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Resumen

Hemos desarrollado un enfoque de oncogenómica comparativa entre especies que utiliza análisis genómicos y cribados genómicos funcionales para identificar y comparar dianas terapéuticas en tumores que surgen en modelos de ratón modificados genéticamente y el tipo de tumor humano correspondiente.

Resumen

Los tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos (MPNST, por sus siglas en inglés) se derivan de las células de Schwann o de sus precursores. En los pacientes con el síndrome de susceptibilidad tumoral neurofibromatosis tipo 1 (NF1), las MPNST son la neoplasia maligna más común y la principal causa de muerte. Estos sarcomas de tejidos blandos raros y agresivos ofrecen un futuro sombrío, con tasas de supervivencia libre de enfermedad a 5 años del 34-60%. Las opciones de tratamiento para las personas con MPNST son decepcionantemente limitadas, siendo la cirugía desfigurante la principal opción de tratamiento. Muchas terapias que alguna vez fueron prometedoras, como el tipifarnib, un inhibidor de la señalización de Ras, han fracasado clínicamente. Del mismo modo, los ensayos clínicos de fase II con erlotinib, que se dirige al factor de crecimiento epidérmico (EFGR), y sorafenib, que se dirige al receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), al receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y a Raf, en combinación con la quimioterapia estándar, tampoco han logrado producir una respuesta en los pacientes.

En los últimos años, los métodos de cribado genómico funcional combinados con el perfil genético de líneas celulares cancerosas han demostrado ser útiles para identificar vías esenciales de señalización citoplasmática y el desarrollo de terapias específicas para dianas. En el caso de los tipos de tumores raros, una variación de este enfoque conocida como oncogenómica comparativa entre especies se utiliza cada vez más para identificar nuevas dianas terapéuticas. En la oncogenómica comparativa entre especies, los perfiles genéticos y la genómica funcional se realizan en modelos de ratón modificados genéticamente (GEM) y los resultados se validan en las raras muestras humanas y líneas celulares disponibles.

En este artículo se describe cómo identificar mutaciones candidatas de genes impulsores en células MPNST humanas y de ratón mediante secuenciación del exoma completo (WES). A continuación, describimos cómo realizar cribados de shRNA a escala genómica para identificar y comparar vías de señalización críticas en células MPNST de ratón y humanas e identificar dianas farmacológicas en estas vías. Estas metodologías proporcionan un enfoque eficaz para identificar nuevas dianas terapéuticas en una variedad de tipos de cáncer humano.

Introducción

Los tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos (MPNST) son neoplasias de células fusiformes altamente agresivas que surgen en asociación con el síndrome de susceptibilidad tumoral neurofibromatosis tipo 1 (NF1), esporádicamente en la población general y en sitios de radioterapia previa 1,2,3. Los pacientes con NF1 nacen con una copia de tipo natural del gen supresor de tumores NF1 y un segundo alelo NF1 con una mutación de pérdida de función. Este estado de haploinsuficiencia hace que los pacientes con NF1 sean susceptibles a una segunda mutación de pérdida de función en su gen NF1 de tipo natural, lo que desencadena la tumorigénesis. Cuando esta mutación NF1 de "segundo golpe" ocurre en una célula del linaje de células de Schwann, el tumor resultante es un neurofibroma dérmico que surge en la piel o un neurofibroma plexiforme que se desarrolla en nervios grandes o plexos nerviosos. Aunque la patología de los neurofibromas dérmicos y plexiformes es idéntica, su comportamiento biológico es bastante diferente: aunque tanto los neurofibromas dérmicos como los plexiformes son benignos, solo los neurofibromas plexiformes pueden sufrir transformación y dar lugar a MPNST. Además de la pérdida de neurofibromina, la proteína activadora de la GTPasa Ras codificada por el gen NF1, los MPNST portan mutaciones de muchos otros genes supresores de tumores, incluidos TP53 4,5,6,7, CDKN2A 8,9 y PTEN 10, mutaciones de genes que codifican componentes del complejo represivo polycomb 2 11,12 (PRC2 ; el SUZ12 y EED) y expresión aberrante del receptor tirosina quinasas 1,2. Las mutaciones de NF1 y de los otros genes mencionados anteriormente también están presentes en MPNST esporádicas e inducidas por radiación11,12.

Si bien estos avances en nuestra comprensión de las anomalías genómicas en los MPNST han sido invaluables para comprender su patogénesis, aún no han dado lugar al desarrollo de nuevas terapias efectivas para los MPNST. Un obstáculo importante que impide el desarrollo de nuevos tratamientos es el hecho de que los MPNST son cánceres raros. Debido a esto, es difícil obtener la gran cantidad de muestras de pacientes que se requieren para los análisis globales que definen mutaciones impulsoras clave, como los realizados por The Cancer Genome Atlas (TCGA). En nuestra experiencia, acumular incluso un número modesto de especímenes humanos de MPNST puede llevar años. Para superar estas limitaciones, muchos investigadores que estudian otros tipos de cáncer raros han recurrido al uso de la oncogenómica comparativa entre especies para identificar mutaciones genéticas conductoras esenciales, definir las vías de señalización citoplasmática esenciales en su tumor de interés e identificar nuevas dianas terapéuticas. Dado que las vías de señalización que son esenciales para la tumorigénesis están altamente conservadas entre los seres humanos y otras especies de vertebrados, la aplicación de enfoques de genómica funcional, como las pruebas de detección de shRNA a escala genómica, puede ser un medio eficaz para identificar estas nuevas mutaciones impulsoras, vías de señalización y dianas terapéuticas 13,14,15,16,17,18,19 , especialmente cuando se estudian tipos de tumores humanos raros que están disponibles en cantidades limitadas20.

En las metodologías aquí presentadas, describimos este enfoque para realizar perfiles genómicos en líneas celulares humanas de MPNST y cultivos de MPNST de paso temprano derivados de ratones P 0-GGFβ3, un modelo de ratón modificado genéticamente (GEM) en el que la sobreexpresión específica de células de Schwann del factor de crecimiento neuregulina-1 (NRG1) promueve la patogénesis de los neurofibromas plexiformes y su posterior progresión a MPNST21, 22,23. El primer paso en este enfoque es identificar genes impulsores candidatos en MPNST P 0-GGFβ3, líneas celulares de MPNST humanas y MPNST humanas resecadas quirúrgicamente. Para validar funcionalmente las vías de señalización afectadas por estas mutaciones, utilizamos cribados de shRNA a escala genómica para identificar los genes necesarios para la proliferación y la supervivencia en líneas celulares MPNST humanas y de ratón. Después de identificar los genes necesarios para la proliferación y la supervivencia, identificamos los productos génicos farmacológicos dentro de la colección de "hits" utilizando la Base de Datos de Interacción Farmacogen-Genio. También comparamos los "hits" en células MPNST humanas y de ratón, para determinar si el modelo GEM y las MPNST humanas demuestran una dependencia similar de los mismos genes y vías de señalización. La identificación de solapamientos en los genes necesarios para la proliferación y la supervivencia y las vías de señalización afectadas sirve como medio para validar el modelo de ratón P 0-GGFβ3 a nivel molecular. Este enfoque también hace hincapié en la eficacia de la combinación de cribas humanas y de ratón para identificar nuevas dianas terapéuticas, en las que el modelo de ratón puede servir como complemento de las cribas humanas. El valor de este enfoque entre especies es particularmente evidente cuando se buscan dianas terapéuticas en tumores raros, donde los tumores humanos y las líneas celulares son difíciles de obtener.

Protocolo

Antes del inicio de los estudios, tener procedimientos y protocolos en animales para el manejo de vectores virales revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC). Los procedimientos descritos aquí fueron aprobados por las Juntas de IACUC e IBC de la Universidad Médica de Carolina del Sur y fueron realizados por personal debidamente capacitado de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y las pautas institucionales de cuidado de animales de MUSC.

1. Análisis WES-Seq e identificación de variantes patógenas

  1. Aislar el ADN genómico de una muestra tumoral o de células MPNST subconfluentes (70%) cultivadas en una placa de 60 mm, utilizando métodos estándar disponibles en el mercado basados en gel de sílice (consulte el protocolo del fabricante para conocer los pasos detallados). El flujo de trabajo general se diagrama en la Figura 1.
  2. Enviar al menos 10 μL de ADN genómico a 50 ng/μL al núcleo de secuenciación, a menos que se especifiquen diferentes cantidades o concentraciones de ADN genómico.
    1. La instalación central fragmenta el ADN genómico mediante sonicación y luego lo purifica utilizando el método preferido. La captura del exoma y la construcción de la biblioteca se realizan utilizando el kit de secuenciación del exoma preferido y las etiquetas de índice se agregan al exoma capturado amplificado.
    2. Envíe muestras al núcleo de secuenciación para que se realice la secuenciación de extremos emparejados del exoma completo (WES; 100 pb secuenciados desde cada extremo).
    3. Los archivos FASTQ generados por el núcleo se proporcionan al investigador. Utilice solo archivos FASTQ que pasen métricas de calidad para el análisis.
  3. Alinee y analice los archivos FASTQ utilizando programas de software disponibles comercialmente (por ejemplo, DNAStar19,20, Partek21 o Varsome). Alinee los archivos FASTQ con el genoma de referencia del ratón GRCm38/mm10 utilizando la configuración predeterminada.
    NOTA: Utilizando DNAStar y un espécimen MPNST de ratón como ejemplo, el flujo de trabajo general se diagrama en Figura 1 y se explica brevemente a continuación.
    1. Abra el software DNAStar y elija el flujo de trabajo SeqMan NGen.
    2. Para elegir Flujo de trabajo, seleccione Análisis de variantes/Resecuenciación y el tipo de análisis de secuenciación Amplicón basado en NGS, panel de genes o exoma. Haga clic en Siguiente.
    3. Elija la secuencia de referencia preferida seleccionando Descargar paquete de genoma y el genoma de referencia apropiado ( es decir, Mus_musculus-GRCm38-dbSNP146.zip u Homo sapiens-GRCh37.p13.zip). Si la instalación central proporcionó un archivo de cama, cargue este archivo auxiliar. Haga clic en Siguiente.
    4. Elija Secuencias de entrada seleccionando la tecnología de secuenciador adecuada, Illumina, y designe que las lecturas de secuenciación estén emparejadas. A continuación, seleccione la configuración del experimento, la muestra múltiple y cargue los archivos FASTQ de secuenciación seleccionando Agregar. Si se ejecutan varias muestras, designe cada conjunto de extremos emparejados con un experimento único o un nombre de muestra Tumor, Línea celular o A18, A202... Haga clic en Siguiente.
    5. Establezca el conjunto de datos de control , si lo hay. Haga clic en Siguiente y vuelva a hacer clic en Siguiente en Opciones de ensamblaje. En Opciones de análisis, haga clic en el modo de detección de variantes adecuado como Diploid y, a continuación, haga clic en Siguiente. En Salida de ensamblaje, asigne un nombre y designe la ubicación de almacenamiento de archivos del proyecto; haga clic en Siguiente. Ejecute el ensamblado en el equipo local o en la nube.
      NOTA: Los archivos de alineación resultantes se pueden abrir en el flujo de trabajo de ArrayStar para la anotación de variantes de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) detectados. Este flujo de trabajo detecta SNP, no las ganancias o pérdidas del número de copias de genes. Un análisis separado llamado matriz SNP de alta densidad detecta cambios en el número de copias; La secuenciación del exoma completo no detecta de forma fiable los cambios en el número de copias. Consulte la guía del usuario del programa para conocer los pasos específicos que se deben realizar con el programa de alineación.
    6. Aplique filtros definidos por el usuario a la anotación de variantes de los SNP detectados para incluir o excluir determinados datos. Para obtener una lista condensada de variantes probablemente relevantes desde el punto de vista funcional, aplique los siguientes filtros a los conjuntos de datos de variantes de esta jerarquía: no en control (si se dispone de una muestra de control normal), frecuencia poblacional (gnomAD, ExAC, frecuencias de 1.000 genomas), frecuencia alélica (incluye ≤0,001 o 0,1%), profundidad de cobertura (excluye <10 de profundidad ), patogenicidad o clase ClinVar (incluye: patógeno, probablemente patógeno; excluya: incierto, probablemente benigno, benigno) y, si se desea, tipo de SNP e impacto de codificación (incluya: no sinónimo, sin sentido, sin sentido, desplazamiento de marco, en el marco, empalme).
      NOTA: También se puede aplicar una lista de genes cancerosos relevantes conocidos a la lista final para extraer solo genes específicos relevantes para la enfermedad, consulte el paso 1.3.7. Estos filtros pueden reducir la lista de variantes genéticas a menos de 20 genes.
      1. Utilice la frecuencia alélica de la variante para filtrar los SNP de error de secuenciación. Las variantes homocigóticas y heterocigóticas estarán representadas aproximadamente al 100% y al 50%, respectivamente, para una población celular pura no contaminante (una línea celular derivada de tumores establecida debe representar una sola población de células tumorales isogénicas). En este caso, aplique frecuencias alélicas del 100-90% y del 50-40% para las variantes como filtro, eliminando así cualquier variante por debajo de eso. Si también se dispone de datos de matrices de SNP de alta densidad para el mismo conjunto de datos, aplique la ganancia o pérdida del número de copias a los SNP con frecuencias alélicas variantes inferiores a las proporciones homocigóticas o heterocigóticas (es decir, la ganancia del número de copias que da como resultado 2 copias del alelo A y 1 copia del alelo B haría que las frecuencias alélicas variantes apropiadas sean del 75%, 25%, respectivamente).
    7. Después de identificar las variantes patógenas con ArrayStar, exporte y guarde la lista de genes variantes como un archivo csv, txt o xls y compare los genes que contienen estas mutaciones con los de la cohorte de tumores generados por P 0-GGFβ3 para determinar listas de genes mutados únicos y superpuestos. Compare los genes mutados con los genes mutados conocidos asociados con sus homólogos humanos (es decir, la lista de genes de cáncer de laboratorio de bosquimano o una lista seleccionada por el usuario).
      1. Opcionalmente, antes de aplicar cualquier filtro definido por el usuario (1.3.6), exporte y guarde el archivo anotado como un archivo VCF.
        NOTA: Este archivo VCF se puede cargar en otro software predictor efector de variantes Varsome o VEP para compararlo como análisis secundario. También se puede realizar un análisis biológico y de vías en las listas de genes variantes filtradas.
    8. Realice la clasificación funcional de la lista de genes variantes a través de una base de datos preferida por el usuario para obtener información sobre la clase de proteína, la vía, el componente de la vía y la familia de genes y la ontología.
      NOTA: PANTHER (pantherdp.org) se utiliza como ejemplo aquí.
      1. Cargue una lista de genes filtrada con ID de gen.
      2. Seleccione el organismo (Mus musculus).
      3. Seleccione análisis (clasificación funcional vista en la lista de genes) y haga clic en enviar análisis biológico y de vías en listas de genes variantes filtradas.

2. Cribado de shRNA a escala genómica

NOTA: Hay varias bibliotecas de shRNA y CRISPR disponibles que se pueden utilizar para cribados funcionales a escala genómica con cultivos tumorales de paso bajo. Aquí, describimos el uso de las bibliotecas de shRNA de CELLECTA DECIPHER como ejemplo. Las bibliotecas lentivirales de shRNA CELLECTA DECIPHER están optimizadas para cribados genéticos de ARNi en formato combinado. Cada transcripción está dirigida por al menos 5-6 shRNAs únicos y cada vector lentiviral de shRNA contiene un código de barras genético único flanqueado por sitios de cebadores de PCR. Estas bibliotecas cubren la mayoría de los genes relevantes para enfermedades humanas y de ratones, pero no cubren todos los genes del genoma. Los grupos de ADN plasmídico de la biblioteca humana Cellecta están disponibles en tres módulos (Módulo humano I, II, III; se dirige a 15.377 genes), mientras que los grupos de plásmidos de la biblioteca de ratones están disponibles en dos módulos (Módulos de ratón I y II; se dirige a 9.145 genes). Estas bibliotecas se utilizan para realizar ensayos de "abandono" en los que los genes específicos que son necesarios para la proliferación y/o la supervivencia se expresan diferencialmente en diferentes puntos de tiempo después de la transducción viral.

  1. Empaque lentiviral
    1. Día 0: Plato 10 platos de 10 millones de células 293T/plato de 15 cm en DMEM libre de antibióticos de 30 mL/plato que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS).
    2. Día 1: Confirme que las células son ~80% confluentes al día siguiente y están listas para transfectar. En un tubo cónico de 50 ml, mezcle lo siguiente en este orden: 600 μl de mezcla de plásmidos de embalaje (0,5 μg/μl), 60 μl de biblioteca de códigos de barras de plásmidos, 12 ml de DMEM (sin suero ni antibióticos) y 600 μl de reactivo de transfección. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
    3. Coloque 900 μL de reactivo de transfección y 12 mL de DMEM en un tubo cónico separado de 15 mL y mezcle por vórtice. Agregue 12,9 ml de la mezcla de reactivo de transfección/DMEM a la mezcla de ADN y mezcle para mezclar. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos sin mezclar más. Agregue 2,5 ml de esta mezcla, gota a gota, a cada placa de 15 cm de células 293T e incube durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos.
    4. Día 2: Reemplace los medios al día siguiente con medios de crecimiento regulares que contengan antibióticos.
    5. Día 3: Recolectar el virus recogiendo el medio y pasándolo a través de una unidad de filtración de 0,2 μm y alícuota en tubos cónicos de 15 ml; también preparar cinco alícuotas de 1 mL de virus filtrado en crioviales para su uso en títulos virales (considerado virus de 48 h); almacenar el virus en un congelador a -80 °C. Reemplace los medios con 30 ml de medios de crecimiento en las placas una a la vez para evitar que las células se sequen.
    6. Día 4: Coseche el virus recogiendo el medio y pasándolo por una unidad de filtración de 0,2 μm. Alícuota en tubos cónicos de 15 mL. Esto se considera virus de 72 h; almacenar el virus en un congelador a -80 °C.
  2. Grupos lentivirales de titulación
    1. Agregue 65 μl de polímero catiónico (10 mg/ml) a 65 ml de medio de crecimiento de células tumorales. Pipetear 1 mL/pocillo del medio que contiene polímero en once placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Tripsinar las células tumorales de paso temprano y contar las células utilizando el método preferido para que cada pocillo reciba 50.000 células/ml/pocillo. Descongelar 1 mL de alícuotas de lentivirus de 48 h del congelador en un baño de agua a 37 °C.
    2. Para cada módulo viral, prepare la infección como se muestra en la Tabla 1.
    3. Coloque todas las placas de 6 pocillos en una incubadora de cultivo de tejidos. Al día siguiente, retire los medios virales y rellenelos con medios de cultivo nuevos. A las 48 h, agregue medios que contengan puromicina a todos los pocillos que reciban la selección. Antes de que las células de control confluyan, realice recuentos celulares de los clones supervivientes utilizando el método preferido.
      NOTA: La concentración de puromicina requerida para matar las células no transducidas debe estar predeterminada empíricamente mediante la prueba de un rango de concentraciones en una curva de "muerte". Utilice la concentración más baja que induzca uniformemente la muerte de los cultivos no transducidos.
  3. Infección lentiviral de células diana
    1. Tripsinizar las células MPNST y contarlas. Coloque 2,5 millones de células por plato de 15 cm para un total de veinte platos de 15 cm por módulo. Descongelar el virus y transducir las células con el virus a un MOI de 0,5 en presencia de 5 μg/mL de polímero catiónico (Figura 2A).
    2. Retire los medios que contengan virus a la mañana siguiente y reemplácelos con medios de cultivo nuevos. Cultivar células durante 2 días adicionales para permitir la expresión del marcador de selección y luego agregar puromicina a los cultivos para eliminar las células no transducidas.
    3. Tres días después de la adición de puromicina, tripsinar las células y centrifugar la mitad de la población celular a 200 × g durante 5 min en una centrífuga de mesa. Almacene las células peletizadas en el congelador a -80 °C para su futura preparación de ADN genómico; este es el punto de tiempo de referencia, o punto de tiempo 1 (T1).
    4. Vuelva a colocar la otra mitad de la población celular y crezca durante aproximadamente 7 duplicaciones de población antes de cosechar y centrifugar como se indicó anteriormente. Este gránulo celular servirá como punto de tiempo final (punto de tiempo 2, T2) y se almacena a -80 °C para el futuro aislamiento del ADN genómico (Figura 2).
  4. Aislamiento de ADN genómico de células transducidas con grupos de virus
    1. Descongele el gránulo celular del congelador a -80 °C y vuelva a suspender el gránulo en 10 ml de tampón de resuspensión con ARNasa añadida, y divida inmediatamente en dos tubos de polimetilpenteno de 15 ml (Figura 2B).
    2. Agregue 500 μL de SDS al 10% por 5 ml, mezcle e incube a temperatura ambiente durante 5 min. A continuación, coloque los tubos en un dispositivo de cizallamiento de ADN para sonicar el ADN durante 25 ciclos de 30 s encendido/30 s apagado, asegurándose de mantener la temperatura a 4 °C.
    3. Añadir 5 mL de fenol/cloroformo, pH 8,0 (almacenado a 4 °C), asegurándose de mezclar bien el fenol/cloroformo antes de su uso. Después de la adición de fenol/cloroformo, mezcle bien mediante vórtice vigorosamente en el ajuste máximo durante 45-60 s. Centrifugar durante 60 min, -20 °C a 7.200 × g.
      NOTA: Una apariencia espumosa/lechosa después del vórtice indicará una resuspensión completa.
    4. Transfiera 3 mL de la fase superior transparente a un tubo nuevo de 15 mL y agregue 0.5 mL de acetato de sodio 3 M y 4 mL de isopropanol y mezcle bien (Figura 2C). Centrifugar durante 30 min a 20 °C a 7.200 × g.
    5. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y luego pipetee con cuidado el líquido restante. Agregue 0,5 ml de etanol al 70% y desaloje el gránulo pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera el gránulo resuspendido a un tubo de centrífuga de 1,5 ml y combine ambos gránulos de la misma muestra en un solo tubo de centrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a máxima velocidad en una centrífuga de sobremesa durante 5 min.
    6. Deseche el sobrenadante y use una toallita de laboratorio para absorber cualquier residuo de etanol al 70%. Vuelva a suspender el gránulo en 0,5 ml de agua destilada, asegurándose de no dejar que el gránulo se seque, ya que esto dificultará la resuspensión. Almacenar las muestras a 4 °C antes de medir la concentración de ADN.
  5. PCR anidada para amplificar códigos de barras de shRNA
    NOTA: Recupere el ADN del almacenamiento y colóquelo en hielo. Si la concentración de ADN es inferior a 100 ng/μL, seque rápidamente el ADN al vacío y vuelva a suspenderlo en un volumen adecuado de agua destilada. Se recomienda procesar solo un módulo a la vez (punto de tiempo 1 (T1) o punto de tiempo 2 (T2)). Realice dos preparaciones de cada punto de tiempo que se agruparán al final; Por lo tanto, es importante no procesar puntos de tiempo replicados en el mismo día. El siguiente protocolo es para un punto de tiempo del ADN genómico.
    1. Coloque 7 tubos y etiquételos como se describe: control negativo, control positivo, 4 tubos para el ADN genómico y uno para una mezcla maestra (Figura 3A). El control negativo es agua destilada; el control positivo es el ADN plasmídico utilizado en la transfección 293T para generar lentivirus.
    2. Agregue agua a cada tubo primero como se indica en la Tabla 2.
    3. Prepare una mezcla maestra (MM) como se muestra en la Tabla 3.
    4. Añadir 18 μL de MM a cada tubo que contenga agua. A continuación, agregue 25 μL de ADN genómico a cada uno de los 4 tubos plantilla. A continuación, agregue 1 μL de control positivo (10 ng/μL) al tubo de control positivo, teniendo cuidado de no contaminar otros tubos con ADN de control positivo. Por último, agregue 2 μL de polimerasa a cada tubo, agregando primero a los 4 tubos de muestra y al final el tubo de control positivo; mezclar y centrifugar los tubos de PCR (Figura 3).
    5. Realizar la reacción de PCR en las condiciones indicadas en la Tabla 4.
    6. Mientras se realiza la primera PCR, prepare los tubos para la2.ª PCR como se indica en la Tabla 5. Instale siete tubos: control negativo, control positivo, 4 tubos para el ADN genómico y uno para MM (Figura 3B).
    7. Añadir 22 μL de MM a cada tubo que contenga agua y esperar a que finalice la primera ronda de PCR antes de añadir el ADN y la polimerasa.
      1. Una vez completada la primera ronda de PCR, combine 4 tubos de muestra en un tubo de microcentrífuga y mezcle.
      2. Añadir 25 μL a cada tubo de muestra que contenga agua.
      3. A continuación, agregue 2 μL del primer control negativo de PCR y 2 μL del primer control positivo de PCR a los tubos debidamente etiquetados.
      4. Agregue 2 μL de polimerasa a cada tubo, agregando primero a los 4 tubos de muestra y al final el control negativo.
    8. Realice la reacción de PCR como se indica en la Tabla 6.
      NOTA: Al analizar los resultados de la primera reacción de PCR por electroforesis en un gel de agarosa al 3,5%, si se obtiene una abundancia de producto, el número de ciclos puede reducirse a 9-10 para la siguiente repetición de este procedimiento; Del mismo modo, si el rendimiento del producto es bajo, los ciclos se pueden aumentar a 14.
    9. Cuando se complete la segunda reacción de PCR, combine 4 muestras en un tubo de microcentrífuga más 80 μL de colorante de carga 6x. Para controles positivos y negativos, utilizar 20 μL de la muestra.
      1. Prepare un gel de agarosa al 3,5% en tampón Tris-Borato-EDTA (TBE) (Figura 4A). Para acomodar el gran volumen de muestra, cree un pocillo grande en el peine de gel pegando con cinta adhesiva varios pocillos (si no se dispone de un peine que se ajuste al volumen), asegurándose de dejar dos pocillos disponibles para los controles positivos y negativos. Deje correr el gel a 90 V durante 1 h.
    10. Visualice el gel y confirme una banda en aproximadamente 250 pares de bases (pb).
  6. Primera purificación: extracción en gel
    1. Con un bisturí limpio o una hoja de afeitar, extirpe la banda de 250 pb, cortando la mayor cantidad de gel posible. Divida la banda grande en 4 piezas y transfiera cada pieza a un tubo de microcentrífuga limpio. Mida y registre el peso de cada rebanada de gel.
      NOTA: Cada pieza debe ser de aproximadamente 200 mg o menos por tubo.
    2. Agregue 6 volúmenes de tampón de solubilización (por ejemplo, si la pieza de gel pesa 200 mg, agregue 1,2 ml de tampón). Coloque los tubos en un baño de agua a 50 °C y gírelos cada 10-15 minutos hasta que se disuelvan las rodajas de gel. Luego, agregue 1 volumen de isopropanol a cada tubo (p. ej., 0.2 ml de isopropanol si la pieza de gel pesa 200 mg).
    3. Usando dos columnas de centrifugado para la purificación, cargue las muestras de los 4 tubos en las columnas. Realice múltiples centrifugaciones para procesar todo el volumen de la muestra, ya que las columnas solo contienen 750 μL. Gire las columnas a 17.900 × g durante 1 minuto en una microcentrífuga de sobremesa convencional y deseche el flujo cada vez.
    4. Lavar las columnas con 750 μL de tampón de lavado y centrifugar a 17.900 × g durante 1 min. Después del lavado, deseche el flujo y seque la columna de centrifugación centrifugando a 17.900 × g durante 3 min. Eluir el ADN con 50 μL de agua destilada por columna y centrifugar como antes durante 1 min y combinar ambos tubos para obtener un volumen total de 100 μL de la muestra.
  7. Segunda purificación
    1. En el siguiente paso de purificación se utilizará el tampón de unión 2 (del kit de purificación de PCR), que no elimina los fragmentos pequeños. Agregue 400 μL de tampón a los 100 μL de ADN y cárguelo en una columna de centrifugado (Figura 4B). Centrifugar la muestra a 17.900 × g durante 1 min.
    2. A continuación, lavar la membrana con 650 μL de tampón de lavado y centrifugar como se ha hecho anteriormente. Seque la columna de centrifugación con centrifugación adicional como se indicó anteriormente durante 3 minutos.
    3. Eluir el ADN con 30 μL de agua destilada y centrifugar a velocidad máxima durante 1 min. Después de la elución, verifique la concentración en un espectrofotómetro; asegúrese de que la concentración no sea inferior a 10 ng/μL ni superior a 70-80 ng/μL. Almacene el ADN en un congelador a -20 °C.
  8. Secuenciación de códigos de barras amplificados
    1. Para la secuenciación, diluya los códigos de barras purificados a 0,75 ng/μL utilizando tampón de elución (EB). Para agregar diversidad de secuencias, los amplicones se agrupan a 17 pM, incluido el 30% (v/v) de PhiX. Realice la agrupación en clústeres de un solo extremo (SE) en un sistema automatizado de generación de clústeres de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    2. Haga que el núcleo de secuenciación realice un total de 36 ciclos de secuenciación de un solo extremo en un secuenciador NextGen (Figura 4C). Añada la imprimación personalizada GexSeqS a los cebadores de secuenciación Illumina a 0,5 μM.
    3. Utilice el software de análisis al que se hace referencia para generar archivos Fastq y procesarlos utilizando un software para recortar las longitudes de lectura a 18 nucleótidos.
    4. Utilice el software Barcode Analyzer y Deconvoluter para deconvolucar las lecturas recortadas. Calcule las puntuaciones de agotamiento de pliegues para cada shRNA como la relación entre los recuentos de lectura en el punto de tiempo de referencia (T1) y el punto de tiempo final (T2).
  9. Análisis de los resultados del cribado de shRNA e identificación de dianas terapéuticas candidatas
    NOTA: En la biblioteca de shRNA de Cellecta, la mayoría de los genes son atacados por 5 (67%) o 6 shRNAs diferentes (32%). Sin embargo, varios genes de limpieza, que deberían ser golpeados en la mayoría de las células, son el objetivo de un gran número de shRNAs y sirven como controles que definen el rango de puntuaciones de los negativos.
    1. Para evitar el sesgo hacia los genes a los que se dirige un mayor número de shRNAs, transforme logarítmicamente las puntuaciones de agotamiento. Realice una estimación cuantílica calculando el percentil 80 para cada gen a partir de su distribución empírica.
    2. Para generar una distribución nula de las puntuaciones de agotamiento del pliegue logarítmico, supongamos que el >95% de los genes no se agotarán y que sus puntuaciones de cuantiles logarítmicos tendrán una distribución normal. Utilice la mediana de la distribución empírica para estimar la media de la distribución nula. Usando esta distribución nula, clasifique todos los genes con puntuaciones de agotamiento log-fold que sean mayores que el percentil 95 de la distribución nula como 'hits'.
      NOTA: Todos los resultados deben tener al menos dos shRNAs con puntuaciones de agotamiento por encima del punto de corte (Figura 5).
    3. Para evaluar la calidad de los datos del cribado de abandono de ARNi y la validez del punto de corte, utilice un conjunto de genes que han sido definidos como "esenciales básicos" por la iniciativa de cribado de ARNidel cáncer de COLT 24,25 para la comparación. Elimine los CEG de la lista de resultados para producir la lista inicial de posibles dianas terapéuticas.
      NOTA: Los genes del conjunto de COLT obtuvieron resultados positivos en el >50 % de las 72 líneas celulares cancerosas que fueron examinadas por COLT. La lista de genes esenciales contiene 640 genes.
    4. Para identificar posibles dianas terapéuticas que son requeridas común o uniformemente por múltiples líneas celulares de MPNST, construya diagramas de Venn de los resultados no CEG identificados en cribados de diferentes líneas celulares de MPNST o cultivos de paso temprano (Figura 6A). Priorice las visitas que no sean CEG que sean necesarias en todas o en la mayoría de las líneas o referencias culturales de MPNST.
      1. Alternativamente, realice análisis de vías en la lista de objetivos no CEG de cada línea celular o cultivo de paso temprano para identificar genes cuyos productos codifican componentes de vías de señalización que son necesarios para la proliferación y/o supervivencia de las células tumorales. A continuación, compare las vías de señalización que se identifican en el análisis de vías de los no CEG con las vías de señalización que se identificaron como afectadas por las mutaciones identificadas con WES.
        NOTA: Nos parece particularmente útil identificar las vías de señalización que se ven afectadas de manera consistente por las mutaciones identificadas en WES y compararlas con las vías de señalización identificadas como críticas en las pruebas de detección de shRNA.
    5. Para identificar dianas farmacológicas para las que ya se dispone de agentes terapéuticos, se examina la lista de resultados positivos que quedan tras la eliminación de los genes esenciales principales utilizando la Base de Datos de Interacción Farmacogen-Genes (dgidb.org).
      NOTA: Esta base de datos permite ingresar y examinar simultáneamente una lista de genes y proporciona orientación sobre los medicamentos que están disponibles actualmente para atacar estos genes.
    6. Valide primero las dianas de alto interés identificables para medicamentos reduciendo su expresión génica con shRNAs distintos de los utilizados en la pantalla inicial de la biblioteca en un formato de lote único (no un formato de lote de biblioteca que se acaba de describir). Para reducir la expresión génica, utilice dos o tres shRNAs lentivirales distintos. De tres a cuatro días después de la infección, determine el efecto que esto tiene sobre la proliferación y supervivencia de las células tumorales como se describe a continuación.

3. Realizar ensayos de citómetro del número de células y la viabilidad en células MPNST desafiadas con agentes terapéuticos candidatos

  1. Cultive células MPNST en DMEM hasta un 80 % de confluencia. Enjuague las celdas con la solución salina balanceada de Hanks (HBSS) a temperatura ambiente.
    NOTA: No cultive células hasta la confluencia, ya que el crecimiento de estas células se retrasará durante un tiempo después de la resiembra.
  2. Separe las células del sustrato cubriendo las células durante 30 s a 1 min con una solución de disociación celular no enzimática. Agregue 5 ml de DMEM por 1 ml de la solución de disociación y pipetee suavemente las células hacia arriba y hacia abajo para que se desprendan del sustrato.
  3. Cuente las células con un hemocitómetro. Celdas de placa a una densidad de 1.200 celdas por pocillo en placas de 96 pocillos de paredes negras; Coloque al menos tres pocillos para cada dilución de fármaco que se probará y realice tres réplicas biológicas de estos experimentos.
  4. Para determinar las concentraciones iniciales del fármaco que se probará, se debe revisar la bibliografía para evaluar qué concentraciones han sido eficaces contra otros tipos de células cancerosas. En los experimentos iniciales, pruebe un rango de dos órdenes de magnitud por encima y dos órdenes de magnitud por debajo de la concentración del fármaco utilizado con otros tipos de cáncer.
  5. Prepare diluciones del fármaco que se va a analizar y agregue cada dilución o vehículo a por lo menos tres pocillos de réplica.
  6. Evalúe el número directo de células 1, 3, 5 y 7 días después de la adición de fármacos. Añadir Hoechst 33342 hasta una concentración final de 5 μg/ml e incubar las placas durante 30 min a 37 °C. Lea placas en un citómetro de imágenes de alto rendimiento utilizando la opción de recuento directo de células para el número total de células con tiempos de exposición de 100.000 ms.
  7. Analice las lecturas con el software y expórtelas a una hoja de cálculo y utilice el software adecuado para los análisis estadísticos.
  8. Si se observan reducciones estadísticamente significativas en el número de células en los pocillos tratados con medicamentos, realice un ensayo de "Vivo/Muerto" para determinar si esta reducción se debe, en parte, a la inducción de la muerte celular.
    1. Celdas de placa en placas de 96 pocillos de paredes negras, como se describe en el paso 3.3.
    2. Prepare y agregue los medicamentos como se describe en el paso 3.5.
    3. Evaluar la viabilidad y muerte celular 1, 3, 5 y 7 días después de la adición del fármaco. Añadir calceína AM a una concentración final de 1 μM y yoduro de propidio a una concentración final de 1 μM en cada pocillo. Incubar las células durante 15 min a 37 °C.
    4. Tome imágenes de células en un citómetro de imágenes utilizando la opción de software Live+Dead . Analice las lecturas con el software y expórtelas a una hoja de cálculo y utilice el software adecuado para los análisis estadísticos.

Resultados

Los gráficos de la Figura 5 muestran puntuaciones de agotamiento de genes esenciales centrales (CEG) etiquetados como TRUE en comparación con los no CEG (etiquetados como FALSE) en cada línea celular humana que se examinó. Los puntos representan log2 de las puntuaciones de agotamiento de pliegues para genes individuales, que se representan en una representación de diagrama de caja de la distribución general de la puntuación. Se utilizó la prueba t de Student para comprobar u...

Discusión

Los métodos detallados que se presentan aquí se desarrollaron para estudiar la neoplasia del sistema nervioso periférico y la patogénesis de MPNST. Aunque hemos encontrado que estos métodos son efectivos, debe reconocerse que existen algunas limitaciones potenciales para los métodos que describimos aquí. A continuación, discutimos algunas de esas limitaciones y las posibles estrategias para superarlas en otros sistemas modelo.

Hemos encontrado que la secuenciación del exoma completo i...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por subvenciones del Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares (R01 NS048353 y R01 NS109655 a S.L.C.; R01 NS109655-03S1 a D.P.J.), el Instituto Nacional del Cáncer (R01 CA122804 a S.L.C.) y el Departamento de Defensa (X81XWH-09-1-0086 y W81XWH-12-1-0164 a S.L.C.).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Bioruptor Sonication SystemDiagenode UCD-600
CASAVA 1.8.2
CbotIllumina, San Diego, CAN/A
Celigo Image CytometerNexcelomN/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve HybridDecon Laboratories5989-27-5
Corning 96-well Black MicroplateMillipore SigmaCLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubesDiagenode C30010009
dNTP mixClontech639210
Eosin YThermo Scientific7111
Elution bufferQiagen 19086
Ethanol (200 Proof)Decon Laboratories2716
Excel Microsoft 
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’HPLC purified
GraphPad PrismDotmatics
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
Illumina HiScanSQIllumina, San Diego, CAN/A
Paraformaldehyde (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
PLUS Transfection ReagentThermo Scientific11514015
Polybrene Transfection ReagentMillipore SigmaTR1003G
PureLink Quick PCR Purification KitInvitrogenK310001
Qiagen Buffer P1Qiagen 19051
Qiagen Gel Extraction KitQiagen28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymeraseClontech639210
Trimmomatic softwarewww.usadellab.org

Referencias

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