Perfiles genéticos y cribado de abandono a escala genómica para identificar dianas terapéuticas en modelos murinos de tumor maligno de la vaina de los nervios periféricos

Resumen

Hemos desarrollado un enfoque de oncogenómica comparativa entre especies que utiliza análisis genómicos y cribados genómicos funcionales para identificar y comparar dianas terapéuticas en tumores que surgen en modelos de ratón modificados genéticamente y el tipo de tumor humano correspondiente.

Resumen

Los tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos (MPNST, por sus siglas en inglés) se derivan de las células de Schwann o de sus precursores. En los pacientes con el síndrome de susceptibilidad tumoral neurofibromatosis tipo 1 (NF1), las MPNST son la neoplasia maligna más común y la principal causa de muerte. Estos sarcomas de tejidos blandos raros y agresivos ofrecen un futuro sombrío, con tasas de supervivencia libre de enfermedad a 5 años del 34-60%. Las opciones de tratamiento para las personas con MPNST son decepcionantemente limitadas, siendo la cirugía desfigurante la principal opción de tratamiento. Muchas terapias que alguna vez fueron prometedoras, como el tipifarnib, un inhibidor de la señalización de Ras, han fracasado clínicamente. Del mismo modo, los ensayos clínicos de fase II con erlotinib, que se dirige al factor de crecimiento epidérmico (EFGR), y sorafenib, que se dirige al receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), al receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y a Raf, en combinación con la quimioterapia estándar, tampoco han logrado producir una respuesta en los pacientes.

En los últimos años, los métodos de cribado genómico funcional combinados con el perfil genético de líneas celulares cancerosas han demostrado ser útiles para identificar vías esenciales de señalización citoplasmática y el desarrollo de terapias específicas para dianas. En el caso de los tipos de tumores raros, una variación de este enfoque conocida como oncogenómica comparativa entre especies se utiliza cada vez más para identificar nuevas dianas terapéuticas. En la oncogenómica comparativa entre especies, los perfiles genéticos y la genómica funcional se realizan en modelos de ratón modificados genéticamente (GEM) y los resultados se validan en las raras muestras humanas y líneas celulares disponibles.

En este artículo se describe cómo identificar mutaciones candidatas de genes impulsores en células MPNST humanas y de ratón mediante secuenciación del exoma completo (WES). A continuación, describimos cómo realizar cribados de shRNA a escala genómica para identificar y comparar vías de señalización críticas en células MPNST de ratón y humanas e identificar dianas farmacológicas en estas vías. Estas metodologías proporcionan un enfoque eficaz para identificar nuevas dianas terapéuticas en una variedad de tipos de cáncer humano.

Introducción

Los tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos (MPNST) son neoplasias de células fusiformes altamente agresivas que surgen en asociación con el síndrome de susceptibilidad tumoral neurofibromatosis tipo 1 (NF1), esporádicamente en la población general y en sitios de radioterapia previa ^1,2,3. Los pacientes con NF1 nacen con una copia de tipo natural del gen supresor de tumores NF1 y un segundo alelo NF1 con una mutación de pérdida de función. Este estado de haploinsuficiencia hace que los pacientes con NF1 sean susceptibles a una segunda mutació....

Protocolo

Antes del inicio de los estudios, tener procedimientos y protocolos en animales para el manejo de vectores virales revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC). Los procedimientos descritos aquí fueron aprobados por las Juntas de IACUC e IBC de la Universidad Médica de Carolina del Sur y fueron realizados por personal debidamente capacitado de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y las pautas institucionales de cuidado de animales de MUSC.

1. Análisis WES-Seq e identificación de variantes patógenas

Resultados

Los gráficos de la Figura 5 muestran puntuaciones de agotamiento de genes esenciales centrales (CEG) etiquetados como TRUE en comparación con los no CEG (etiquetados como FALSE) en cada línea celular humana que se examinó. Los puntos representan log2 de las puntuaciones de agotamiento de pliegues para genes individuales, que se representan en una representación de diagrama de caja de la distribución general de la puntuación. Se utilizó la prueba t de Student para comprobar u.......

Discusión

Los métodos detallados que se presentan aquí se desarrollaron para estudiar la neoplasia del sistema nervioso periférico y la patogénesis de MPNST. Aunque hemos encontrado que estos métodos son efectivos, debe reconocerse que existen algunas limitaciones potenciales para los métodos que describimos aquí. A continuación, discutimos algunas de esas limitaciones y las posibles estrategias para superarlas en otros sistemas modelo.

Hemos encontrado que la secuenciación del exoma completo i.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioruptor Sonication System	Diagenode	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, San Diego, CA	N/A
Celigo Image Cytometer	Nexcelom	N/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve Hybrid	Decon Laboratories	5989-27-5
Corning 96-well Black Microplate	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes	Diagenode	C30010009
dNTP mix	Clontech	639210
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Elution buffer	Qiagen	19086
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Excel	Microsoft
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’			HPLC purified
GraphPad Prism	Dotmatics
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, San Diego, CA	N/A
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS Transfection Reagent	Thermo Scientific	11514015
Polybrene Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR1003G
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Qiagen Buffer P1	Qiagen	19051
Qiagen Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymerase	Clontech	639210
Trimmomatic software		www.usadellab.org