التنميط الجيني وفحص التسرب على نطاق الجينوم لتحديد الأهداف العلاجية في نماذج الفئران لورم غمد العصب المحيطي الخبيث

Summary

لقد طورنا نهجا مقارنا لعلم الأورام الجيني عبر الأنواع باستخدام التحليلات الجينومية والشاشات الجينومية الوظيفية لتحديد ومقارنة الأهداف العلاجية في الأورام الناشئة في نماذج الفئران المعدلة وراثيا ونوع الورم البشري المقابل.

Abstract

أورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة (MPNSTs) مشتقة من خلايا شوان أو سلائفها. في المرضى الذين يعانون من متلازمة حساسية الورم الورم العصبي الليفي من النوع 1 (NF1) ، تعد MPNSTs أكثر الأورام الخبيثة شيوعا والسبب الرئيسي للوفاة. توفر ساركوما الأنسجة الرخوة النادرة والعدوانية هذه مستقبلا صارخا ، مع معدلات بقاء خالية من الأمراض لمدة 5 سنوات تتراوح بين 34-60٪. خيارات العلاج للأفراد الذين يعانون من MPNSTs محدودة بشكل مخيب للآمال ، مع كون الجراحة المشوهة هي خيار العلاج الأول. العديد من العلاجات التي كانت واعدة في يوم من الأيام مثل tipifarnib ، وهو مثبط لإشارات Ras ، فشلت سريريا. وبالمثل ، فشلت التجارب السريرية للمرحلة الثانية مع erlotinib ، الذي يستهدف عامل نمو البشرة (EFGR) ، و sorafenib ، الذي يستهدف مستقبل عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) ، ومستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF) ، و Raf ، بالاشتراك مع العلاج الكيميائي القياسي ، في إنتاج استجابة في المرضى.

في السنوات الأخيرة ، أثبتت طرق الفحص الجينومي الوظيفي جنبا إلى جنب مع التنميط الجيني لخطوط الخلايا السرطانية أنها مفيدة لتحديد مسارات الإشارات السيتوبلازمية الأساسية وتطوير علاجات محددة الهدف. في حالة أنواع الأورام النادرة ، يتم استخدام شكل مختلف من هذا النهج المعروف باسم علم الأورام الجيني المقارن عبر الأنواع بشكل متزايد لتحديد أهداف علاجية جديدة. في علم الأورام الجيني المقارن عبر الأنواع ، يتم إجراء التنميط الجيني وعلم الجينوم الوظيفي في نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEM) ثم يتم التحقق من صحة النتائج في العينات البشرية النادرة وخطوط الخلايا المتاحة.

تصف هذه الورقة كيفية تحديد طفرات الجينات الدافعة المرشحة في خلايا MPNST البشرية والفأر باستخدام تسلسل الإكسوم الكامل (WES). ثم نصف كيفية إجراء شاشات shRNA على نطاق الجينوم لتحديد ومقارنة مسارات الإشارات الحرجة في خلايا MPNST للفأر والإنسان وتحديد الأهداف القابلة للدواء في هذه المسارات. توفر هذه المنهجيات نهجا فعالا لتحديد أهداف علاجية جديدة في مجموعة متنوعة من أنواع السرطان البشري.

Introduction

أورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة (MPNSTs) هي أورام خلايا المغزل شديدة العدوانية التي تنشأ بالاقتران مع متلازمة حساسية الورم العصبي الليفي من النوع 1 (NF1) ، بشكل متقطع في عموم السكان وفي مواقع العلاج الإشعاعي السابق¹،^2،3. يولد مرضى NF1 بنسخة من النوع البري من جين مثبط الورم NF1 وأليل NF1 ثان مع طفرة فقدان الوظيفة. هذه الحالة من عدم كفاية الفرداني تجعل مرضى NF1 عرضة لطفرة ثانية في فقدان الوظيفة في جين NF1 من النوع البري ، مما يؤدي إلى تكوين الأورام. عندما تحدث طفرة NF1 "الضربة الثانية" هذه في خلية في سلالة خلايا شوان ، يكون الورم الناتج إم....

Protocol

قبل الشروع في الدراسات ، تمت مراجعة الإجراءات والبروتوكولات الحيوانية للتعامل مع النواقل الفيروسية والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) واللجنة المؤسسية للسلامة الأحيائية (IBC). تمت الموافقة على الإجراءات الموضحة هنا من قبل مجالس IACUC و IBC بجامعة ساوث كارولينا الطبية وتم تنفيذها من قبل موظفين مدربين تدريبا مناسبا وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر وإرشادات رعاية المؤسسية الخاصة ب MUSC.

1. تحليلات WES-Seq وتحديد المتغيرات المسببة للأمراض

1. عزل الحمض النووي الجينومي من عينة الورم أو خلايا MPNST الفرعية (70٪) المزروعة على طبق 60 مم ، باستخدام الطرق القياسية القائمة على ....

النتائج

تعرض مخططات الشكل 5 درجات استنفاد الجينات الأساسية الأساسية (CEGs) المصنفة على أنها TRUE مقارنة بغير CEGs (المسمى FALSE) في كل خط خلية بشرية تم فحصه. تمثل النقاط log2 من درجات استنفاد الطيات للجينات الفردية ، والتي يتم رسمها على تمثيل boxplot لتوزيع النتيجة الإجمالي. تم استخدام اختبار t

Discussion

تم تطوير الطرق التفصيلية المعروضة هنا لدراسة أورام الجهاز العصبي المحيطي والتسبب في MPNST. على الرغم من أننا وجدنا أن هذه الطرق فعالة ، إلا أنه يجب الاعتراف بوجود بعض القيود المحتملة على الطرق التي نصفها هنا. أدناه ، نناقش بعض هذه القيود والاستراتيجيات المحتملة للتغلب عليها في أنظمة نموذجية.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioruptor Sonication System	Diagenode	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, San Diego, CA	N/A
Celigo Image Cytometer	Nexcelom	N/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve Hybrid	Decon Laboratories	5989-27-5
Corning 96-well Black Microplate	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes	Diagenode	C30010009
dNTP mix	Clontech	639210
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Elution buffer	Qiagen	19086
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Excel	Microsoft
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’			HPLC purified
GraphPad Prism	Dotmatics
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, San Diego, CA	N/A
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS Transfection Reagent	Thermo Scientific	11514015
Polybrene Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR1003G
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Qiagen Buffer P1	Qiagen	19051
Qiagen Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymerase	Clontech	639210
Trimmomatic software		www.usadellab.org