica y la investigación de modelos animales debido a su no / baja invasividad. Durante la etapa temprana de las aplicaciones de TMS, la medición del efecto cortical en respuesta a TMS de pulso simple y pareado en humanos y animales se restringió a la corteza motora; La salida fácilmente medible se limitó a potenciales evocados motores y potenciales mioeléctricos inducidos que involucran la corteza motora ^1,2. Para expandir las regiones cerebrales que pueden ser medidas por modulación TMS, el registro electroencefalográfico (EEG) se integró con TMS de pulso simple y pareado como un método útil para examinar directamente la excitabilidad, conectividad y dinámica espaciotemporal de áreas en todo el cerebro ^3,4,5. Por lo tanto, la aplicación simultánea de TMS y registro de EEG (TMS-EEG) al cerebro se ha utilizado para sondear varias áreas superficiales del cerebro cortical de humanos y animales para investigar los circuitos neuronales intracorticales (ver Tremblay et ^al.6). Además, los sistemas TMS-EEG pueden ser utilizados para examinar características espaciotemporales corticales adicionales, incluyendo la propagación de señales a otras áreas corticales y la generación de actividad oscilatoria ^7,8.

Sin embargo, el mecanismo de acción de TMS en el cerebro sigue siendo especulativo debido a la no invasividad de TMS, lo que limita nuestro conocimiento de cómo funciona el cerebro durante las aplicaciones de TMS. Por lo tanto, los estudios traslacionales invasivos en animales que van desde roedores hasta humanos son de crucial importancia para comprender el mecanismo de los efectos de TMS en los circuitos neuronales y su actividad. En particular, para experimentos combinados TMS-EEG en animales, no se ha desarrollado intensivamente un sistema simultáneo de estimulación y medición para animales pequeños. Por lo tanto, se requiere que los experimentalistas construyan dicho sistema por ensayo y error de acuerdo con sus requisitos experimentales específicos. Además, los modelos de ratón son útiles entre otros modelos de especies animales in vivo porque muchas cepas de ratones transgénicos y aislados están disponibles como recursos biológicos. Por lo tanto, un método conveniente para construir un sistema de medición combinado TMS-EEG para ratones sería deseable para muchos investigadores de neurociencia.

Este estudio propone un método combinado TMS-EEG que se puede aplicar para la estimulación y el registro simultáneos del cerebro del ratón, que es el principal tipo de animal transgénico utilizado en la investigación, y que se puede construir fácilmente en laboratorios típicos de neurociencia. Primero, se describe un sistema de registro de EEG de bajo costo utilizando electrodos de tornillo convencionales y un sustrato flexible para asignar de manera reproducible una posición de matriz de electrodos en cada experimento. En segundo lugar, un sistema de estimulación magnética se construye utilizando una bobina de tamaño milimétrico, que se puede hacer fácilmente a medida en laboratorios típicos. En tercer lugar, el sistema combinado TMS-EEG registra la actividad neuronal en respuesta al sonido y la estimulación magnética. El método presentado en este estudio puede revelar los mecanismos que generan trastornos específicos en animales pequeños, y los resultados obtenidos en los modelos animales se pueden traducir para comprender los trastornos humanos correspondientes.

Protocolo

En el presente estudio, todos los experimentos con animales se realizaron siguiendo la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Hokkaido. Para el presente estudio se utilizaron ratones C57BL/6J, dos machos y tres hembras, de 8 a 10 semanas de edad. Este es un procedimiento terminal. Los animales fueron obtenidos de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Diseño y construcción de matrices bidimensionales flexibles

1. Prepare el número requerido de electrodos de tornillo en miniatura (inoxidables, SUS XM7; consulte la Tabla de materiales) con las siguientes propiedades estructurales para su uso como electrodos de referencia y registro de EEG: diámetro nominal, longitud del cuello y diámetro de la cabeza de 0,6 mm, 1,5 mm y 1,1 mm, respectivamente (Figura 1A).
   NOTA: En el presente estudio, se utilizaron 16 electrodos de tornillo en miniatura.
2. Prepare un plano de un diagrama de circuito impreso en un sustrato flexible siguiendo los pasos a continuación.
   1. Cree un patrón de almohadilla de electrodo bidimensional (2D) en un sustrato flexible (tamaño entero, 41,2 mm × 19,9 mm; consulte la Tabla de materiales) para que se lean los electrodos de tornillo. Diseñe la disposición de electrodos 2D. La Figura 1B muestra las disposiciones específicas utilizadas en este estudio y las coordenadas relativas desde un punto de referencia (marcado en cruz en el origen [0, 0]).
      NOTA: En el presente estudio, para registrar la actividad neuronal en la corteza auditiva dentro de los lóbulos temporales, la colocación de electrodos en la dirección lateral a medial (horizontal) fue más larga que en la dirección rostral-caudal (vertical) (Figura 1B).
   2. Asegúrese de que para los electrodos de registro de EEG, cada almohadilla de cobre (consulte la Tabla de materiales) en el sustrato flexible tenga una forma de anillo con un diámetro exterior de 1,3 mm y un diámetro interior de 0,8 mm (Figura 1C, izquierda). Haga un pequeño orificio (0,8 mm de diámetro) en el centro para que cada electrodo de tornillo pase a través del sustrato. Para los electrodos de referencia, cada almohadilla de cobre debe tener una forma cuadrada con una longitud lateral de 1,4 mm; de manera similar, haga un pequeño orificio (0,8 mm de diámetro) en el centro para que cada tornillo pase a través de la almohadilla cuadrada en el sustrato (Figura 1C, derecha).
   3. A continuación, para soldar un conector de montaje en superficie (Figura 1D, izquierda), almohadillas de lectura de diseño (matriz 2D) que conducen al conector (Figura 1D, derecha). Por ejemplo, utilice un conector con 2 × 10 pines y un paso de 1,27 mm entre pines adyacentes (Figura 1D, derecha).
   4. Cablee las almohadillas de electrodos de tornillo y las almohadillas de conexión utilizando tanto la capa superficial como la posterior con un ancho de línea de 0,03 mm y un intervalo de línea de 0,03 mm (líneas finas en la Figura 1E).
   5. Además, para conectar los canales de referencia y de tierra al amplificador, conecte las almohadillas de electrodos para los electrodos de referencia y tierra a la parte aislada en el exterior de la matriz 2D flexible (dos rectángulos verticales indicados por "G" y "HR" en la parte inferior de la Figura 1E). Después de determinar los canales de referencia y tierra, recuerde soldar las almohadillas de los electrodos a los conectores correspondientes (consulte el paso 2.1).
   6. Diseñe adecuadamente un área expuesta que no esté cubierta con una capa de protección (capa de poliimida). Exponga las almohadillas de conexión en la capa superficial mientras expone las almohadillas de electrodos de tornillo en las capas superficial y posterior. Todo el diseño del electrodo, los tamaños y la matriz 2D flexible fabricada se ilustran en la Figura 1E, y la imagen de un sustrato fabricado se muestra en la Figura 1F.
   7. En la parte superior del electrodo (parte de la cabeza) de la matriz 2D flexible, asegúrese de que la estructura de tres capas de arriba a abajo esté compuesta por lo siguiente (espesor total de 49,0 μm): una capa superior de cobre (12,0 μm de espesor), una capa intermedia de poliimida del núcleo (25,0 μm) y una capa inferior de cobre (12,0 μm) (Figura 1G, arriba).
   8. Grabar las capas de cobre en la superficie superior e inferior del sustrato, por ejemplo, utilizando grabado húmedo y la técnica de fabricación estándar⁹.
   9. En la parte inferior de la almohadilla cuadrada (parte del conector) de la matriz 2D flexible, asegúrese de que la estructura de seis capas esté compuesta por tres capas, incluida una capa superior de cobre (12,0 μm de espesor), una capa de poliimida de núcleo medio (25,0 μm) y una capa inferior de cobre (12,0 μm), que están intercaladas por capas protectoras de poliimida, incluidas las capas superior e inferior (ambas de 12,5 μm). Coloque una placa de poliimida de 2 mm desde la parte inferior como material de refuerzo (Figura 1G, abajo).
      NOTA: Para mantener la flexibilidad, la placa de poliimida de refuerzo no está montada en la parte del cuello de la matriz 2D flexible entre la cabeza y la parte del conector.
   10. Del mismo modo, en la parte del conector, grabe las capas de cobre y poliimida protectora en la parte superior utilizando grabado húmedo y la técnica de fabricación estándar.
       NOTA: El peso total del dispositivo de matriz 2D flexible fabricado, incluido el conector, es de 0,84 g. Después de diseñar un diseño para una matriz 2D flexible, los sustratos de un fabricante comercial (consulte la Tabla de materiales) a veces se recomiendan para mayor comodidad.

Figura 1: Partes componentes de la matriz bidimensional flexible (2D) para el registro electroencefalográfico (EEG) y el dispositivo fabricado, incluida la matriz. (A) El electrodo de tornillo en miniatura que está incrustado en el cráneo del ratón. (B) Las almohadillas de electrodos diseñadas para medir la actividad cerebral (círculos verdes) y el canal de referencia (cuadrado en la parte inferior derecha). Se muestran las coordenadas relativas de las almohadillas de los electrodos desde un punto de referencia (marca de cruz) en el origen (0, 0); El tamaño en milímetros se ilustra entre paréntesis. Las coordenadas centrales de las almohadillas de los electrodos son simétricas con respecto al eje vertical que pasa a través de la marca de cruz. (C) Se ilustran las almohadillas de electrodos y los orificios de perforación para un electrodo de registro (izquierda) y un electrodo de referencia (derecha). (D) Un conector de montaje en superficie (2 × 10 pines) utilizado para la matriz 2D flexible (izquierda) y el patrón y tamaño de las almohadillas diseñadas en el sustrato (derecha). (E) Plano diseñado con el tamaño de cada parte en milímetros. (F) Imagen de un sustrato fabricado indicado por el plano en E. (G) La estructura de capas de la matriz 2D flexible (partes del cabezal y del conector). Se ilustran las vistas superior y lateral de las almohadillas de electrodos de tornillo (arriba) y las almohadillas de lectura (abajo). El cabezal y las partes del conector están compuestas por una estructura de tres capas (arriba) y una estructura de seis capas (abajo), respectivamente. Además, la parte del cuello se compone de una estructura de cinco capas; Una capa protectora de poliimida está montada en la superficie superior y posterior, y la placa de poliimida de refuerzo no está montada en la parte del cuello. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Construcción del adaptador y mapeo de canales

1. Realice la construcción del adaptador siguiendo los pasos a continuación.
   1. Distribuya el flujo de soldadura en el conector de montaje en superficie de 2 × 10 pines (Figura 1D, izquierda) y las almohadillas de conexión de la matriz 2D (Figura 1D, derecha) (consulte Tabla de materiales) en el sustrato flexible.
   2. Suelde el conector de montaje en superficie de 2 × 10 pines a las almohadillas del conector. En particular, confirme la conexión entre las dos almohadillas en la parte inferior de la matriz 2D y los dos pines de conector utilizados como canales de referencia y tierra (Figura 2A).
   3. Conecte cada una de las dos almohadillas a cables conductores individuales para alimentar señales de referencia a un punto externo (por ejemplo, un punto de tierra conectado al canal de tierra del sistema de medición; Figura 2A).
      NOTA: En este estudio, sin embargo, una de las almohadillas circulares de electrodos con electrodos de tornillo se utilizó como electrodo de referencia en lugar de un electrodo cuadrado en la parte del conector.
   4. Después de soldar, cubra los puntos de soldadura con resina epoxi (consulte la Tabla de materiales) para proteger los puntos expuestos y evitar cortocircuitos.
2. Fije el cable conector y el amplificador del cabezal siguiendo los pasos que se indican a continuación.
   1. Prepare un conector de desplazamiento de aislamiento (IDC) con 2 × 10 pines y un paso de 1,27 mm (Figura 2B, arriba a la izquierda) y un cable plano de cinta de 20 pines (consulte la Tabla de materiales) con un paso de 0,635 mm (Figura 2B, abajo a la izquierda). Corte el cable de cinta plana a la longitud requerida (por ejemplo, 40 cm).
   2. Engarce el IDC y un extremo del cable de cinta plana con una herramienta de engarzado IDC (Figura 2B, arriba a la derecha) (consulte Tabla de materiales).
   3. Separe cada línea del otro extremo del cable hasta aproximadamente 15 mm del extremo de la punta con un cortador. Retire el aislamiento 3 mm del extremo de la punta.
   4. Conecte el IDC engarzado al cable de cinta plana y el conector de 2 × 10 pines soldado al sustrato flexible (Figura 2C).
   5. Confirme la correspondencia entre el electrodo de grabación y la línea separada del cable. Asegúrese de que cada línea utilizada no produzca un error de conexión incorrecto.
   6. Suelde los cables de cobre expuestos de las líneas individuales correspondientes a la salida de cada electrodo al conector de 20 pines (paso de 1,25 mm) del sistema de medición, incluido el amplificador principal (Figura 2B, abajo a la derecha).
   7. Después de soldar, confirme la conducción entre las almohadillas de los electrodos de tornillo y los pines del conector utilizando un equipo de prueba (por ejemplo, un medidor LCR; consulte la Tabla de materiales).
   8. Cubra los puntos de soldadura con resina epoxi y cinta adhesiva protectora para protegerlos de daños y evitar el contacto con otras líneas de señal.
   9. Usando resina epoxi, adhiera una varilla delgada de acero inoxidable (diámetro: 1.1-1.2 mm; longitud: 100 mm) a la parte posterior de la parte del conector de la matriz 2D en el sustrato flexible.
      NOTA: Esta varilla de acero inoxidable puede ser agarrada por un soporte de micromanipulador durante los experimentos (Figura 2C).
   10. Finalmente, confirme el mapeo entre los electrodos de tornillo y los canales de salida de la señal (Figura 2D).

Figura 2: Construcción del adaptador para una matriz de electrodos bidimensionales (2D) en el sustrato flexible y mapeo del canal de grabación. (A) En la parte del conector, los canales de referencia y tierra están conectados a las almohadillas de electrodos inferiores con cables conductores. Si los canales de referencia y de tierra se determinan de antemano, los canales deben conectarse a las almohadillas de electrodos inferiores correspondientes durante la fase de diseño. En tales casos, no es necesario soldar cables conductores a los canales y almohadillas de electrodos. (B) Los conectores de desplazamiento de aislamiento (arriba a la izquierda) están engarzados a un extremo del cable plano (abajo a la izquierda) para vincular el conector del amplificador de medición (arriba a la derecha). Todas las líneas que corresponden a los canales a utilizar están soldadas a los conectores verdes (abajo a la derecha). En este caso, debido a que cada conector verde conectado al amplificador de cabeza se asigna para una medición de ocho canales, se necesitan al menos dos conectores para registrar las señales de actividad cerebral de 16 canales. Los puntos soldados están cubiertos con resina epoxi y cinta adhesiva protectora para evitar el contacto con otras líneas de señal. (C) El conector y el cable fabricado se colocan en la superficie del sustrato flexible de matriz 2D. La delgada varilla de acero inoxidable está unida a la parte posterior del sustrato flexible. (D) Se muestran las ubicaciones espaciales de los canales de grabación en la superficie cerebral del ratón y los mapas de canales para cada punto del sistema de medición. En este caso, hay 16 canales de grabación con electrodos de tornillo (círculos rojos), aunque el número total de sitios de grabación posibles es de 32. Los otros 16 canales que no son de grabación también se muestran como círculos verdes en la superficie del cerebro. En la gráfica de mapeo, "G" y "R" indican los canales diseñados para electrodos de tierra y de referencia, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Cirugía animal

1. Preparar el ambiente quirúrgico estéril.
   1. Use equipo de protección, como guantes de látex, durante todo el procedimiento experimental con animales.
   2. Esterilizar el aparato estereotáxico y los instrumentos quirúrgicos (ver Tabla de materiales).
   3. Después de esterilizar los instrumentos quirúrgicos, lávelos con solución salina estéril.
2. Anestesiar a los animales.
   1. Mida el peso del ratón antes de la cirugía. Administrar sulfato de atropina (0,04 mg/kg; ver Tabla de materiales) mediante inyección intraperitoneal.
   2. Anestesiar al ratón mediante una inyección intraperitoneal de una mezcla de medetomidina (0,3 mg/kg), midazolam (4,0 mg/kg) y butorfanol (5,0 mg/kg).
   3. Confirme la profundidad anestésica por el nivel de respuesta pellizcando el dedo del pie.
      NOTA: La anestesia desaparecerá después de aproximadamente 40 minutos. Si el ratón responde a un pellizco en el dedo del pie, administre la misma dosis de la mezcla anestésica a través de una inyección intraperitoneal.
3. Prepárese para la cirugía de implantación de electrodos.
   1. Corte los bigotes del ratón para evitar la sensación háptica.
   2. Lubrique ambos ojos con un ungüento oftálmico para evitar que se sequen. Cierre los párpados para obstruir el sentido de la vista y mantenga el cierre adhiriendo los párpados superiores e inferiores con cinta adhesiva.
   3. Afeite el pelo de la cabeza del ratón con cortapelos eléctricos. Inserte un termómetro en el recto y mantenga la temperatura corporal a 37 °C con una almohadilla térmica.
   4. Administrar clorhidrato de lidocaína como anestésico local tópico a la parte del cuero cabelludo del ratón que se va a incidir.
   5. Incise el cuero cabelludo del ratón con un bisturí o tijeras quirúrgicas en dirección rostral-caudal (tamaño del área: 7 × 10 mm²).
   6. Pellizque el cuero cabelludo cerca de la parte incisa con pinzas y levante. Retire la membrana visible en el cráneo con un bisturí o tijeras quirúrgicas. No rompa los vasos sanguíneos alrededor de los ojos durante la operación.
   7. Agarre la piel cerca de ambos centros de la línea de incisión del cuero cabelludo con fórceps y ensanche la parte incisa para exponer ampliamente la parte superior del cráneo.
   8. Confirme la eliminación completa de todas las membranas en la superficie del cráneo y el tejido alrededor de lambda con tijeras quirúrgicas.
   9. Moje la superficie del cráneo con solución salina fisiológica para mejorar la visibilidad de la superficie del cerebro debajo del cráneo y localizar el seno transverso.
      NOTA: Al implantar electrodos de tornillo en el cráneo, recuerde no incrustarlos por encima y en el seno transverso.

4. Implantación de electrodos

1. Fije la varilla de acero inoxidable montada en la matriz de electrodos 2D en la parte posterior del sustrato flexible a un micromanipulador. Coloque el sustrato flexible sobre el cráneo.
2. Ajuste la ubicación de los canales (Chs) 3 y 14 (Figura 2D) en la matriz para que quepan dentro del colículo inferior.
   NOTA: El colículo inferior se encuentra a lo largo del seno transverso. Recomendamos confirmar la ubicación del colículo inferior utilizando un atlas cerebral de ratón por adelantado.
3. Dibuje pequeños círculos en las ubicaciones de los capítulos 3, 8, 9 y 14 (Figura 2D) en el cráneo con un marcador permanente para usar como puntos de referencia de orientación.
4. Seque la superficie del cráneo para mejorar la adherencia al cemento dental y para aislar eléctricamente la matriz de electrodos 2D en el sustrato flexible del cráneo del ratón.
5. Aplique cemento dental (aproximadamente 1 mm de espesor; consulte la Tabla de materiales) a la superficie del cráneo. Después de aplicar el cemento dental, espere aproximadamente 30 minutos para que se cure.
6. Alinee el sustrato flexible de acuerdo con las pequeñas marcas circulares en la superficie del cráneo.
7. Alinee la punta de un taladro dental con cada orificio de almohadilla de electrodo en el sustrato flexible. Perfore cuidadosamente el cráneo a través de cada uno de los orificios de la almohadilla del electrodo.
8. Atornille cada uno de los electrodos de tornillo en miniatura a través de los orificios perforados en el cráneo con un destornillador dedicado para tornillos en miniatura.
9. Engarce firmemente la cabeza del electrodo de tornillo y la almohadilla del electrodo. Finalmente, mida la conductancia entre cada electrodo de tornillo y el conector con un equipo de prueba (por ejemplo, un medidor LCR) para confirmar la conductividad eléctrica.

5. Diseño y construcción de bobinas pequeñas

1. Diseñe un disco en forma de rosquilla (consulte el Archivo de codificación suplementario 1) con un orificio en el centro (diámetro interior: 2 mm; diámetro exterior: 7 mm; grosor: 1 mm) utilizando un software de diseño asistido por computadora (CAD) (consulte Tabla de materiales).
2. Usando una impresora 3D, imprima dos discos (Figura 3A, izquierda) hechos de material no resistente al calor (por ejemplo, filamento de ácido poliláctico); El material no resistente al calor no siempre es necesario (ver más abajo).
3. Recorte una varilla de permalloy-45 (diámetro: 2 mm; consulte la Tabla de materiales) para formar un eje corto (longitud: 60 mm).
4. Inserte el eje en cada orificio de los dos discos impresos en 3D (Figura 3A, derecha). Coloque un disco en el extremo del eje y el otro a 11 mm del extremo, lo que resulta en una distancia de 10 mm entre los dos discos. Adhiera los discos con pegamento instantáneo (consulte la Tabla de materiales).
5. Fije el extremo del eje sin disco a un atornillador de impacto (Figura 3B). Fije un pequeño imán al eje permalloy-45. Coloque un sensor de efecto Hall cerca del imán a 5 mm del eje. Conecte el sensor de efecto Hall a un sistema de adquisición de datos (DAQ; consulte Tabla de materiales).
6. Para contar el número de vueltas, prepare un programa informático (consulte la Tabla de materiales) que analice las señales de salida del sensor de efecto Hall a través del sistema DAQ.
7. Conecte un alambre de cobre delgado (diámetro: 0,16 mm) al eje y adhiérase al extremo superior del cable con pegamento instantáneo.
8. Usando el atornillador de impacto, enrolle el cable de cobre durante 1.000 vueltas entre los dos discos. Aunque la velocidad de rotación es arbitraria, normalmente se utilizan aproximadamente 5 rotaciones por segundo. Luego, adhiérase al alambre enrollado con pegamento instantáneo.
9. Suelte los dos discos del eje. Si los discos están fuertemente adheridos al eje, derrita los discos con una pistola de calor.
10. Cubra la bobina con resina epoxi para aislar y asegurar la superficie. Luego, corte la parte del eje desenrollada como exceso.
11. Asegúrese de que la bobina obtenida tenga una altura de 10 mm y un diámetro de 6 mm (Figura 3B, izquierda). Para la manipulación de la bobina, construya un soporte de bobina (Figura 3C, derecha) o adhiera una varilla de acero inoxidable a la bobina (no se muestra aquí).
12. Mida la resistencia y la inductancia de la bobina utilizando un medidor LCR (consulte la Tabla de materiales). Por ejemplo, la bobina utilizada aquí tenía una resistencia de corriente continua (CC) de 18,3 Ω y una inductancia de 7,9 mH a 1 kHz de entrada de corriente alterna (CA). Las propiedades de CA (resistencia e inductancia) se muestran en la Figura 3D.
13. Utilice un generador de funciones para aplicar una onda cuadrada bipolar a la bobina. La amplitud típica del voltaje de entrada es de 20 V a través de una fuente de alimentación bipolar con una ganancia de 10x, siguiendo una salida del generador de 2 V. La forma de onda resultante es una onda cuadrada bipolar con una amplitud aproximada de 20 V (es decir, un voltaje pico a pico de 40 V) (Figura 3E).
14. Mida la densidad de flujo magnético utilizando el sensor de efecto Hall y el sistema DAQ. En este caso, por ejemplo, la densidad de flujo magnético (B) de la bobina fue de 113,6 ±2,5 mT (media ± SEM) cuando el fondo de la bobina estaba en contacto con el sensor de efecto Hall (Figura 3F).

Figura 3: Bobina pequeña para estimulación magnética. (A) Disco impreso en tres dimensiones (3D) (izquierda). Dos discos idénticos están adheridos al eje permalloy-45; Uno está al final del eje y el otro está a 10 mm de distancia (derecha). (B) Configuración para enrollar la bobina. El eje de 60 mm con los dos discos está unido a un atornillador de impacto. Se coloca un sensor de efecto Hall cerca del pequeño imán conectado al eje. El alambre de cobre se enrolla entre los dos discos. (C) Bobina construida. La bobina tiene 10 mm de altura, 6 mm de diámetro y 1.000 vueltas de alambre de cobre. El lado derecho de la figura muestra la bobina manipulada por un soporte de bobina impreso en 3D. (D) Propiedades de CA de la bobina registradas por un medidor LCR: (superior) resistencia versus frecuencia de entrada sinusoidal; (abajo) inductancia versus frecuencia de entrada. Una bobina típica tiene una resistencia e inductancia de 21.6 y 7.9 mH, respectivamente, a 1 kHz de entrada de CA. (E) Forma de onda rectangular bifásica utilizada como entrada de bobina registrada por un osciloscopio. (F) Relación entre la densidad de flujo magnético y la distancia entre una bobina construida y el sensor de efecto Hall. La densidad de flujo magnético fue registrada por cinco sensores de efecto Hall diferentes, una vez para cada sensor. Se representa un promedio de cinco mediciones y las barras de error representan los errores estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Sistema y procedimiento de grabación de señales

1. Conecte la matriz 2D flexible al sistema de grabación (consulte Tabla de materiales) con el cable de cinta plana.
2. Fije la varilla de acero inoxidable montada en la bobina a un micromanipulador (consulte la Tabla de materiales).
3. Coloque la bobina por encima de bregma y ajuste la posición en la dirección caudal para ubicar el punto focal por encima del colículo inferior. El punto focal del campo eléctrico emisor es la línea media del área de la herida en la superficie inferior de la bobina (es decir, 1 mm desde el borde hasta el centro).
4. Prepare un sistema de estimulación que consista en una fuente de alimentación bipolar y un generador de funciones (consulte la Tabla de materiales) y conecte la bobina al sistema.
5. Conecte un cable entre el terminal de entrada del generador de funciones y el terminal de salida del sistema DAQ para aplicar señales de activación al generador de funciones desde el sistema DAQ. Prepare un programa informático apropiado para que las señales desencadenantes inicien estímulos. Además, conecte el sistema DAQ al sistema de grabación para guardar los tiempos de estimulación como marcas de tiempo.
6. Inicie el proceso de adquisición del sistema de grabación.
   NOTA: Si el sistema de grabación está captando ruido, busque la fuente del ruido y redúzcalo.
7. Pruebe la estimulación magnética activando el sistema de estimulación.
   NOTA: Si el ruido producido por la estimulación magnética satura el rango de medición, ajuste el rango correctamente. Además, confirme que el sistema de grabación guarda correctamente las marcas de tiempo de estimulación.
8. Comience a registrar los datos de respuesta y comience las sesiones de estimulación. Detenga la grabación cuando se complete cada sesión de estimulación. Guarde todos los datos registrados para su posterior análisis.
   NOTA: Para realizar todas las condiciones experimentales con cinco intensidades magnéticas diferentes, por ejemplo, el tiempo total requerido para todas las sesiones fue de aproximadamente 75 minutos. El punto final generalmente se determinaba después de que todas las sesiones de grabación habían terminado. Sin embargo, cuando los animales mostraron signos clínicos que incluían tos, dificultad para respirar y jadeo, la sesión experimental se terminó inmediatamente. Para la eutanasia, la decapitación se realizó con tijeras afiladas y limpias mientras los animales estaban bajo anestesia.

7. Análisis de datos

1. Filtre la señal de banda ancha (sin procesar) utilizando un filtro de paso bajo con una frecuencia de corte de 200 Hz.
2. Recopile formas de onda filtradas durante una ventana de tiempo alrededor de cada marca de tiempo de estimulación. Promedie las formas de onda para obtener las formas de onda del potencial relacionado con eventos (ERP) (Figura 4 y Figura 5).

Resultados

A continuación se presentan datos de EEG de muestra registrados en ratones C57BL / 6J anestesiados con el sustrato flexible combinado con los electrodos de tornillo.

Como ejemplo típico, las formas de onda de EEG promedio generadas en respuesta a la estimulación sonora (ráfaga de tono de 8 kHz, nivel de presión sonora [SPL] de 80 dB) se muestran en 60 ensayos con estímulos idénticos (Figura 4A). Un esquema de mapeo de canales de grabación también se prese...

Discusión

Este estudio aborda un sistema de registro de EEG multisitio combinado con un sistema de estimulación magnética diseñado para animales pequeños, incluidos ratones. El sistema construido es de bajo costo y fácil de construir en laboratorios fisiológicos, y puede ampliar sus configuraciones de medición existentes. El procedimiento quirúrgico necesario para obtener datos del sistema de registro del ratón es profundamente simple si dichos laboratorios tienen experiencia previa con experimentos electrofisiológicos e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	Zhejiang Flashforge 3D Technology Co., Ltd	FFD-101	The printer used for 3D-printing the donut-shaped disks
ATROPINE SULFATE  0.5 mg	NIPRO ES PHARMA CO., LTD.	-	Atropine sulfate
Bipolar amplifier	NF Corp.	KIT61380	For amplifying waveforms for coil input
Butorphanol	Meiji Seika Pharma Co., Ltd., Tokyo, Japan	-	For anathesis of animals
Commercial manufacturer of flexible 2D array	p-ban.com Corp.	-	URL: https://www.p-ban.com/
Computer prograom to analyze output signals	Natinal Instruments	NI-DAQ and  NI-DAQmx Python	To analyze output signals from the hall-effect sensor
Connector	Harwin Inc.	G125-FV12005L0P	For connector to conect to the measuring system
Copper pad	p-ban.com Corp.	copper	Copper pad on each substrate
Copper wire	Kyowa Harmonet Ltd.	P644432	The windings of the coil
DAQ board	National Instruments Corp.	USB-6343	For measuring the magnitic flux density of the coil
Dental cement	SHOFU INC.	Quick Resin	Self-Curing Orthodontic Resin
ECoG electrode	NeuroNexus Inc.	HC32	For reference to design of the flexible 2D array
Epoxy resin	Konishi Co. Ltd.	#16123	For coil construction
Ethyl Carbamate	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.	050-05821	For urethan anesthesia
Flat ribbon cable	Oki Electric Cable Co., Ltd.	FLEX-B2(20)-7/0.1 20028 5m	For cable to connect between surface-mount connector and measuring sysytem
flexible substrate	p-ban.com Corp.	polyimide	Baseplate of flexible substrate
Function generator	NF Corp.	WF1947	For generating waveforms for coil input
Hall-effect sensor	Honeywell International Inc.	SS94A2D	For measuring the magnitic flux density of the coil
IDC crimping tool	Pro'sKit Industries Co.	6PK-214	To crimp the IDC and one end of the flat ribbon cable; Flat cable connector crimping tool
Instant glue	Konishi Co. Ltd.	#04612	For coil construction
Insulation-displacement connector (IDC )	Uxcell Japan	B07GDDG3XG	2 × 10 pins and a 1.27 mm pitch
LCR meter	NF Corp.	ZM2376	For measuring the AC properties of the coil
Manipulator	NARISHIGE Group.	SM-15L	For manipulating the coil
Medetomidine	Kobayashi Kako, Fukui, Japan	-	For anathesis of animals
Midazolam	Astellas Pharma, Tokyo, Japan	-	For anathesis of animals
Miniature screw	KOFUSEIBYO Co., Ltd.	S0.6*1.5	For EEG-senseing and reference electrode
Mouse	Japan SLC, Inc.	C57BL/6J (C57BL/6JJmsSlc)	Experimental animal
Permalloy-45 rod	The Nilaco Corp.	780544	The core of the coil
Recording system	Plexon Inc.	OmniPlex	For EEG data acquisition
Stainless wire	Wakisangyo Co., Ltd.	HW-136	For grasp by manipulator
Stereotaxic apparatus	NARISHIGE Group.	SR-5M-HT	To fix a mouse head
Surface-mount connector	Useconn Electronics Ltd.	PH127-2x10MG	For connector to mount on the flexible 2D array
Testing equipment (LCR meter)	NF Corp.	ZM2372	Contact check and impedance measurements
White PLA filament	Zhejiang Flashforge 3D Technology Co., Ltd	PLA-F13	The material used for 3D-printing the donut-shaped disks
Xylocaine Jelly 2%	Sandoz Pharma Co., Ltd.	-	lidocaine hydrochloride