悪性末梢神経鞘腫瘍のマウスモデルにおける治療標的を特定するための遺伝子プロファイリングおよびゲノムスケールドロップアウトスクリーニング

要約

私たちは、遺伝子改変マウスモデルで発生した腫瘍の治療標的と対応するヒト腫瘍の種類を同定および比較するために、ゲノム解析と機能的ゲノムスクリーニングを利用した種間比較腫瘍ゲノミクスアプローチを開発しました。

要約

悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)は、シュワン細胞またはその前駆細胞に由来する。腫瘍感受性症候群神経線維腫症1型(NF1)の患者では、MPNSTは最も一般的な悪性腫瘍であり、主要な死因です。これらのまれで侵攻性の軟部肉腫は、5年無病生存率が34〜60%であり、厳しい未来を提供します。MPNST患者の治療選択肢は残念なことに限られており、外観を損なう手術が最も重要な治療選択肢です。Rasシグナル伝達の阻害剤であるチピファルニブなど、かつては有望視されていた多くの治療法が臨床的に失敗しています。同様に、上皮成長因子(EFGR)を標的とするエルロチニブ、血管内皮増殖因子受容体(VEGF)、血小板由来成長因子受容体(PDGF)、およびRafを標的とするソラフェニブを標準化学療法と併用した第II相臨床試験でも、患者に反応を示すことができませんでした。

近年、がん細胞株の遺伝子プロファイリングと組み合わせた機能的ゲノムスクリーニング法は、必須の細胞質シグナル伝達経路の同定や標的特異的治療法の開発に有用であることが証明されています。稀な腫瘍型の場合、異種間比較腫瘍ゲノミクスとして知られるこのアプローチのバリエーションが、新規治療標的の同定にますます用いられている。異種間比較腫瘍ゲノミクスでは、遺伝子プロファイリングと機能ゲノミクスが遺伝子改変マウス(GEM)モデルで実施され、その結果が入手可能な希少なヒト検体および細胞株で検証されます。

この論文では、全エクソームシーケンシング(WES)を使用して、ヒトおよびマウスのMPNST細胞における候補ドライバー遺伝子変異を同定する方法について説明します。次に、ゲノムスケールのshRNAスクリーニングを実施して、マウスおよびヒトMPNST細胞の重要なシグナル伝達経路を同定および比較し、これらの経路における創薬可能な標的を同定する方法について説明します。これらの方法論は、さまざまな種類のヒトがんにおける新しい治療標的を特定するための効果的なアプローチを提供します。

概要

悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)は、腫瘍感受性症候群神経線維腫症1型(NF1)に関連して発生する非常に攻撃的な紡錘細胞腫瘍であり、一般集団および以前の^{放射線療法の}部位で散発的に発生します1,2,3。NF1患者は、NF1腫瘍抑制遺伝子の野生型コピーと、機能喪失変異を有する第2のNF1対立遺伝子を持って生まれる。このハプロ不全の状態により、NF1患者は野生型NF1遺伝子の2回目の機能喪失変異の影響を受けやすくなり、腫瘍形成を引き起こします。この「セカンドヒット」NF1変異がシュワン細胞系統の細胞に発生すると、結果として生じる腫瘍は、皮膚に発生する真皮神経線維腫か、大神経または神経叢に発生する網状神経線維腫のいずれかである。皮膚神経線維腫と網状神経線維腫の病理は同じですが、それらの生物学的挙動はまったく異なります-真皮神経線維腫と網状神経線維腫はどちらも良性ですが、網状神経線維腫のみが形質転換を受け、MPNSTを引き起こす可能性があります。NF1遺伝子によってコードされるRas GTPase活性化タンパク質であるニューロフィブロミンの喪失に加えて、MPNSTは、TP53 4,5,6,7、CDKN2A

プロトコル

研究の開始前に、ウイルスベクターを取り扱うための動物の手順とプロトコルを、施設の動物のケアと使用委員会(IACUC)および施設のバイオセーフティ委員会(IBC)によってレビューおよび承認してもらいます。ここに記載されている手順は、サウスカロライナ医科大学のIACUCおよびIBC理事会によって承認され、実験動物のケアと使用に関するNIHガイドおよびMUSCの施設動物ケアガイドラインに従って、適切な訓練を受けた担当者によって実施されました。

1. WES-Seq解析と病原性多様体の同定

1. 標準的な市販の吸着シリカゲルベースの方法を使用して、60 mmの皿上で増殖した腫瘍サンプルまたはサブコンフルエント(70%)MPNST細胞からゲノムDNAを単離します(詳細な手順については、メーカーのプロトコルを参照してください)。一般的なワークフローを 図 1 に示します。
2. ゲノムDNAの量または濃度が異なる場合を除き、少なくとも10 μLのゲノムDNAを50 ng/μLでシーケンシングコアに提出してください。
   1. コア施設は、超音波処理によってゲノムDNAを断片化し、次いで好ましい方法を用いてそれを精製する。エクソーム捕捉およびライブラリ構築は、好ましいエクソーム配列決定キットを用いて行われ、インデックスタグは、増幅された捕捉エクソームに付加される。<....

ディスカッション

ここで紹介する詳細な方法は、末梢神経系腫瘍とMPNSTの病因を研究するために開発されました。これらの方法は効果的であることがわかりましたが、ここで説明する方法にはいくつかの潜在的な制限があることを認識する必要があります。以下では、これらの制限のいくつかと、他のモデルシステムでそれらを克服するための潜在的な戦略について説明します。

我々は、.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioruptor Sonication System	Diagenode	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, San Diego, CA	N/A
Celigo Image Cytometer	Nexcelom	N/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve Hybrid	Decon Laboratories	5989-27-5
Corning 96-well Black Microplate	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes	Diagenode	C30010009
dNTP mix	Clontech	639210
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Elution buffer	Qiagen	19086
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Excel	Microsoft
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’			HPLC purified
GraphPad Prism	Dotmatics
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, San Diego, CA	N/A
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS Transfection Reagent	Thermo Scientific	11514015
Polybrene Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR1003G
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Qiagen Buffer P1	Qiagen	19051
Qiagen Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymerase	Clontech	639210
Trimmomatic software		www.usadellab.org