Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümörünün Fare Modellerinde Terapötik Hedefleri Belirlemek için Genetik Profilleme ve Genom Ölçeğinde Bırakma Taraması

Özet

Genetiği değiştirilmiş fare modellerinde ortaya çıkan tümörlerde terapötik hedefleri ve karşılık gelen insan tümör tipini belirlemek ve karşılaştırmak için genomik analizler ve fonksiyonel genomik ekranlar kullanan türler arası karşılaştırmalı bir onkogenomik yaklaşım geliştirdik.

Özet

Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümörleri (MPNST'ler) Schwann hücrelerinden veya öncüllerinden türetilir. Tümör yatkınlık sendromu nörofibromatozis tip 1 (NF1) olan hastalarda, MPNST'ler en sık görülen malignite ve önde gelen ölüm nedenidir. Bu nadir ve agresif yumuşak doku sarkomları, 5 yıllık hastalıksız sağkalım oranlarının %34-60 olduğu keskin bir gelecek sunmaktadır. MPNST'li bireyler için tedavi seçenekleri hayal kırıklığı yaratacak şekilde sınırlıdır ve şekil bozucu cerrahi en önde gelen tedavi seçeneğidir. Ras sinyalinin bir inhibitörü olan tipifarnib gibi bir zamanlar umut vaat eden birçok tedavi klinik olarak başarısız olmuştur. Benzer şekilde, epidermal büyüme faktörünü (EFGR) hedefleyen erlotinib ve vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörünü (VEGF), trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörünü (PDGF) ve Raf'ı hedefleyen sorafenib ile yapılan faz II klinik çalışmalar da standart kemoterapi ile kombinasyon halinde hastalarda yanıt üretememiştir.

Son yıllarda, kanser hücre hatlarının genetik profillemesi ile birleştirilen fonksiyonel genomik tarama yöntemlerinin, temel sitoplazmik sinyal yolaklarının tanımlanması ve hedefe özgü tedavilerin geliştirilmesi için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Nadir tümör tipleri söz konusu olduğunda, türler arası karşılaştırmalı onkogenomik olarak bilinen bu yaklaşımın bir varyasyonu, yeni terapötik hedefleri belirlemek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Türler arası karşılaştırmalı onkogenomikte, genetik olarak tasarlanmış fare (GEM) modellerinde genetik profilleme ve fonksiyonel genomik gerçekleştirilir ve sonuçlar daha sonra mevcut olan nadir insan örneklerinde ve hücre hatlarında doğrulanır.

Bu makale, tüm ekzom dizileme (WES) kullanılarak insan ve fare MPNST hücrelerinde aday sürücü gen mutasyonlarının nasıl tanımlanacağını açıklamaktadır. Daha sonra, fare ve insan MPNST hücrelerindeki kritik sinyal yollarını tanımlamak ve karşılaştırmak ve bu yollardaki ilaçlanabilir hedefleri belirlemek için genom ölçeğinde shRNA taramalarının nasıl gerçekleştirileceğini açıklıyoruz. Bu metodolojiler, çeşitli insan kanseri türlerinde yeni terapötik hedeflerin belirlenmesinde etkili bir yaklaşım sağlar.

Giriş

Malign periferik sinir kılıfı tümörleri (MPNST'ler), tümör yatkınlık sendromu nörofibromatozis tip 1 (NF1) ile birlikte, sporadik olarak genel popülasyonda ve önceki radyoterapi bölgelerinde^ortaya çıkan oldukça agresif iğsi hücreli neoplazmlardır ^1,2,3. NF1 hastaları, NF1 tümör baskılayıcı geninin vahşi tip bir kopyası ve fonksiyon kaybı mutasyonu olan ikinci bir NF1 aleli ile doğarlar. Bu haplo yetmezliği durumu, NF1 hastalarını, tümör oluşumunu tetikleyen vahşi tip NF1 genlerinde ikinci bir fonksiyon kaybı mutasyonuna duyarlı hale getirir. Bu "iki....

Protokol

Çalışmalara başlamadan önce, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) tarafından gözden geçirilen ve onaylanan viral vektörlerin işlenmesine yönelik hayvan prosedürlerini ve protokollerini yaptırın. Burada açıklanan prosedürler, Güney Carolina Tıp Üniversitesi'nin IACUC ve IBC Kurulları tarafından onaylanmıştır ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ve MUSC'nin kurumsal hayvan bakımı yönergelerine uygun olarak uygun şekilde eğitilmiş personel tarafından gerçekleştirilmiştir.

1. WES-Seq Analizleri ve Patojenik Varyantların Tanımlanması

1. Piyasad....

Tartışmalar

Burada sunulan ayrıntılı yöntemler periferik sinir sistemi neoplazisi ve MPNST patogenezini incelemek için geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin etkili olduğunu bulmuş olsak da, burada tanımladığımız yöntemlerin bazı potansiyel sınırlamaları olduğu kabul edilmelidir. Aşağıda, bu sınırlamalardan bazılarını ve diğer model sistemlerde bunların üstesinden gelmek için potansiyel stratejileri tartışıyoruz.

Tüm ekzom diziliminin, P 0-GGFβ3 farelerinde ilgilenilen_.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioruptor Sonication System	Diagenode	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, San Diego, CA	N/A
Celigo Image Cytometer	Nexcelom	N/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve Hybrid	Decon Laboratories	5989-27-5
Corning 96-well Black Microplate	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes	Diagenode	C30010009
dNTP mix	Clontech	639210
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Elution buffer	Qiagen	19086
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Excel	Microsoft
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’			HPLC purified
GraphPad Prism	Dotmatics
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, San Diego, CA	N/A
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS Transfection Reagent	Thermo Scientific	11514015
Polybrene Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR1003G
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Qiagen Buffer P1	Qiagen	19051
Qiagen Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymerase	Clontech	639210
Trimmomatic software		www.usadellab.org