التنميط الظاهري للخلايا العصبية الدوبامينية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية في الدماغ المتوسط

Summary

يصف هذا البروتوكول زراعة الخلايا للخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ المتوسط البشري ، يليها تلطيخ مناعي وتوليد ملامح النمط الظاهري للخلايا العصبية من الصور المجهرية عالية المحتوى المكتسبة مما يسمح بتحديد الاختلافات المظهرية بسبب التحويرات الجينية أو الكيميائية.

Abstract

يرتبط مرض باركنسون (PD) بمجموعة من العمليات البيولوجية الخلوية التي تسبب فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ المتوسط (mDA). تفتقر العديد من النماذج الخلوية PD الحالية في المختبر إلى التعقيد ولا تأخذ في الاعتبار الأنماط الظاهرية المتعددة. يمكن أن يعالج التنميط الظاهري في الخلايا العصبية mDA المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC) التي يسببها الإنسان أوجه القصور هذه عن طريق قياس مجموعة من الأنماط الظاهرية العصبية في وقت واحد في نوع الخلية ذات الصلة PD بالتوازي. هنا ، نصف بروتوكولا للحصول على ملفات تعريف النمط الظاهري وتحليلها من الخلايا العصبية mDA البشرية المتاحة تجاريا. يتم استخدام لوحة تلطيخ الفلورسنت الخاصة بالخلايا العصبية لتصور الأنماط الظاهرية ذات الصلة بالبروتين النووي ، α-synuclein ، هيدروكسيلاز التيروزين (TH) ، والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 2 (MAP2). بروتوكول التنميط الظاهري الموصوف قابل للتطوير لأنه يستخدم ألواح 384 بئرا ومعالجة السوائل التلقائية والفحص المجهري عالي الإنتاجية. تتمثل فائدة البروتوكول في استخدام الخلايا العصبية mDA المانحة السليمة والخلايا العصبية mDA التي تحمل طفرة G2019S المرتبطة ب PD في جين كيناز 2 (LRRK2) الغني بالليوسين. تمت معالجة كلا خطي الخلايا بمثبط كيناز LRRK2 PFE-360 وتم قياس التغيرات الظاهرية. بالإضافة إلى ذلك ، نوضح كيف يمكن تحليل ملفات تعريف النمط الظاهري متعددة الأبعاد باستخدام طرق التصنيف الخاضعة للإشراف القائمة على التجميع أو التعلم الآلي. سيثير البروتوكول الموصوف اهتمام الباحثين الذين يعملون على نمذجة الأمراض العصبية أو دراسة تأثيرات المركبات الكيميائية في الخلايا العصبية البشرية.

Introduction

يتم إزعاج مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية الخلوية في مرض باركنسون (PD). على سبيل المثال ، ارتبط الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا ، والإجهاد التأكسدي ، وعيوب تحلل البروتين ، وتعطيل الاتجار الحويصلي ووظيفة الليزوزومات الداخلية بفقدان الخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ المتوسط (mDA) ، ويلاحظ بشكل شائع في PD¹. لذلك ، يبدو أن مرض باركنسون ينطوي على آليات مرضية متعددة يمكن أن تتفاعل مع بعضها البعض وتزيد من تفاقمها. تتمثل إحدى الطرق المفيدة للتحقيق في هذا التفاعل الميكانيكي في إنشاء بصمة مظهرية شاملة أو ملف تعريف للخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ المتوسط (mDA).

التنميط الظاهري هو نهج يتضمن إنشاء ملف تعريف لعينة بناء على مجموعة من الخصائص القابلة للقياس ، وثانيا ، يتضمن إجراء تنبؤات حول عينة بناء على هذا الملف الشخصي ^2,3. الهدف من التنميط هو التقاط مجموعة متنوعة من الميزات ، قد لا يكون بعضها مرتبطا سابقا بمرض أو علاج³. نتيجة لذلك ، يمكن أن يكشف التنميط عن عمليات بيولوجية غير متوقعة. يعتمد التنميط الظاهري عادة على الخلايا الملطخة بالفلورسنت ، وقد تم تطوير فحوصات موحدة ، مثل طلاء الخلية ، لإنشاء ملامح النمط الظاهري⁴. في الآونة الأخيرة ، تم تطبيق التنميط الظاهري ، على سبيل المثال ، لتوصيف الجزيئات الصغيرة أو التنبؤ الدقيق بأنواع PD الفرعية فقط بناء على الخلايا الليفية المشتقة من المريض ^5,6. على الرغم من هذه التطورات ، نادرا ما تم تطبيق التنميط الظاهري على الخلايا المتمايزة بعد الانقسام ، مثل الخلايا العصبية mDA المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSC) والتي تعبر عن طفرات مرتبطة بمرض باركنسون مثل LRRK2 G2019S. تشمل التحديات الكبيرة للنماذج المشتقة من iPSC وجود سمات مرضية دقيقة أو متغيرة عبر دفعات التمايز أو الأنماط الجينية ، وحقيقة أن الأنماط الظاهرية المعزولة لمرض باركنسون لا تلتقط التعقيد الكامل للمرض. علاوة على ذلك ، في حين أن النماذج العصبية iPSC ذات صلة من الناحية الفسيولوجية ، إلا أنها نادرا ما تستخدم في عمليات اكتشاف أدوية PD بسبب مخاوف بشأن التعقيد التقني ^7,8.

لقد طورنا سابقا منهجية قوية لقياس الأنماط الظاهرية الفيزيولوجية المرضية المتعددة المرتبطة بمرض باركنسون في الخلايا العصبية mDA البشرية الحساسة للتغيرات المظهرية التي يسببها المركبات الجينية^{والكيميائية 9}. توضح هذه المقالة بالتفصيل نسخة محسنة أخرى من هذه المنهجية لإنشاء ملفات تعريف النمط الظاهري من الخلايا العصبية mDA (الشكل 1). يتمتع هذا البروتوكول بالعديد من المزايا مقارنة بنهج التنميط الظاهري الموصوفة سابقا ، مثل استخدام الخلايا العصبية mDA عالية الجودة والتكاثر التقني. لأول مرة ، يتيح هذا البروتوكول التنميط الظاهري في الخلايا العصبية mDA ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية بعد الانقسام بعد الاضطرابات الكيميائية بطريقة قابلة للتطوير بدرجة كبيرة. تتوفر الخلايا العصبية mDA المتمايزة والمحفوظة بالتبريد تجاريا ، مما يقلل بشكل كبير من تباين التمايز من دفعة إلى أخرى. ثانيا، يمكن زيادة تقليل التباين التقني باستخدام تصميم تجريبي محدد جيدا (أي مدة الاستزراع أو تجنب الآبار الحافة)، والمناولة الآلية للسوائل والفحص المجهري الآلي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توضيح الخطوات الأولية لتحليل ملف تعريف النمط الظاهري باستخدام نهج التجميع غير الخاضع للإشراف أو التصنيف الخاضع للإشراف هنا ، مما يشير إلى كيفية تحليل بيانات التنميط الظاهري. سيكون هذا البروتوكول مفيدا للباحثين المهتمين بالتغيرات المظهرية للخلايا العصبية mDA الناتجة عن الاضطرابات الجينية أو الكيميائية ، وتحديدا عندما تكون هناك حاجة إلى إعداد دراسة قابلة للتطوير بدرجة كبيرة ، على سبيل المثال ، أثناء حملات الفحص أو عندما يتم دراسة تأثيرات عدد أقل من المركبات ، على سبيل المثال ، لتحديد الآثار السامة. باختصار ، من المتوقع أن يكون تطبيق التنميط الظاهري للخلايا العصبية البشرية تقنية قيمة لدراسة الأنماط الظاهرية المعقدة المرتبطة بالأمراض وتوصيف التأثيرات الخلوية للأدوية المرشحة.

الشكل 1: تصوير تخطيطي للبروتوكول التجريبي لتوليد ملامح النمط الظاهري القائمة على الصور من الخلايا العصبية mDA المشتقة من iPSC البشرية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Protocol

1. تحضير الوسط والألواح لبذر الخلايا العصبية (اليوم الأول)

1. لتحضير الأطباق لبذر الخلايا العصبية في اليوم 1 ، قم بتسخين اللامينين إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام مباشرة. تحضير محلول Laminin عن طريق تخفيف محلول مخزون Laminin (0.1 مجم / مل) 1/10 في PBS +/+ البارد (مع Ca 2+ و Mg²⁺).
   ملاحظة: جميع الكواشف مدرجة في جدول المواد. يتم وصف تركيبات الحلول والمخازن المؤقتة في الجداول 1-4.
2. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولتر من محلول Laminin إلى كل بئر من لوحة Poly-D-Lysine (PDL) المغلفة مسبقا ب 384 بئرا ، واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. يمكن تخزين الألواح المطلية في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا لمدة تصل إلى أسبوع واحد. لوحات الختم باستخدام فيلم من البلاستيك.
3. قم بإعداد وسائط الصيانة الكاملة وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد (الجدول 1).

2. ذوبان الخلايا العصبية (اليوم 0)

1. لإذابة الخلايا العصبية في اليوم 0 ، قم بتسخين حمام مائي إلى 37 درجة مئوية ، وقم بموازنة وسائط الصيانة الكاملة مع RT ، المحمية من الضوء.
2. أخرج القارورة التي تحتوي على الخلايا العصبية المجمدة التي تم الحصول عليها تجاريا (انظر جدول المواد) من خزان النيتروجين السائل وضعها على الثلج الجاف. ثم ضع القارورة في حمام مائي لمدة 2 دقيقة. بمجرد إذابة السائل تماما ، قم بتطهير القارورة بنسبة 70٪ من الإيثانول.
3. استنشاق الخلايا العصبية المذابة باستخدام ماصة P1000 (حوالي 370 ميكرولتر) ونقلها في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل دون سحب ماصة لأعلى ولأسفل. بعد ذلك ، اشطف القارورة ب 630 ميكرولتر من وسط الصيانة الكاملة ، واستغني قطرة قطرة (زاوية 45 درجة) في أنبوب 50 مل. حرك ببطء أثناء الاستغناء.
   ملاحظة: من الأهمية بمكان الاستغناء عن الوسط ببطء ، قطرة قطرة ، لتجنب التمزق التناضحي للخلايا. تعمل الزاوية 45 درجة وتحريض الضوء على تقليل الضغط الاسموزي المحلي المرتفع أثناء الماصة.
4. وبالمثل ، أضف 1 مل من وسيط الصيانة الكاملة في أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل مع ماصة P1000. ثم أضف ببطء 2 مل من وسط الصيانة الكاملة. حرك بعناية أثناء الاستغناء.
5. عد الخلايا. قم بإعداد أنبوب دقيق مع تعليق خلية Trypan Blue سعة 10 ميكرولتر و 10 ميكرولتر وإضافته إلى شريحة غرفة العد (10 ميكرولتر). قم بإجراء العد باستخدام عداد خلية آلي (انظر جدول المواد) أو يدويا.
6. بعد العد ، قم بطرد مركزي أنبوب 50 مل يحتوي على الخلايا العصبية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في RT ، وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات بعناية باستخدام ماصة P1000 و 1 مل من وسط الصيانة الكاملة. ثم أضف الحجم اللازم للوصول إلى التركيز المطلوب (300000 خلية / مل ، انظر أيضا الخطوة التالية).

3. بذر الخلايا العصبية على لوحات محضرة (اليوم 0)

1. لزرع الخلايا العصبية على الأطباق المعدة في اليوم 0 ، أخرج الألواح المطلية من الثلاجة ، وضعها تحت غطاء زراعة الخلايا واتركها تتوازن مع RT لمدة 30 دقيقة تقريبا.
2. قبل البذر مباشرة ، قم بنضح محلول طلاء سعة 15 ميكرولتر باستخدام معالج سائل آلي أو ماصة ذات 16 قناة. اترك حوالي 10 ميكرولتر لكل بئر لمنع تلف الطلاء.
3. بعد ذلك ، قم بتوزيع 50 ميكرولتر من محلول الخلية الذي يحتوي على 300000 خلية / مل (تم تحضيره في الخطوة 2.6) لكل بئر باستخدام ماصة ذات 16 قناة ، مما ينتج عنه 15000 خلية عصبية مصنفة لكل بئر وحجم نهائي لكل بئر يبلغ 60 ميكرولتر.
4. في لوحة 384 بئرا ، تجنب استخدام الأعمدة 1 و 2 و 23 و 24 والصفوف A و B و O و P لتقليل تأثيرات الحافة المحتملة التي يمكن أن تؤثر على ملامح النمط الظاهري. املأ الآبار الفارغة غير المستخدمة ب 80 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.

4. تغيير متوسط أو معالجة مركبة (اليوم 3)

1. اعتمادا على عدد الآبار ، قم بتسخين حجم مناسب من وسيط الصيانة الكاملة مسبقا في RT.
2. إذا كان التغيير المتوسط مطلوبا ، فانتقل إلى الخطوة 4.4. إذا كانت المعالجة المركبة مطلوبة ، تحقق من تركيز المخزون المركب والمذيب المستخدم (الماء ، DMSO ، الميثانول ، إلخ).
3. قم بإعداد محلول مركب مركز 1.5x لجميع التركيزات المطلوبة المراد اختبارها. تحضير التخفيفات المركبة باستخدام وسيط الصيانة الكامل.
   ملاحظة: كعنصر تحكم محايد ، استخدم المذيب المعني بنفس تركيز المركب المختبر. إذا تم استخدام مركبات متعددة أو غير معروفة بتركيزات مختلفة ، فمن المستحسن إجراء تجربة استجابة منفصلة للجرعة لقياس تأثيرات المذيبات على المظهر الظاهري.
4. إذا تم استخدام نظام سحب تلقائي ، أضف 60 ميكرولتر من المحلول المركب 1.5x إلى لوحة تخزين 384 بئرا. بدلا من ذلك ، استخدم ماصة ذات 16 قناة. إذا كان التغيير المتوسط مطلوبا ، أضف 60 ميكرولتر من وسيط الصيانة الكاملة بدلا من ذلك.
5. باستخدام نظام السحب التلقائي ، قم بشفط وتجاهل 40 ميكرولتر من الوسط لكل بئر من اللوحة المحتوية على الخلايا العصبية للحفاظ على 20 ميكرولتر / بئر. ثم أضف 40 ميكرولتر / بئر من محلول مركب 1.5x من لوحة تخزين 384 بئرا إلى كل بئر للحصول على التركيز النهائي المطلوب.
   ملاحظة: من الأهمية بمكان عدم إجراء تغييرات متوسطة كاملة ولكن ترك الوسط المتبقي دائما في البئر لمنع تلف السجادة العصبية أو الطلاء.
6. في حالة إجراء الثقافة العصبية لأكثر من 6 أيام موصوفة في هذا البروتوكول ، قم بتغيير الوسيط كل 2-3 أيام.

5. تثبيت الخلايا العصبية وتلطيخها (الأيام من 6 إلى 7)

1. لإصلاح الخلايا العصبية وتلطيخها في اليومين 6 و 7 ، استخدم معالج سائل آلي لجميع خطوات التوزيع والغسيل. بدلا من ذلك ، استخدم ماصة ذات 16 قناة.
2. قم بإعداد محلول Triton X-100 بنسبة 10٪ عن طريق تخفيف Triton X-100 في 1x PBS. دوامة حتى الحل متجانسة. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
3. لإصلاح الخلايا العصبية ، قم بتوزيع 20 ميكرولتر / بئر من 16٪ PFA مما يؤدي إلى تركيز نهائي بنسبة 4٪. احتضن الطبق لمدة 30 دقيقة في RT ، واغسله ثلاث مرات باستخدام 1x PBS. اترك 20 ميكرولتر / بئر من برنامج تلفزيوني بعد الغسيل الأخير.
   تنبيه: يتم التعرف على PFA كمادة خطرة معروفة بأنها تسبب سمية الفم والجلد والجهاز التنفسي. كما أنه يشكل تهديدا للعيون وقد يؤدي إلى طفرات جينية وسرطان. يتطلب التعامل السليم مع PFA استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة ، مثل حماية العين والوجه ، بالإضافة إلى ضمان التهوية المناسبة. من المهم منع إطلاق PFA في البيئة.
4. للنفاذية والحجب ، قم بإعداد حل حظر 2x (الجدول 2).
5. أضف 20 ميكرولتر / بئر من محلول مانع 2x (تركيز نهائي 1x) ، واحتضان لمدة 1 ساعة في RT ، واغسله مرة واحدة باستخدام PBS. احتفظ ب 20 ميكرولتر / بئر من PBS بعد الغسيل.
6. بالنسبة لتلطيخ الأجسام المضادة الأولية (انظر جدول المواد) ، قم بإعداد مخزن مؤقت للتلطيخ الأولي 2x (الجدول 3).
7. أضف 20 ميكرولتر / بئر من 2x مخزن تلطيخ أولي (1x تركيز نهائي) واحتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية. في صباح اليوم التالي في اليوم 7 ، اغسل ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. اترك 20 ميكرولتر / بئر من PBS بعد الغسيل.
8. بالنسبة لتلطيخ الأجسام المضادة الثانوية (انظر جدول المواد) ، قم بإعداد مخزن مؤقت ثانوي للتلطيخ 2x (الجدول 4).
9. أضف 20 ميكرولتر / بئر من 2x مخزن تلطيخ ثانوي (1x تركيز نهائي) ، واحتضان لمدة ساعتين في RT بعيدا عن الضوء ، واغسل ثلاث مرات باستخدام PBS. اترك 100 ميكرولتر PBS / جيدا بعد آخر غسلة.
   1. أضف ختم الألومنيوم على اللوحة لتقليل التبخر. بدلا من ذلك ، قم بتغطية اللوحة باستخدام فيلم بلاستيكي وورق الألمنيوم. انتقل إلى الحصول على الصور ، أو قم بتخزين اللوحة في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا لمدة تصل إلى أسبوع واحد. إذا لوحظ مضان الخلفية ، ففكر في زيادة وقت الحظر. إذا كان التلوين غير كاف ، فحاول زيادة تركيز الأجسام المضادة الأولية أو وقت الحضانة.

6. تصوير الخلايا العصبية الملطخة بالفلورسنت (اليوم 7)

1. احصل على صور للخلايا العصبية المطلية والمستزرعة والملطخة في اليوم 7. من الناحية المثالية ، استخدم مجهرا مضان متحد البؤر آليا (انظر جدول المواد). بدلا من ذلك ، احصل على الصور يدويا.
2. احصل على قنوات Hoechst و TH و α-synuclein و MAP2 باستخدام ليزر 405 نانومتر و 488 نانومتر و 561 نانومتر و 647 نانومتر على التوالي (الشكل 2).
   ملاحظة: لتوليد كمية كافية من البيانات التفصيلية للتنميط الظاهري ، استخدم هدف 40x واحصل على 16 حقلا / بئرا باستخدام مداخن Z تتكون من 3 شرائح Z مفصولة ب 2 ميكرومتر. في حالة وجود أضرار متعلقة بالماصة في السجادة العصبية ، حاول تجنب تصوير هذه المناطق.
3. اعتمادا على المجهر والكاميرا ، اضبط أوقات التعرض وشدة الإثارة لكل قناة من قنوات الفلورسنت الأربع بشكل منفصل للحصول على نطاق ديناميكي مثالي لشدة الفلورسنت.
   ملاحظة: غالبا ما يوفر برنامج التصوير مدرجا تكراريا لتحديد وقت التعرض المثالي. إذا تم إزاحة الرسم البياني كثيرا إلى اليسار في نطاق الإشارة المنخفض ، فإن وقت التعرض قصير جدا أو تكون شدة الإثارة منخفضة جدا. إذا كان هناك جرف حاد عند الحد الأقصى لمستوى الإشارة على اليمين ، فإن قيمة الإشارة مشبعة. في هذه الحالة ، قلل من شدة الإثارة أو تقصير وقت التعرض.
4. قم بتخزين الصور بتنسيق مفتوح وخالي من الضياع مثل .tif.

7. معالجة الصور (اليوم 8)

1. تجزئة الصورة واستخراج ميزة النمط الظاهري مطلوبة لإنشاء ملفات تعريف النمط الظاهري الكمية. استخدم برنامج PhenoLink لتجزئة الصور واستخراج الميزات (جدول المواد). يمكن العثور على تعليمات تثبيت PhenoLink في مستودع GitHub (https://github.com/Ksilink/PhenoLink).
   ملاحظة: يتم استخدام تجزئة الصورة لتحديد وفصل الكائنات أو المناطق المختلفة في الصورة ، بينما يتم استخدام استخراج ميزة النمط الظاهري لتحليل واستخراج المعلومات ذات الصلة من تلك المناطق. تتوفر العديد من حلول البرامج البديلة ، مثل CellProfiler 10 أو ImageJ / FIJI¹¹ أو Napari¹² أو Knime Analytics^{Platform 13} لاستخراج المعلومات الكمية من الصور الفلورية متعددة القنوات.
2. قم بإجراء تجزئة الصورة على الصور الأولية المصححة للإضاءة. حدد عتبات شدة قناة الفلورسنت المعنية تجريبيا لكل لوحة بحيث تكون إشارة الخلفية ضئيلة ، وتتوافق الإشارة المجزأة المطلوبة مع الإشارة في الصورة الأولية. عادة ما تتطلب اللوحات المعالجة والملطخة في نفس اليوم عتبات كثافة قناة مماثلة للتجزئة.
3. تحديد حجم النواة وشدتها لفصل الخلايا الحية عن الخلايا الميتة. عند استخدام صور 40x ، احتفظ بجميع المعلمات الافتراضية الأخرى وقم بتشغيل البرنامج. سيتم حساب مائة وستة وعشرين معلما كميا للصور لكل بئر (الجدول التكميلي 1).
4. استخدم البيانات الكمية الجدولية الناتجة لبناء ملامح النمط الظاهري ومقارنة ملامح النمط الظاهري من خطوط الخلايا المختلفة أو ظروف العلاج. يتوافق كل صف مع حالة بيولوجية (بئر) ويتوافق كل عمود مع ميزة النمط الظاهري المحددة.
   ملاحظة: نقدم مثالا لملف الإخراج مع خط أنابيب تحليل البيانات لتوضيح استخدامه (انظر جدول المواد). بالإضافة إلى ذلك ، يوضح الشكل 3 تكوين ملف تعريف النمط الظاهري.

8. توليد ملف تعريف النمط الظاهري والتصور (اليوم 8)

1. إذا لم يكن لديك Python و Jupyter مثبتين على جهاز الكمبيوتر الخاص بك ، فقم بتثبيت توزيع Anaconda وافتح برنامج Jupyter. قم بتنزيل دفتر ملاحظات Jupyter المقدم وجميع الملفات الأخرى المتوفرة واحفظها في نفس الدليل (انظر جدول المواد). افتح ملف دفتر ملاحظات Jupyter باستخدام برنامج Jupyter.
   ملاحظة: Anaconda عبارة عن نظام أساسي مجاني ومفتوح المصدر للغات البرمجة مثل Python. تأتي هذه المنصة مع مترجم Python Jupyter الذي يمكنه تنفيذ دفتر Jupyter المقدم لإنشاء وتحليل ملفات تعريف النمط الظاهري (https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling).
2. قم بتنفيذ دفتر ملاحظات Jupyter خلية تلو الأخرى باستخدام برنامج Jupyter. يجب وضع نموذج البيانات المتوفرة .fth وملفات .txt المتطلبات في نفس الدليل مثل دفتر ملاحظات Jupyter. يتم شرح كل خلية دفتر ملاحظات Jupyter لشرح وظائفها.
   ملاحظة: من الضروري استخدام دفتر ملاحظات Jupyter بالترتيب الصحيح بدءا من تحميل البيانات وقياسها والمتابعة خلية تلو الأخرى حتى النهاية. سيتم تخزين جميع البيانات ومخرجات الرسومات في مجلد تم إنشاؤه حديثا في دليل مصدر دفتر ملاحظات Jupyter. يوضح الشكل 4 سير العمل وإخراج سير العمل.

النتائج

يعد التنميط الظاهري في الخلايا العصبية mDA طريقة فعالة لتحديد جوانب متعددة من البيولوجيا الخلوية وتغيراتها أثناء التعديل التجريبي. لتجسيد هذه المنهجية ، استخدمت هذه الدراسة LRRK2 G2019S المحفوظة بالتبريد والخلايا العصبية mDA المانحة الصحية. تم تمييز هذه الخلايا العصبية لمدة 37 يوما تقريبا ، وهي ?...

Discussion

التنميط الظاهري هو تقنية لقياس عدد كبير من الأنماط الظاهرية في الخلايا عن طريق تطبيق تلطيخ الفلورسنت والفحص المجهري وتحليل الصور³. يمكن الحصول على ملامح النمط الظاهري ومقارنتها عبر خطوط الخلايا أو الظروف التجريبية الأخرى لفهم التغيرات المعقدة في البيولوجيا الخلوية التي قد ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti- chicken – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-α-synuclein	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head	Agilent		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope	Yokogawa	CV7000	The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter	Invitrogen		Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser	BioTek (Agilent)		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation before staining
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook	In-house development	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin	Biolamina	LN521	Plate coating
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink	In-house development	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated	Perkin Elmer	6057500	Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilization before lysis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determination of living cells
Vprep Pipetting System	Agilent		Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.