遗传分析和基因组规模的辍学筛选以确定恶性周围神经鞘瘤小鼠模型中的治疗靶点

摘要

我们开发了一种跨物种比较肿瘤基因组学方法，利用基因组分析和功能基因组筛选来识别和比较基因工程小鼠模型中产生的肿瘤和相应的人类肿瘤类型的治疗靶点。

摘要

恶性周围神经鞘瘤 （MPNST） 来源于雪旺细胞或其前体。在肿瘤易感综合征 1 型神经纤维瘤病 （NF1） 患者中，MPNST 是最常见的恶性肿瘤，也是导致死亡的主要原因。这些罕见且具有侵袭性的软组织肉瘤前景广阔，5 年无病生存率为 34-60%。MPNST患者的治疗选择非常有限，其中毁容手术是最重要的治疗选择。许多曾经很有前途的疗法，如Ras信号传导抑制剂tipifarnib，在临床上都失败了。同样，靶向表皮生长因子（EFGR）的厄洛替尼和靶向血管内皮生长因子受体（VEGF）、血小板衍生生长因子受体（PDGF）和Raf的索拉非尼联合标准化疗的II期临床试验也未能在患者中产生反应。

近年来，功能基因组筛选方法与癌细胞系的遗传分析相结合，已被证明可用于识别基本的细胞质信号通路和靶点特异性疗法的开发。在罕见肿瘤类型的情况下，这种方法的一种变体被称为跨物种比较肿瘤基因组学，越来越多地被用于确定新的治疗靶点。在跨物种比较肿瘤基因组学中，在基因工程小鼠（GEM）模型中进行遗传分析和功能基因组学，然后在可用的稀有人类标本和细胞系中验证结果。

本文介绍了如何使用全外显子组测序（WES）鉴定人和小鼠MPNST细胞中的候选驱动基因突变。然后，我们描述了如何进行基因组规模的shRNA筛选，以识别和比较小鼠和人类MPNST细胞中的关键信号通路，并确定这些通路中的可成药靶点。这些方法为识别各种人类癌症类型的新治疗靶点提供了一种有效的方法。

引言

恶性周围神经鞘瘤 （MPNST） 是高度侵袭性的梭形细胞肿瘤，与肿瘤易感综合征 1 型神经纤维瘤病 （NF1） 相关，散发于普通人群和既往放疗部位^1,2,3。NF1 患者出生时具有 NF1 抑癌基因的野生型拷贝和具有功能丧失突变的第二个 NF1 等位基因。这种单倍体功能不全的状态使 NF1 患者易受其野生型 NF1 基因的第二次功能丧失突变的影响，从而触发肿瘤发生。当这种“第二次命中”NF1突变发生在雪旺细胞谱系的细胞中时，产生的肿瘤要么是皮肤中出现的真皮神经纤维瘤，要么是发生在大神经或神经丛中的丛状神经纤维瘤。虽然真皮和丛状神经纤维瘤的病理学相同，但它们的生物学行为却大不相同——虽然真皮和丛状神经纤维瘤都是良性的，但只有丛状神经纤维瘤才能发生转化并产生MPNST。除了神经纤维蛋白（由 NF1 基因编码的 Ras GTP 酶激活蛋白）的缺失外，MPNST 还携带多种其他抑癌基因的突变，包括 TP53 4,5,6,7、CDKN2A

研究方案

在研究开始之前，由机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 和机构生物安全委员会 （IBC） 审查和批准处理病毒载体的动物程序和方案。此处描述的程序已获得南卡罗来纳医科大学的 IACUC 和 IBC 董事会的批准，并由经过适当培训的人员根据 NIH 实验动物护理和使用指南和 MUSC 的机构动物护理指南执行。

1. WES-Seq分析与致病变异鉴定

1. 使用基于标准市售吸附硅胶的方法，从肿瘤样品或在 60 mm 培养皿上生长的亚汇合 （70%） MPNST 细胞中分离基因组 DNA（有关详细步骤，请参阅制造商的方案）。一般工作流程如图 1 所示。
2. 将至少 10 μL 的 50 ng/μL 基因组 DNA 提交到测序核心，除非指定了不同数量或浓度的基因组 DNA。
   1. 核心设施通过超声处理片段化基因组DNA，然后使用首选方法纯化。使用优选的外显子组测序试剂盒进行外显子组捕获和文库构建，并将索引标签添加到扩增捕获的外显子组中。
   2. 将标本提交到测序核心，进行全外显子组双端测序（WES;从两端测序 100 bp）。
   3. 核心生成的 FASTQ 文件将提供给研究者。仅使用传递质量指标进行分析的 FASTQ 文件。
3. 使用市售的软件程序（例如，DNAStar19,20，P....

讨论

本文介绍的详细方法旨在研究周围神经系统肿瘤和MPNST发病机制。尽管我们发现这些方法是有效的，但应该认识到，我们在这里描述的方法存在一些潜在的局限性。下面，我们将讨论其中的一些局限性以及在其他模型系统中克服这些局限性的潜在策略。

我们发现全外显子组测序可有效识别 P 0-GGFβ3 小鼠中感兴趣的突变。然而，应该认识到，整个外显子组测序本身也有?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioruptor Sonication System	Diagenode	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, San Diego, CA	N/A
Celigo Image Cytometer	Nexcelom	N/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve Hybrid	Decon Laboratories	5989-27-5
Corning 96-well Black Microplate	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes	Diagenode	C30010009
dNTP mix	Clontech	639210
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Elution buffer	Qiagen	19086
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Excel	Microsoft
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’			HPLC purified
GraphPad Prism	Dotmatics
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, San Diego, CA	N/A
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS Transfection Reagent	Thermo Scientific	11514015
Polybrene Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR1003G
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Qiagen Buffer P1	Qiagen	19051
Qiagen Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymerase	Clontech	639210
Trimmomatic software		www.usadellab.org