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요약

우리는 유전자 조작 마우스 모델에서 발생하는 종양과 해당 인간 종양 유형에서 발생하는 종양의 치료 표적을 식별하고 비교하기 위해 게놈 분석 및 기능적 게놈 스크리닝을 활용하는 종간 비교 종양유전체학 접근 방식을 개발했습니다.

초록

악성 말초 신경초 종양(MPNST)은 슈반(Schwann) 세포 또는 그 전구체에서 유래합니다. 종양 감수성 증후군 신경섬유종증 1형(NF1) 환자에서 MPNST는 가장 흔한 악성 종양이자 주요 사망 원인입니다. 이 희귀하고 공격적인 연조직 육종은 5년 무병 생존율이 34-60%에 달하는 암울한 미래를 제시합니다. MPNST 환자를 위한 치료 옵션은 실망스러울 정도로 제한적이며, 변형 수술이 가장 중요한 치료 옵션입니다. Ras 신호전달 억제제인 티피파르닙(tipifarnib)과 같이 한때 유망했던 많은 치료법이 임상적으로 실패했다. 마찬가지로, 표피 성장 인자(EFGR)를 표적으로 하는 엘로티닙과 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGF), 혈소판 유래 성장 인자 수용체(PDGF)를 표적으로 하는 소라페닙, 그리고 Raf를 표준 화학요법과 병용하는 임상 2상 시험에서도 환자에게 반응을 보이지 못했습니다.

최근 몇 년 동안 암 세포주의 유전자 프로파일링과 결합된 기능적 게놈 스크리닝 방법은 필수 세포질 신호 전달 경로를 식별하고 표적 특이적 치료법을 개발하는 데 유용한 것으로 입증되었습니다. 희귀 종양 유형의 경우, 종간 비교 종양유전체학(cross-species comparative oncogenomics)으로 알려진 이 접근법의 변형이 새로운 치료 표적을 식별하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 종간 비교 종양유전체학에서 유전자 프로파일링 및 기능적 유전체학은 유전자 조작 마우스(GEM) 모델에서 수행되며 결과는 사용 가능한 희귀 인간 표본 및 세포주에서 검증됩니다.

본 논문은 전체 엑솜 염기서열분석(whole exome sequencing, WES)을 이용하여 인간 및 마우스 MPNST 세포에서 후보 드라이버 유전자 돌연변이를 식별하는 방법을 설명합니다. 그런 다음 게놈 스케일 shRNA 스크리닝을 수행하여 마우스 및 인간 MPNST 세포에서 중요한 신호 전달 경로를 식별 및 비교하고 이러한 경로에서 약물 가능한 표적을 식별하는 방법을 설명합니다. 이러한 방법론은 다양한 인간 암 유형에서 새로운 치료 표적을 식별하는 효과적인 접근 방식을 제공합니다.

서문

악성 말초신경초종양(MPNST)은 종양감수성 증후군인 신경섬유종증 1형(NF1)과 관련하여 발생하는 매우 공격적인 방추세포 신생물로, 일반 인구 집단과 이전 방사선 치료 부위에서 산발적으로 발생합니다 1,2,3. NF1 환자는 NF1 종양 억제 유전자의 야생형 사본과 기능 상실 돌연변이가 있는 두 번째 NF1 대립유전자 를 가지고 태어납니다. 이러한 하플로인기능부전(haploinsufficiency) 상태는 NF1 환자를 야생형 NF1 유전자의 두 번째 기능 상실 돌연변이에 취약하게 만들어 종양형성을 유발합니다. 이 "두 번째 히트" NF1 돌연변이가 슈반(Schwann) 세포 계통의 세포에서 발생하면, 그 결과로 생기는 종양은 피부에서 발생하는 진피 신경섬유종이거나 큰 신경 또는 신경총에서 발생하는 망상형 신경섬유종입니다. 진피 신경섬유종과 망상형 신경섬유종의 병리학은 동일하지만, 생물학적 거동은 상당히 다릅니다 - 진피와 망상신경섬유종은 모두 양성이지만, 망상신경섬유종만이 변형을 겪을 수 있고 MPNST를 일으킬 수 있습니다. NF1 유전자에 의해 암호화된 Ras GTPase 활성화 단백질인 뉴로피브롬의 손실 외에도, MPNST는 TP53 4,5,6,7, CDKN2A 8,9 및 PTEN 10을 포함한 여러 다른 종양 억제 유전자의 돌연변이, 폴리콤 억제 복합체 2 11,12 의 구성 요소를 암호화하는 유전자의 돌연변이(PRC2; SUZ12 및 EED 유전자) 및 수용체 티로신 키나아제 1,2의 비정상적인 발현. NF1 및 상술한 다른 유전자들의 돌연변이는 산발적이고 방사선에 의해 유도된 MPNST에서도 존재한다11,12.

MPNST의 게놈 이상에 대한 이해의 이러한 발전은 발병 기전을 이해하는 데 매우 중요하지만 MPNST에 대한 효과적인 새로운 치료법의 개발로 이어지지는 않았습니다. 새로운 치료법의 개발을 방해하는 주요 장벽은 MPNST가 희귀 암이라는 사실입니다. 이 때문에 TCGA(The Cancer Genome Atlas)에서 수행한 것과 같은 주요 동인 돌연변이를 정의하는 글로벌 분석에 필요한 많은 수의 환자 샘플을 얻기가 어렵습니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 적당한 수의 인간 MPNST 표본을 축적하는 데에도 몇 년이 걸릴 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 다른 희귀 암 유형을 연구하는 많은 연구자들은 필수 드라이버 유전자 돌연변이를 식별하고, 관심 종양에서 필수 세포질 신호 전달 경로를 정의하고, 새로운 치료 표적을 식별하기 위해 종 간 비교 종양유전체학을 사용하고 있습니다. 종양형성에 필수적인 신호전달 경로는 인간과 다른 척추동물 종 사이에서 매우 잘 보존되어 있기 때문에 게놈 스케일 shRNA 스크리닝과 같은 기능적 유전체학 접근법을 적용하는 것은 이러한 새로운 드라이버 돌연변이, 신호전달 경로 및 치료 표적을 식별하는 효과적인 수단이 될 수 있습니다 13,14,15,16,17,18,19, 특히 제한된 수로 사용할 수 있는 희귀 인간 종양 유형을 연구할 때20개.

여기에 제시된 방법론에서는 성장 인자 뉴레굴린-1(NRG1)의 슈반(Schwann) 세포 특이적 과발현이 망상형 신경섬유종의 발병 기전과 MPNST로의 후속 진행을 촉진하는 유전자 조작 마우스 모델(GEM)인 P 0-GGFβ3 마우스에서 유래한 인간 MPNST 세포주 및 초기 통과 MPNST 배양에서 게놈 프로파일링을 수행하는 이러한 접근 방식을 설명합니다21, 22,23. 이 접근법의 첫 번째 단계는 P 0-GGFβ3 MPNST, 인간 MPNST 세포주 및 외과적으로 절제된 인간 MPNST에서 후보 드라이버 유전자를 식별하는 것입니다. 이러한 돌연변이의 영향을 받는 신호 전달 경로를 기능적으로 검증하기 위해 게놈 스케일 shRNA 스크리닝을 사용하여 인간 및 마우스 MPNST 세포주에서 증식과 생존에 필요한 유전자를 식별합니다. 증식과 생존에 필요한 유전자를 확인한 후, 약물 유전자 상호작용 데이터베이스(Drug Gene Interaction Database)를 사용하여 "히트(hit)" 컬렉션 내에서 약물 가능한 유전자 산물을 식별합니다. 또한 GEM 모델과 인간 MPNST가 동일한 유전자 및 신호 전달 경로에 대해 유사한 의존성을 보이는지 여부를 결정하기 위해 인간 및 마우스 MPNST 세포의 "적중"을 비교합니다. 증식 및 생존에 필요한 유전자와 영향을 받는 신호 전달 경로의 중복을 식별하는 것은 분자 수준에서 P 0-GGFβ3 마우스 모델을 검증하는 수단이 됩니다. 이 접근법은 또한 인간 스크리닝을 보완하는 역할을 할 수 있는 새로운 치료 표적을 식별하기 위해 인간과 마우스 스크리닝을 결합하는 효과를 강조합니다. 이러한 종간 접근법의 가치는 인간 종양과 세포주를 얻기 어려운 희귀 종양에서 치료 표적을 찾을 때 특히 분명합니다.

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프로토콜

연구를 시작하기 전에 바이러스 벡터를 취급하기 위한 동물 절차 및 프로토콜을 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 및 IBC(Institutional Biosafety Committee)에서 검토하고 승인합니다. 여기에 설명된 절차는 사우스캐롤라이나 의과대학의 IACUC 및 IBC 이사회의 승인을 받았으며 NIH 실험실 동물 관리 및 사용 가이드 및 MUSC의 기관 동물 관리 지침에 따라 적절하게 훈련된 직원이 수행했습니다.

1. WES-Seq 분석 및 병원성 변이 식별

  1. 시판되는 표준 흡착 실리카겔 기반 방법을 사용하여 60mm 접시에서 성장한 종양 샘플 또는 하위 합류(70%) MPNST 세포에서 게놈 DNA를 분리합니다(자세한 단계는 제조업체 프로토콜 참조). 일반적인 워크플로는 그림 1에 다이어그램으로 표시되어 있습니다.
  2. 게놈 DNA의 다른 양 또는 농도가 지정되지 않는 한 50ng/μL에서 최소 10μL의 게놈 DNA를 염기서열분석 코어에 제출합니다.
    1. 핵심 시설은 초음파 처리로 게놈 DNA를 단편화한 다음 선호하는 방법을 사용하여 정제합니다. 엑솜 포획 및 라이브러리 구축은 선호하는 엑솜 염기서열분석 키트를 사용하여 수행되며 인덱스 태그는 증폭된 포획된 엑솜에 추가됩니다.
    2. 전체 엑솜 쌍 말단 염기서열 분석(WES, 각 말단에서 100bp 염기서열 분석)을 수행하기 위해 시퀀싱 코어에 검체를 제출합니다.
    3. 코어에서 생성된 FASTQ 파일은 조사자에게 제공됩니다. 분석을 위해 품질 메트릭을 통과한 FASTQ 파일만 사용합니다.
  3. 시중에서 판매되는 소프트웨어 프로그램(예: DNAStar19,20, Partek21 또는 Varsome)을 사용하여 FASTQ 파일을 정렬하고 분석합니다. FASTQ 정렬 file기본 설정을 사용하여 마우스 참조 게놈 GRCm38/mm10에 연결합니다.
    참고: DNAStar 및 마우스 MPNST 표본을 예로 들어 일반적인 워크플로우는 그림 1 아래에 간략하게 설명되어 있습니다.
    1. DNAStar 소프트웨어를 열고 SeqMan NGen 워크플로우를 선택합니다.
    2. Variant Analysis/Resequencing(변이체 분석/재염기서열분석)과 염기서열분석 유형(NGS 기반 앰플리콘, 유전자 패널 또는 엑솜)을 선택하여 Workflow를 선택합니다. 다음을 클릭합니다.
    3. Download Genome Package(게놈 패키지 다운로드)와 적절한 참조 게놈(예: Mus_musculus-GRCm38-dbSNP146.zip 또는 Homo sapien-GRCh37.p13.zip)을 선택하여 선호하는 참조 서열을 선택합니다. 핵심 시설에서 침대 파일을 제공한 경우 이 보조 파일을 업로드합니다. 다음을 클릭합니다.
    4. 적절한 시퀀서 기술인 Illumina를 선택하여 Input Sequences(입력 시퀀스)를 선택하고 시퀀싱 읽기 가 paired-end(쌍 끝)임을 지정합니다. 그런 다음, 실험 설정, 다중 샘플을 선택하고 추가를 선택하여 시퀀싱 FASTQ 파일을 업로드합니다. 여러 검 체를 실행하는 경우 각 paired-end set을 고유한 실험 또는 검체 이름 종양, 세포주 또는 A18, A202... 다음을 클릭합니다.
    5. 제어 데이터 세트가 있는 경우 설정합니다. 다음(Next)을 클릭하고 어셈블리 옵션(Assembly Options)에서 다음(Next)을 다시 클릭합니다. Analysis Options(분석 옵션)에서 적절한 Variant Detection mode(변형 검출 모드)를 Diploid(이배체)로 클릭한 후 Next(다음)를 클릭합니다. Assembly Output(어셈블리 출력)에서 프로젝트의 파일 저장 위치를 지정하고 이름을 지정합니다. 다음을 클릭합니다. 로컬 컴퓨터 또는 클라우드에서 어셈블리를 실행합니다.
      참고: 결과 정렬 파일은 검출된 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 변이체 주석을 위해 ArrayStar 워크플로우에서 열 수 있습니다. 이 워크플로우는 유전자 복제 수의 증가 또는 손실이 아닌 SNP를 검출합니다. 고밀도 SNP 어레이라고 하는 별도의 분석은 복제 수 변화를 감지합니다. 전체 엑솜 염기서열분석은 복제 수 변화를 안정적으로 검출하지 못합니다. 정렬 프로그램으로 수행할 특정 단계에 대해서는 프로그램 사용 설명서를 참조하십시오.
    6. 검출된 SNP의 변이체 주석에 사용자 정의 필터를 적용하여 특정 데이터를 포함하거나 제외할 수 있습니다. 기능적으로 관련성이 있을 수 있는 변이체의 요약된 목록을 얻으려면 이 계층의 변이 데이터 세트에 not in control (정상 대조군 샘플을 사용할 수 있는 경우), 집단 빈도(gnomAD, ExAC, 1,000 게놈 빈도), 대립유전자 빈도 (≤0.001 또는 0.1% 포함), 커버리지 깊이 (<10 depth 제외), 병원성 또는 ClinVar class 필터를 적용합니다. (포함: 병원성, 병원성 가능성, 제외: 불확실, 양성 가능성, 양성) 및 원하는 경우 SNP 유형 및 코딩 영향 (비동의어, 오센스, 넌센스, 프레임시프트, 프레임 내, 스플라이싱).
      참고: 알려진 관련 암 유전자 목록을 최종 목록에 적용하여 특정 질병 관련 유전자만 가져올 수도 있습니다(1.3.7단계 참조). 이러한 필터는 변이 유전자 목록을 20개 미만의 유전자로 줄일 수 있습니다.
      1. 변이체 대립유전자 빈도를 사용하여 염기서열분석 오류 SNP를 필터링합니다. 동형접합 및 이형접합 변이체는 순수 비오염 세포 집단에 대해 각각 약 100% 및 50%로 표시됩니다(확립된 종양 유래 세포주는 동인성 종양 세포의 단일 집단을 나타내야 함). 이 경우 변이체에 대해 100-90% 및 50-40% 대립유전자 빈도를 필터로 적용하여 그 미만의 변이체를 제거합니다. 동일한 데이터 세트에 대해 고밀도 SNP 어레이 데이터도 사용할 수 있는 경우 변이체 대립유전자 빈도가 동형접합 또는 이형접합 비율보다 작은 SNP에 복제 수 이득 또는 손실을 적용합니다(즉, 복제 수 이득으로 인해 대립유전자 A의 사본 2개와 대립유전자 B의 사본 1개가 생성되면 적절한 변이체 대립유전자 빈도가 75%, 25%, 각기).
    7. ArrayStar로 병원성 변이체를 식별한 후 변이체 유전자 목록을 csv, txt 또는 xls 파일로 내보내고 저장하고 이러한 돌연변이가 포함된 유전자를 P 0-GGFβ3 생성 종양 코호트의 유전자와 비교하여 중복되고 고유한 돌연변이 유전자 목록을 확인합니다. 돌연변이 유전자를 인간 유전자와 관련된 알려진 돌연변이 유전자와 비교합니다(예: Bushman Lab 암 유전자 목록 또는 사용자 선별 목록).
      1. 선택 사항으로, 사용자 정의 필터(1.3.6)를 적용하기 전에 주석이 달린 파일을 VCF 파일로 내보내고 저장합니다.
        참고: 이 VCF 파일은 2차 분석으로 비교하기 위해 다른 변이 이펙터 예측 소프트웨어 Varsome 또는 VEP에 업로드할 수 있습니다. 필터링된 변이 유전자 목록에서 생물학적 및 경로 분석도 수행할 수 있습니다.
    8. 사용자 선호 데이터베이스를 통해 변이체 유전자 목록의 기능적 분류를 수행하여 단백질 클래스, 경로, 경로 구성 요소, 유전자 패밀리 및 온톨로지 정보를 얻을 수 있습니다.
      참고: 여기서는 PANTHER (pantherdp.org)가 ex로 사용됩니다.
      1. 유전자 ID로 필터링된 유전자 목록을 업로드합니다.
      2. 유기체(Mus musculus)를 선택합니다.
      3. 분석(유전자 목록에서 본 기능 분류)을 선택하고 필터링된 변이 유전자 목록에 대한 생물학적 및 경로 분석 제출 을 클릭합니다.

2. 게놈 스케일 shRNA 스크리닝

참고: 저통로 종양 배양을 통한 게놈 스케일 기능 스크리닝에 사용할 수 있는 여러 shRNA 및 CRISPR 라이브러리를 사용할 수 있습니다. 여기서는 CELLECTA DECIPHER shRNA 라이브러리의 사용을 예로 들어 설명합니다. CELLECTA DECIPHER 렌티바이러스 shRNA 라이브러리는 통합 형식의 RNAi 유전자 스크리닝에 최적화되어 있습니다. 각 전사체는 최소 5-6개의 고유한 shRNA에 의해 표적화되며, 각 렌티바이러스 shRNA 벡터는 PCR 프라이머 부위 측면에 고유한 유전자 바코드를 포함합니다. 이 라이브러리는 인간 및 생쥐 질병 관련 유전자의 대부분을 다루지만 게놈의 모든 유전자를 다루지는 않습니다. Cellecta human library plasmid DNA pool은 3개의 모듈(Human Module I, II, III, 15,377개의 유전자 표적)로 제공되는 반면, mouse library plasmid pool은 2개의 모듈(Mouse Module I 및 II, 9,145개 유전자 표적)로 제공됩니다. 이러한 라이브러리는 증식 및/또는 생존에 필요한 표적 유전자가 바이러스 형질 도입 후 서로 다른 시점에서 다르게 발현되는 "드롭아웃" 분석을 수행하는 데 사용됩니다.

  1. 렌티바이러스 포장
    1. 0일차: 10% 소 태아 혈청(FBS)이 포함된 무항생제 DMEM을 30mL/접시에 담아 1,000만 293T 세포/15cm 접시 10접시에 담습니다.
    2. 1일차: 다음 날 세포가 ~80% 합쳐지고 transfection할 준비가 되었는지 확인합니다. 50 mL 코니컬 튜브에 600 μL의 패키징 플라스미드 믹스(0.5 μg/μL), 60 μL의 플라스미드 바코드 라이브러리, 12 mL의 DMEM(혈청 또는 항생제 없음), 600 μL의 transfection 시약을 순서로 혼합합니다. 실온에서 15분 동안 배양합니다.
    3. 900 μL의 transfection 시약과 12 mL DMEM을 별도의 15 mL 코니컬 튜브에 넣고 볼텍싱으로 혼합합니다. 12.9mL의 transfection 시약/DMEM 혼합물을 DNA 혼합물에 넣고 튕겨 혼합합니다. 더 이상 혼합하지 않고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 이 혼합물 2.5mL를 293T 세포의 각 15cm 접시에 적하 방향으로 넣고 조직 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.
    4. 2일차: 다음 날 배지를 항생제가 함유된 일반 성장 배지로 교체합니다.
    5. 3일차: 배지를 채취하여 0.2μm 여과 장치를 통과시키고 15mL 코니컬 튜브에 분주하여 바이러스를 수확합니다. 또한 바이러스 적정에 사용하기 위해 극저온 내로 여과된 바이러스의 1mL 분취액 5개를 준비합니다(48시간 바이러스로 간주됨). 바이러스를 -80 °C 냉동고에 보관하십시오. 세포가 마르지 않도록 플레이트에 30mL의 성장 배지를 한 번에 하나씩 교체합니다.
    6. 4일차: 배지를 채취하고 0.2μm 여과 장치를 통과시켜 바이러스를 채취합니다. 바이러스를 15mL 원뿔형 튜브에 분취합니다. 이것은 72시간 바이러스로 간주됩니다. 바이러스를 -80 °C 냉동고에 보관하십시오.
  2. Titer Lentiviral 풀(Titer Lentiviral Pool)
    1. 65mL의 종양 세포 성장 배지에 65μL의 양이온성 폴리머(10mg/mL)를 추가합니다. 폴리머 함유 배지 1mL/웰을 11개의 6-웰 조직 배양 플레이트에 피펫팅합니다. 초기 통과 종양 세포를 트립신화하고 선호하는 방법을 사용하여 세포를 계수하여 각 웰이 50,000 cells/mL/well을 받도록 합니다. 냉동실에서 48시간 렌티바이러스 1mL 분취액을 37°C 수조에서 해동합니다.
    2. 각 바이러스 모듈에 대해 표 1과 같이 감염을 준비합니다.
    3. 모든 6웰 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 다음 날, 바이러스 배지를 제거하고 새로운 성장 배지로 보충하십시오. 48시간에, 선택을 받는 모든 웰에 puromycin 함유 배지를 추가합니다. 대조군 세포가 합쳐지기 전에 선호하는 방법을 사용하여 생존 클론의 세포 계수를 수행합니다.
      참고: non-transducted 세포를 죽이는 데 필요한 puromycin의 농도는 "kill" 곡선에서 농도 범위를 테스트하여 경험적으로 미리 결정해야 합니다. 형질도입되지 않은 배양물의 사멸을 균일하게 유도하는 가장 낮은 농도를 사용합니다.
  3. 표적 세포의 렌티바이러스 감염
    1. MPNST 세포를 트립시화하고 개수를 계산합니다. 15cm 접시당 250만 개의 세포를 플레이트하여 모듈당 총 20개의 15cm 접시를 만들 수 있습니다. 바이러스를 해동하고 5μg/mL의 양이온성 중합체가 있는 상태에서 0.5의 MOI로 바이러스로 세포를 transduction합니다(그림 2A).
    2. 다음날 아침에 바이러스가 함유된 배지를 제거하고 새로운 성장 배지로 교체합니다. 추가로 2일 동안 세포를 배양하여 선택 마커의 발현을 허용한 다음 배양물에 퓨로마이신을 추가하여 형질도입되지 않은 세포를 제거합니다.
    3. 퓨로마이신을 첨가한 후 3일 후 세포를 트립신화하고 탁상용 원심분리기에서 5분 동안 세포 집단의 절반을 200×g으로 원심분리합니다. 펠릿 세포를 향후 게놈 DNA 준비를 위해 -80°C 냉동고에 보관합니다. 이는 참조 시점 또는 시점 1(T1)입니다.
    4. 세포 개체군의 나머지 절반을 다시 도금하고 위와 같이 수확 및 원심 분리하기 전에 약 7 개체군 두 배로 성장시킵니다. 이 세포 펠릿은 최종 시점(시점 2, T2) 역할을 하며 향후 게놈 DNA 분리를 위해 -80°C에서 보관됩니다(그림 2).
  4. 바이러스 풀로 형질도입된 세포에서 게놈 DNA 분리
    1. -80°C 냉동고에서 세포 펠릿을 해동하고 RNAse가 첨가된 10mL의 재현탁액 완충액에 펠릿을 다시 현탁시킨 다음 즉시 두 개의 15mL 폴리메틸펜텐 튜브로 분리합니다(그림 2B).
    2. 5mL 당 500μL의 10% SDS를 첨가하고 혼합한 후 실온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 튜브를 DNA 전단 장치에 넣어 30 초 켜기 / 30 초 끄기의 25주기 동안 DNA를 초음파 처리하여 온도를 4 ° C로 유지합니다.
    3. pH 8.0(4°C에서 보관)의 페놀/클로로포름 5mL를 넣고 사용하기 전에 페놀/클로로포름을 잘 혼합해야 합니다. 페놀/클로로포름을 첨가한 후 최대 설정에서 45-60초 동안 세게 소용돌이쳐 잘 섞습니다. -20°C에서 7,200 × g에서 60분 동안 원심분리기
      알림: 소용돌이 후 거품이 많은/유백색 모양은 완전한 재현탁을 나타냅니다.
    4. 투명한 상부 상 3mL를 새 15mL 튜브에 옮기고 3M 아세트산 나트륨 0.5mL와 이소프로판올 4mL를 넣고 잘 섞습니다(그림 2C). 20°C, 7,200× g에서 30분 동안 원심분리합니다.
    5. 원심분리 후 상층액을 버리고 남은 액체를 조심스럽게 피펫으로 분리합니다. 70% 에탄올 0.5mL를 넣고 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 제거합니다. 재현탁된 펠릿을 1.5mL 원심분리 튜브로 옮기고 동일한 샘플의 두 펠릿을 단일 1.5mL 원심분리 튜브에 결합합니다. 탁상형 원심분리기에서 최대 속도로 5분 동안 원심분리합니다.
    6. 상층액을 버리고 실험실 물티슈를 사용하여 잔류 70% 에탄올을 흡수합니다. 펠릿을 증류수 0.5mL에 다시 현탁시키고, 재부유를 어렵게 하므로 펠릿이 마르지 않도록 하십시오. DNA 농도를 측정하기 전에 샘플을 4°C에서 보관합니다.
  5. shRNA 바코드 증폭을 위한 중첩 PCR
    참고: 저장소에서 DNA를 꺼내 얼음 위에 놓습니다. DNA 농도가 100ng/μL 미만인 경우 DNA를 진공 건조 속도로 건조하고 적절한 양의 증류수에 재현탁합니다. 한 번에 하나의 모듈만 처리하는 것이 좋습니다(시점 1(T1) 또는 시점 2(T2)). 마지막에 풀링될 각 시점의 두 가지 준비를 수행합니다. 따라서 같은 날에 반복 시점을 처리하지 않는 것이 중요합니다. 다음 프로토콜은 게놈 DNA의 한 시점에 대한 것입니다.
    1. 7개의 튜브를 설정하고 설명된 대로 레이블을 지정합니다: 음성 대조군, 양성 대조군, 게놈 DNA용 튜브 4개, 마스터 믹스용 튜브 1개(그림 3A). 네거티브 컨트롤은 증류수입니다. 양성 대조군은 렌티바이러스를 생성하기 위해 293T transfection에 사용되는 플라스미드 DNA입니다.
    2. 표 2에 표시된 대로 먼저 각 튜브에 물을 추가합니다.
    3. 표 3과 같이 마스터 믹스(MM)를 준비합니다.
    4. 물이 들어 있는 각 튜브에 18μL의 MM을 추가합니다. 다음으로, 25μL의 게놈 DNA를 4개의 템플릿 튜브 각각에 추가합니다. 그런 다음 양성 대조군 1μL(10ng/μL)를 양성 대조군 DNA로 다른 튜브를 오염시키지 않도록 주의하면서 양성 대조군 튜브에 추가합니다. 마지막으로 각 튜브에 2μL의 중합효소를 추가하여 4개의 샘플 튜브에 먼저 추가하고 양성 대조 튜브를 마지막에 추가합니다. PCR 튜브를 혼합하고 회전시킵니다(그림 3).
    5. 표 4에 기재된 조건 하에서 PCR 반응을 수행한다.
    6. 첫 번째 PCR이 실행되는 동안 표 5에 표시된 대로 2차 PCR을 위한 튜브를 준비합니다. 7개의 튜브(음성 대조군, 양성 대조군, 게놈 DNA용 튜브 4개, MM용 튜브 1개)를 설정합니다(그림 3B).
    7. 물이 포함된 각 튜브에 22μL의 MM을 추가하고 DNA와 중합효소를 추가하기 전에 PCR의 첫 번째 라운드가 완료될 때까지 기다립니다.
      1. PCR의 첫 번째 라운드가 완료되면 4개의 샘플 튜브를 하나의 마이크로 원심분리기 튜브에 결합하고 혼합합니다.
      2. 물이 들어 있는 각 샘플 튜브에 25μL를 추가합니다.
      3. 다음으로, 첫 번째 PCR 음성 대조군의 2μL와 첫 번째 PCR 양성 대조군의 2μL를 적절하게 표지된 튜브에 추가합니다.
      4. 각 튜브에 2μL의 중합효소를 추가하여 4개의 샘플 튜브에 먼저 추가하고 음성 대조군을 마지막에 추가합니다.
    8. 표 6에 기재된 바와 같이 PCR 반응을 수행한다.
      참고: 3.5% 아가로스 겔에 대한 전기영동에 의한 첫 번째 PCR 반응의 결과를 분석할 때, 풍부한 생성물이 얻어지면 이 절차의 다음 반복을 위해 사이클 수를 9-10으로 줄일 수 있습니다. 마찬가지로 제품 수율이 낮으면 사이클을 14로 늘릴 수 있습니다.
    9. 두 번째 PCR 반응이 완료되면 4개의 샘플을 하나의 마이크로 원심분리기 튜브와 80μL의 6배 로딩 염료에 결합합니다. 양성 및 음성 대조군의 경우 20μL의 샘플을 사용합니다.
      1. Tris-Borate-EDTA(TBE) 완충액에서 3.5% 아가로스 겔을 준비합니다(그림 4A). 큰 샘플 부피를 수용하려면 여러 개의 웰을 함께 테이프로 붙여서 겔 빗에 하나의 큰 웰을 만들고(부피에 맞는 빗을 사용할 수 없는 경우) 양성 및 음성 대조군에 사용할 수 있는 두 개의 웰을 남겨 두어야 합니다. 90V에서 1시간 동안 겔을 실행합니다.
    10. 겔을 시각화하고 약 250 염기쌍(bp)에서 밴드를 확인합니다.
  6. 첫 번째 정제: 겔 추출
    1. 깨끗한 메스나 면도날을 사용하여 250bp 밴드를 절제하고 가능한 한 많은 젤을 잘라냅니다. 큰 밴드를 4개로 나누고 각 조각을 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브에 옮깁니다. 각 젤 조각의 무게를 측정하고 기록합니다.
      참고: 각 조각은 튜브당 약 200mg 이하여야 합니다.
    2. 6 부피의 가용화 완충액을 추가합니다(예: 겔 조각의 무게가 200mg인 경우 완충액 1.2mL를 추가합니다). 튜브를 50°C 수조에 넣고 젤 조각이 녹을 때까지 10-15분마다 회전합니다. 그런 다음 각 튜브에 1부피의 이소프로판올을 추가합니다(예: 겔 조각의 무게가 200mg인 경우 이소프로판올 0.2mL).
    3. 정제를 위해 2개의 스핀 컬럼을 사용하여 4개의 튜브 모두에서 컬럼으로 샘플을 로드합니다. 컬럼이 750μL만 보유하므로 모든 시료 부피를 처리하기 위해 여러 번 회전을 수행합니다. 기존의 탁상형 마이크로 원심분리기에서 1분 동안 17,900× g 의 컬럼을 회전하고 매번 플로우스루를 폐기합니다.
    4. 750μL의 세척 버퍼로 컬럼을 세척하고 17,900× g 에서 1분 동안 원심분리기를 세척합니다. 세척 후 플로우스루를 버리고 17,900× g 에서 3분 동안 원심분리하여 스핀 컬럼을 건조합니다. 컬럼당 50μL의 증류수로 DNA를 용출하고 이전과 같이 1분 동안 원심분리하고 두 튜브를 결합하여 총 100μL의 시료 부피를 얻습니다.
  7. 2차 정제
    1. 이 다음 정제 단계에서는 작은 단편을 제거하지 않는 결합 완충액 2(PCR 정제 키트)를 사용합니다. 100μL의 DNA에 400μL의 완충액을 추가하고 하나의 스핀 컬럼에 로드합니다(그림 4B). 샘플을 17,900× g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
    2. 다음으로, 650μL의 세척 완충액으로 멤브레인을 세척하고 이전에 수행한 대로 탈수합니다. 위와 같이 추가 원심분리로 스핀 컬럼을 3분 동안 건조시킵니다.
    3. 30μL의 증류수로 DNA를 용출하고 1분 동안 최대 속도로 회전시킵니다. 용출 후 분광 광도계의 농도를 확인하십시오. 농도가 10ng/μL 이상 또는 70-80ng/μL 이상인지 확인하십시오. DNA를 -20°C 냉동고에 보관합니다.
  8. 증폭된 바코드의 염기서열분석
    1. 염기서열분석의 경우 용출 완충액(EB)을 사용하여 정제된 바코드를 0.75ng/μL로 희석합니다. 염기서열 다양성을 추가하기 위해 앰플리콘은 30%(v/v) PhiX를 포함하여 17pM에서 클러스터링됩니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 자동화된 클러스터 생성 시스템에서 단일 종단(SE) 클러스터링을 수행합니다.
    2. 염기서열분석 코어가 NextGen 시퀀서에서 총 36사이클의 단일 종단 염기서열분석을 수행하도록 합니다(그림 4C). 맞춤형 프라이머 GexSeqS를 0.5μM의 Illumina 염기서열분석 프라이머에 추가합니다.
    3. 참조된 분석 소프트웨어를 사용하여 Fastq 파일을 생성하고 소프트웨어를 사용하여 처리하여 판독 길이를 18개의 뉴클레오티드로 트리밍합니다.
    4. 바코드 분석기 및 디콘볼루터 소프트웨어를 사용하여 트리밍된 판독을 디콘볼루션합니다. 각 shRNA에 대한 fold depletion score를 reference time point(T1)와 final time point(T2)의 read count의 비율로 계산합니다.
  9. shRNA 스크리닝 결과 분석 및 후보 치료제 표적 식별
    참고: Cellecta shRNA 라이브러리에서 대부분의 유전자는 5개(67%) 또는 6개(32%)의 서로 다른 shRNA에 의해 표적화됩니다. 그러나 대부분의 세포에서 적중해야 하는 여러 하우스키핑 유전자는 많은 수의 shRNA에 의해 표적이 되며 음성에 대한 점수 범위를 정의하는 대조군 역할을 합니다.
    1. 더 많은 수의 shRNA가 표적으로 하는 유전자에 대한 편향을 방지하기 위해 depletion scores를 log 변환합니다. 경험적 분포에서 각 유전자에 대한 80번째 백분위수를 계산하여 분위수 추정을 수행합니다.
    2. 로그 접힘 고갈 점수의 null 분포를 생성하려면 유전자의 >95%가 고갈되지 않고 로그 분위수 점수가 정규 분포를 따른다고 가정합니다. 경험적 분포의 중위수를 사용하여 귀무 분포의 평균을 추정합니다. 이 null 분포를 사용하여 null 분포의 95번째 백분위수보다 큰 로그 접기 고갈 점수를 가진 모든 유전자를 '적중'으로 분류합니다.
      NOTE: 모든 히트에는 cut-point 이상의 depletion score를 가진 shRNA가 2개 이상 있어야 합니다(그림 5).
    3. RNAi 드롭아웃 스크리닝 데이터의 품질과 컷포인트의 유효성을 평가하려면 비교를 위해 COLT 암 RNAi 스크리닝 이니셔티브24,25에서 '핵심 필수'로 정의된 유전자 세트를 사용하십시오. 히트 목록에서 CEG를 제거하여 잠재적인 치료 대상의 초기 목록을 생성합니다.
      참고 : COLT 세트의 유전자는 COLT에 의해 선별 된 72 개의 암 세포주 중 >50 %에서 히트로 득점되었습니다. 핵심 필수 유전자 목록에는 640개의 유전자가 포함되어 있습니다.
    4. 여러 MPNST 세포주에서 공통적으로 또는 균일하게 요구되는 잠재적인 치료 표적을 식별하기 위해 다양한 MPNST 세포주 또는 초기 배양 배양의 스크리닝에서 식별된 non-CEG 적중률의 벤 다이어그램을 구성합니다(그림 6A). MPNST 회선 또는 문화권의 전체 또는 대부분에 필요한 비 CEG 적중의 우선 순위를 지정합니다.
      1. 또는 각 세포주 또는 초기 통로 배양에서 non-CEG 히트 리스트에 대한 경로 분석을 수행하여 종양 세포 증식 및/또는 생존에 필요한 신호 전달 경로의 구성 요소를 인코딩하는 유전자를 식별합니다. 그런 다음 비 CEG의 경로 분석에서 식별된 신호 전달 경로를 WES로 식별된 돌연변이의 영향을 받는 것으로 식별된 신호 전달 경로와 비교합니다.
        참고: WES에서 확인된 돌연변이에 의해 지속적으로 영향을 받는 신호전달 경로를 식별하고 이를 shRNA 스크리닝에서 중요한 것으로 확인된 신호전달 경로와 비교하는 것이 특히 유용합니다.
    5. 치료제를 이미 사용할 수 있는 약물 표적을 식별하려면 약물 유전자 상호 작용 데이터베이스(dgidb.org)를 사용하여 핵심 필수 유전자를 제거한 후 남아 있는 히트 목록을 스크리닝합니다.
      참고: 이 데이터베이스를 사용하면 유전자 목록을 동시에 입력하고 스크리닝할 수 있으며 현재 이러한 유전자를 표적으로 하는 데 사용할 수 있는 약물에 대한 지침을 제공합니다.
    6. 식별된 약물 유발 고관심 표적을 먼저 단일 배치 형식(방금 설명한 라이브러리-배치 형식이 아님)으로 초기 라이브러리 스크리닝에 사용된 것과 다른 shRNA로 유전자 발현을 녹다운하여 검증합니다. 유전자 발현을 knock down하려면 2-3개의 렌티바이러스 shRNA를 사용합니다. 감염 후 3-4일 후, 종양 세포 증식과 생존에 미치는 영향을 아래에 설명된 대로 결정합니다.

3. 후보 치료제로 도전된 MPNST 세포에서 세포 수 및 생존력에 대한 세포분석기 분석 수행

  1. DMEM의 MPNST 세포를 80% 밀도로 성장시킵니다. 실온의 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)으로 셀을 헹굽니다.
    알림: 이러한 세포의 성장은 도금 후 한동안 지연되므로 세포를 밀도로 성장시키지 마십시오.
  2. 비효소 세포 해리 용액으로 30초에서 1분 동안 세포를 덮어 기질에서 세포를 분리합니다. 해리 용액 1mL당 5mL의 DMEM을 추가하고 세포를 위아래로 부드럽게 피펫하여 기질에서 분리합니다.
  3. 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 흑색 벽의 96-웰 플레이트에서 웰당 1,200개 세포 밀도의 플레이트 셀; 테스트할 각 약물 희석에 대해 최소 3개의 웰을 플레이트하고 이러한 실험의 생물학적 복제를 3회 수행합니다.
  4. 테스트할 약물의 초기 농도를 결정하려면 문헌을 검토하여 다른 암세포 유형에 대해 어떤 농도가 효과적인지 평가하십시오. 초기 실험에서는 다른 암 유형에 사용되는 약물 농도보다 두 자릿수 높은 범위와 두 자릿수 낮은 범위를 테스트합니다.
  5. 테스트할 약물의 희석액을 준비하고 각 희석액 또는 비히클을 최소 3개의 복제 웰에 추가합니다.
  6. 약물 추가 후 1, 3, 5 및 7일 후에 직접 세포 수를 평가합니다. Hoechst 33342를 최종 농도 5μg/mL에 추가하고 37°C에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 100,000ms 노출 시간의 Direct cell count for total cell number 옵션을 사용하여 high-throughput imaging cytometer에서 plate를 판독합니다.
  7. 소프트웨어를 사용하여 판독값을 분석하고 스프레드시트로 내보내고 통계 분석에 적합한 소프트웨어를 사용합니다.
  8. 약물 처리된 웰에서 통계적으로 유의미한 세포 수 감소가 관찰되는 경우 "Live/Dead" 분석을 수행하여 이러한 감소가 부분적으로 세포 사멸 유도에 기인하는지 여부를 결정합니다.
    1. 3.3단계에서 설명한 대로 검은색 벽의 96웰 플레이트에 있는 플레이트 셀.
    2. 3.5단계에 설명된 대로 약물을 준비하고 추가합니다.
    3. 약물 추가 후 1, 3, 5 및 7일 후에 세포 생존율과 사멸을 평가합니다. 칼세인 AM을 최종 농도 1μM에 추가하고 요오드화 프로피듐을 최종 농도 1μM에 각 웰에 추가합니다. 37°C에서 15분 동안 세포를 배양합니다.
    4. Live+Dead 소프트웨어 옵션을 사용하는 이미징 세포의 이미지 세포. 소프트웨어를 사용하여 판독값을 분석하고 스프레드시트로 내보내고 통계 분석에 적합한 소프트웨어를 사용합니다.

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결과

그림 5 플롯은 스크리닝된 각 인간 세포주에서 TRUE로 표시된 핵심 필수 유전자(CEG)의 결핍 점수를 비 CEG(FALSE로 표시)와 비교하여 보여줍니다. 포인트는 개별 유전자에 대한 접힘 고갈 점수의 log2를 나타내며, 이는 전체 점수 분포의 상자 그림 표현 위에 표시됩니다. 스튜던트 t-검정은 각 세포주에서 두 그룹 간의 공핍 점수 평균의 유의한 차이를 검정하는 데 사용되었?...

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토론

여기에 제시된 자세한 방법은 말초 신경계 종양 및 MPNST 발병 기전을 연구하기 위해 개발되었습니다. 이러한 방법이 효과적인 것으로 확인되었지만 여기에서 설명하는 방법에는 몇 가지 잠재적인 제한 사항이 있음을 인식해야 합니다. 아래에서는 이러한 한계 중 일부와 다른 모델 시스템에서 이를 극복하기 위한 잠재적 전략에 대해 설명합니다.

전체 엑솜 염기서열분석이 P 0-...

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공개

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소(R01 NS048353 및 R01 NS109655 SLC의 보조금으로 지원되었습니다. R01 NS109655-03S1 - D.P.J.), 국립 암 연구소(R01 CA122804 - S.L.C.), 국방부(X81XWH-09-1-0086 및 W81XWH-12-1-0164 - S.L.C.).

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Bioruptor Sonication SystemDiagenode UCD-600
CASAVA 1.8.2
CbotIllumina, San Diego, CAN/A
Celigo Image CytometerNexcelomN/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve HybridDecon Laboratories5989-27-5
Corning 96-well Black MicroplateMillipore SigmaCLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubesDiagenode C30010009
dNTP mixClontech639210
Eosin YThermo Scientific7111
Elution bufferQiagen 19086
Ethanol (200 Proof)Decon Laboratories2716
Excel Microsoft 
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’HPLC purified
GraphPad PrismDotmatics
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
Illumina HiScanSQIllumina, San Diego, CAN/A
Paraformaldehyde (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
PLUS Transfection ReagentThermo Scientific11514015
Polybrene Transfection ReagentMillipore SigmaTR1003G
PureLink Quick PCR Purification KitInvitrogenK310001
Qiagen Buffer P1Qiagen 19051
Qiagen Gel Extraction KitQiagen28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymeraseClontech639210
Trimmomatic softwarewww.usadellab.org

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