JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توفر هذه الدراسة بروتوكولا لاستخدام الفئران بالضربة القاضية Stat3 الخاصة بنسب بانيات العظم لدراسة إعادة تشكيل العظام تحت قوة تقويم الأسنان وتصف طرق تحليل إعادة تشكيل العظام السنخية أثناء حركة الأسنان التقويمية ، وبالتالي إلقاء الضوء على البيولوجيا الميكانيكية للهيكل العظمي.

Abstract

العظم السنخي ، مع معدل دوران مرتفع ، هو العظم الأكثر نشاطا في إعادة تشكيل الجسم. حركة الأسنان التقويمية (OTM) هي عملية اصطناعية شائعة لإعادة تشكيل العظام السنخية استجابة للقوة الميكانيكية ، لكن الآلية الأساسية تظل بعيدة المنال. لم تتمكن الدراسات السابقة من الكشف عن الآلية الدقيقة لإعادة تشكيل العظام في أي زمان ومكان بسبب القيود المتعلقة بالنماذج الحيوانية. يعد محول الإشارة ومنشط النسخ 3 (STAT3) مهما في استقلاب العظام ، لكن دوره في بانيات العظم أثناء OTM غير واضح. لتقديم دليل في الجسم الحي على أن STAT3 يشارك في OTM في نقاط زمنية محددة وفي خلايا معينة أثناء OTM ، قمنا بإنشاء نموذج فأر Stat3 بالضربة القاضية الخاص بسلالة عقار تاموكسيفين ، وطبقنا قوة تقويم الأسنان ، وحللنا النمط الظاهري للعظام السنخية.

تم استخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (Micro-CT) والفحص المجهري الاستريو للوصول إلى مسافة OTM. اختار التحليل النسيجي المنطقة الواقعة داخل ثلاثة جذور من الضرس الأول (M1) في المقطع العرضي لعظم الفك العلوي كمنطقة الاهتمام (ROI) لتقييم النشاط الأيضي لبانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم ، مما يشير إلى تأثير قوة تقويم الأسنان على العظم السنخي. باختصار ، نحن نقدم بروتوكولا لاستخدام الفئران بالضربة القاضية Stat3 ذات النسب المستحثة لدراسة إعادة تشكيل العظام تحت قوة تقويم الأسنان ووصف طرق تحليل إعادة تشكيل العظام السنخية أثناء OTM ، وبالتالي إلقاء ضوء جديد على البيولوجيا الميكانيكية للهيكل العظمي.

Introduction

من المعروف عموما أن العظام تخضع لإعادة بناء مستمرة طوال الحياة ، استجابة للقوى الميكانيكية وفقا لقانون وولف 1,2. يحافظ التحفيز الميكانيكي المناسب ، مثل الجاذبية والتمارين اليومية ، على كتلة العظام وقوتها ويمنع فقدان العظام عن طريق تحفيز كل من بانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم. تحافظ الخلايا العظمية ، المسؤولة عن ارتشاف العظام3،4،5،6،7 ، وبانيات العظم ، المسؤولة عن تكوين العظام8،9،10 ، على توازن العظام وتعمل بشكل مشترك في العملية البيولوجية لإعادة تشكيل العظام. في المقابل ، في غياب محفزات التحميل ، كما هو الحال في رواد الفضاء تحت الجاذبية الصغرى طويلة الأجل ، تعاني العظام من فقدان كثافة المعادن في العظام بنسبة 10٪ ، مما يزيد من خطر الإصابة بهشاشة العظام11,12. علاوة على ذلك ، ظهرت العلاجات الميكانيكية غير الغازية والمريحة ، بما في ذلك تقويم الأسنان وتكوين العظم المشتت ، كعلاجات لأمراض العظام13،14. كل هذه أظهرت أن القوة الميكانيكية تلعب دورا حاسما في الحفاظ على جودة العظام وكميتها. قامت الدراسات الحديثة بشكل عام بتحليل إعادة تشكيل العظام استجابة للتحميل الميكانيكي باستخدام نماذج تستغرق وقتا طويلا مثل اختبارات تعليق عجلة الجري والذيل ، والتي تستغرق عادة 4 أسابيع أو أكثر لمحاكاة تحميل القوة أو التفريغ15,16. لذلك ، هناك طلب على نموذج حيواني مناسب وفعال لدراسة إعادة تشكيل العظام مدفوعة بتحميل القوة.

العظم السنخي هو الأكثر نشاطا من حيث إعادة تشكيل العظام ، مع معدل دوران مرتفع17. حركة تقويم الأسنان (OTM) ، وهي علاج شائع لسوء الإطباق ، هي عملية اصطناعية لإعادة تشكيل العظام السنخية استجابة للقوة الميكانيكية. ومع ذلك ، فإن OTM ، الذي يحفز إعادة تشكيل العظامبسرعة 18 ، هو أيضا وسيلة موفرة للوقت لدراسة آثار القوة الميكانيكية على إعادة تشكيل العظام مقارنة بالنماذج الأخرى ذات الفترة التجريبية الطويلة. لذلك ، يعد OTM نموذجا مثاليا لدراسة إعادة تشكيل العظام تحت المحفزات الميكانيكية. من الجدير بالذكر أن آلية إعادة تشكيل العظام السنخية غالبا ما تكون حساسة للوقت ، ومن الضروري ملاحظة التغيرات في إعادة تشكيل العظام السنخية في نقاط زمنية معينة بعد النمذجة. مع المزايا المزدوجة للتحكم الزماني والمكاني في إعادة تركيب الحمض النووي وخصوصية الأنسجة ، يعد نموذج فأر الضربة القاضية للجين الشرطي المستحث خيارا مناسبا لدراسات OTM.

تقليديا ، تم تقسيم إعادة تشكيل العظام السنخية بوساطة OTM إلى مناطق توتر تتضمن تكوين العظام ومناطق ضغط تتضمن ارتشاف العظام19،20،21 ، وهو أكثر تفصيلا ولكن يصعب تنظيمه. علاوة على ذلك ، أفاد يوري وآخرون أن وقت تكوين العظام في OTM يختلف على جانبي التوتر والضغط22. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت دراسة سابقة أن الضرس الأول يمكن أن يبدأ إعادة تشكيل واسعة للعظم السنخي الفكي العلوي تحت قوة تقويم الأسنان ، والتي لم تكن مقيدة بمناطق التوتر والضغط23. لذلك ، اخترنا المنطقة الواقعة داخل ثلاثة جذور من M1 في المقطع العرضي لعظم الفك العلوي كمنطقة الاهتمام (ROI) ووصفنا طرقا لتقييم نشاط بانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم في نفس المنطقة لتقييم إعادة تشكيل العظم السنخي تحت OTM.

كعامل نسخ نووي ، ثبت أن محول الإشارة ومنشط النسخ 3 (STAT3) حاسمان في توازن العظام24,25. أفادت الدراسات السابقة عن انخفاض كثافة المعادن في العظام والكسور المرضية المتكررة في الفئران الطافرة Stat3 26,27. أظهرت دراستنا السابقة أن حذف Stat3 في بانيات العظم Osx + تسبب في تشوه قحفي وجهي وهشاشة العظام ، بالإضافة إلى كسر العظام التلقائي28. في الآونة الأخيرة ، قدمنا أدلة في الجسم الحي مع نموذج ماوس حذف Stat3 خاص ببانيات العظم (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/ fl ، المشار إليها فيما يلي Stat3Col1α2ERT2) أن STAT3 أمر بالغ الأهمية في التوسط في تأثيرات قوة تقويم الأسنان التي تقود إعادة تشكيل العظام السنخية29. في هذه الدراسة ، نقدم طرقا وبروتوكولات لاستخدام الفئران الضربة القاضية Stat3 الخاصة بنسب بانيات العظم لدراسة إعادة تشكيل العظام تحت قوة تقويم الأسنان ووصف طرق تحليل إعادة تشكيل العظام السنخية أثناء OTM ، وبالتالي إلقاء الضوء على البيولوجيا الميكانيكية للهيكل العظمي.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق التي تنطوي على الموصوفة هنا من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى شنغهاي الشعبي التاسع ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (رقم 82101048).

1. إنشاء فئران بالضربة القاضية Stat3 الخاصة بنسب بانيات العظم

ملاحظة: تم الحصول على الفئران Stat3 fl/ fl تجاريا. كانت سلالة Col1α2CreERT2هدية (انظر جدول المواد للحصول على جميع التفاصيل). تم توفير طعام وماء حبيبات المختبر الموحدة والظروف البيئية المختبرية القياسية (درجة حرارة الغرفة عند 22 درجة مئوية إلى 26 درجة مئوية والرطوبة عند 50٪ -55٪) لجميع.

  1. ضع فأرا ذكرا ناضجا جنسيا مع فأرتين إناث في نفس القفص. بعد 18 يوما ، تحقق من الأطفال حديثي الولادة كل يوم. أخرج أي إناث من الفئران الحوامل إلى قفص فارغ واحتفظ بها بمفردها إذا لزم الأمر. ضع الفئران الذكور في أقفاص تربية مختلفة أخرى إذا لم تكن إناث الفئران حاملا في غضون 30 يوما.
  2. توليد Stat3fl / + ؛ الفئران Col1α2 CreERT2 عن طريق تهجين الفئران Stat3 fl/ fl مع الفئران Col1α2CreERT2 ؛ الحفاظ على كل هذه الفئران على خلفية C57BL / 6. جمع نصائح الذيل 2-5 مم للتنميط الجيني والحفاظ على ذكر Stat3fl / + ؛ فئران Col1α2CreERT2 حتى تنضج جنسيا (F1).
  3. تهجين ذكر يبلغ من العمر 6 أسابيع Stat3fl/ + ؛ الفئران Col1α2CreERT2 مع إناث الفئران Stat3fl / fl. جمع أطراف الذيل 2-5 مم عندما يكون عمر الفئران أسبوعين للتنميط الجيني ، والحفاظ على ذكر Stat3 fl/ fl ؛ Col1α2 CreERT2 (Stat3Col1α2ERT2) الفئران حتى تنضج جنسيا (F2).
  4. تهجين ذكر Stat3 fl / fl البالغ من العمر 6 أسابيع ؛ الفئران Col1α2CreERT2 مع إناث الفئران Stat3fl / fl (F3). اجمع أطراف الذيل 2-5 مم عندما يبلغ عمر الفئران أسبوعين للتنميط الجيني ، واستخدم الفئران الأصغر سنا من نفس النمط الوراثي لتحل محل الفئران الأكبر سنا عند الاقتضاء (F3 + N).
    ملاحظة: تنخفض القدرة التناسلية للفئران بعد عمر 8 أشهر ، لذلك يجب مراقبة الفئران في أقفاص التكاثر بعناية واستبدالها حسب الحاجة. بالإضافة إلى ذلك ، وفقا للمتطلبات التجريبية ، يجب زيادة عدد أقفاص التكاثر بشكل مناسب لتجنب انقراض الفئران الجينية المستهدفة.

2. الحذف المستحث ل Stat3 في بانيات العظم المعبرة عن Col1α2 بواسطة عقار تاموكسيفين

  1. قم بإذابة عقار تاموكسيفين في زيت الذرة إلى 20 مجم / مل في أنبوب طرد مركزي ، وحفظه من الضوء عن طريق لفه بورق الألمنيوم. ضع أنبوب الطرد المركزي المغطى بالرقائق على خلاط دوار واخلطه في درجة حرارة الغرفة حتى يذوب تماما.
    ملاحظة: تم الحصول على عقار تاموكسيفين تجاريا وتخزينه في الظلام عند 4 درجات مئوية.
  2. اختر عشرة فئران ذكور تبلغ من العمر 6 أسابيع وقسمها إلى مجموعات Stat3 fl / fl و Stat3 Col1α2ERT2 مع خمسة فئران في كل مجموعة. تطبيق عقار تاموكسيفين (100 ملغ·كغ-1·وزن الجسم) كل يومين لمدة أسبوع واحد عن طريق الحقن داخل الصفاق.

3. نموذج حركة الأسنان التقويمية (OTM)

  1. قم بإعداد منصة تشريح فأر بلاستيكية معقمة كطاولة عمليات لشل حركة الفئران.
    ملاحظة: تم الحصول على طاولة تشريح الماوس تجاريا وتتألف من أربعة أعمدة مطاطية قابلة للتعديل وقضيب معدني واحد لشل حركة الفئران. استخدم الأدوات والأدوات المعقمة طوال العملية.
  2. قم بتوصيل شريط مطاطي بكل عمود مطاطي لتثبيت الأطراف.
  3. اربط شريطا مطاطيا واحدا بين العمودين المطاطيين العلويين ؛ اربط خيطا بالشريط المطاطي لتثبيت القواطع السفلية ؛ واربط خيطا آخر بالقضيب المعدني لتثبيت القواطع العلوية.
  4. تخدير ذكور الفئران البالغة من العمر 7 أسابيع بمحلول 0.1 مل من ديكسميديتوميدين هيدروكلوريد (0.1 ملغ·كغ-1· وزن الجسم) وزوليتيل (تيلتامين هيدروكلوريد ل 20 ملغ·كغ-1· وزن الجسم وزولازيبام هيدروكلوريد ل 20 ملغ·كغ-1· وزن الجسم) المذاب في محلول ملحي عن طريق الحقن داخل الصفاق قبل الجراحة. تأكد من أن الفئران تحت التخدير المناسب طوال العملية.
    ملاحظة: انتبه إلى تاريخ الاستخدام الفعال للأدوية ، ولا تستخدم الأدوية منتهية الصلاحية.
  5. تأكد من أن الفئران تحت التخدير المناسب عن طريق الضغط على أصابع الأطراف الخلفية بالأصابع.
    ملاحظة: إذا لم تستجب الفئران للاختبار ، فهذا يعني أنها فاقدة للوعي وأن التخدير قد وصل إلى العمق المطلوب. في ذلك الوقت ، تكون الفئران في حالة استرخاء عضلات الأطراف ، مع التنفس السلس ومعدل ضربات القلب ، ويمكن بدء العملية.
  6. استخدم مرهم الطبيب البيطري على عيون الفئران لمنع الجفاف ووضع الماوس المخدر في وضع ضعيف على طاولة العمليات. استخدم أربعة أشرطة مرنة على الأعمدة المطاطية لتثبيت الأطراف ، خيط واحد متصل بالقضيب المعدني لتثبيت القواطع العلوية وآخر متصل بشريط مطاطي بين العمودين المطاطيين العلويين للربط فوق القواطع السفلية لإبقاء الفك السفلي مفتوحا.
  7. قم بإعداد نوابض ملفوفة مغلقة (حجم سلك 0.25 مم ، قطر 0.76 مم ، طول 1 مم) لأجهزة قوة تقويم الأسنان.
    ملاحظة: قطع ثمانية خيوط من الربيع لكل ماوس. أربعة خيوط بطول 1 مم في المنتصف لجهاز القوة وخيطان على كل طرف للأربطة باستخدام سلك رباط فولاذي.
  8. ربط أحد طرفي الربيع المعد للضرس الأول الأيسر الفكي. اربط الطرف الآخر بالقاطعة المركزية بسلك رباط فولاذي 0.1 مم معزز براتنج ترميمي معالج بالضوء بعد وضع مادة لاصقة على القواطع باستخدام Q-tip لتوليد قوة مستقرة بحجم 10 g مقاسة باستخدام مقياس دينامومتر.
  9. بعد الانتهاء من العملية ، ضع الفئران في قفص مع آخرين من نفس السلالة في الانتعاش ، أو ضع كل فأر في قفص فارغ وحده. تأكد من عدم ترك الفئران دون مراقبة حتى تستعيد وعيها الكافي بعد 2-4 ساعات من العملية للحفاظ على الاستلقاء القصي. في الأيام القليلة المقبلة ، قم بإطعام الفئران نظاما غذائيا ناعما ومراقبتها بانتظام لضمان عدم حدوث مضاعفات والتأكد من درجة الألم بعد الجراحة ؛ تطبيق الأدوية المسكنة حسب الحاجة.
    ملاحظة: لا ينبغي إعادة الفئران التي خضعت لعملية جراحية إلى شركة الفئران الأخرى حتى تتعافى تماما. لا تضع الفئران بعد الجراحة في الشفاء مع الفئران التي لم يتم تخديرها. يجب أن تبقى الفئران دافئة أثناء الشفاء.
  10. افحص جهاز تقويم الأسنان كل يوم واستبعد أي فئران تجريبية مصابة بالإزاحة.

4. جمع العينات

  1. القتل الرحيم للفئران في ثلاث نقاط زمنية مختلفة عن طريق خلع عنق الرحم: 4 أيام (d4) ، 7 أيام (d7) ، و 10 أيام (d10) بعد بدء OTM.
  2. استخدم مقص العيون لقطع الجلد عموديا عن منطقة عنق الرحم ثم فصل الرأس عن الجسم مع تشريح جلد الرأس بالكامل.
  3. قطع الجلد والعضلات buccinator من angulus الثنائي oris إلى المنطقة الخلفية من الفك السفلي. افصل تماما عضلات الشدق والأوتار المرتبطة بالغرابي لإزالة الفك السفلي وتقليم العظام الزائدة للحصول على الفك العلوي الكامل. ثم ، قم بإزالة العظم خلف الأضراس الثالثة الثنائية وتمزيق الغشاء المخاطي الحنكي. أخيرا ، افصل جهاز تقويم الأسنان واقطع العظم بين القواطع على طول الخيط الحنكي المتوسط للحصول على العظم السنخي للجانبين الأيمن والأيسر.
    ملاحظة: تأكد من الحفاظ على المنطقة من القواطع إلى الضرس الثالث سليمة على كلا الجانبين.

5. التحضير لقسم البارافين

  1. التثبيت: اغمر العظم السنخي المحصود في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 48 ساعة وقم بتقليمه بمقص العيون في غطاء الدخان للقسمين 6 و 7.
  2. إزالة الكالكالس: اغسل العينات برفق باستخدام 1x PBS لمدة 3 × 10 دقائق. إزالة الكلسات من العينات في مثبت الأنسجة العالمي (درجة الحموضة 8.0) ، واستبدالها بمحلول جديد كل يومين ، لمدة 5 أسابيع حتى يمكن اختراق العظام بسهولة بواسطة طرف إبرة.
  3. الجفاف: اغسل العينات في 1x PBS لمدة 3 × 10 دقائق ، ثم اغمرها بالتتابع في 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول وزيلين لمدة 2 × 1 ساعة لكل محلول.
  4. اغمر العينات في مزيج 1: 1 من الزيلين والبارافين لمدة 30 دقيقة ثم في البارافين عند 65 درجة مئوية طوال الليل.
  5. التضمين: حدد خزانات التضمين المناسبة. ضع العظم السنخي بشكل موحد مع رفع الأسنان على نفس المستوى. قم بإزالة العينات من خزان التضمين وانقلها إلى مجمد -20 درجة مئوية ، ثم قم بترقيمها عندما يبرد البارافين تماما ويكون صلبا.
  6. باستخدام ميكروتوم ، قم بقطع عشرين إلى أربعين قسما بسمك 4 ميكرومتر بشكل مستمر في المستوى العرضي وتطفو على 37 درجة مئوية من الماء. قم بلصق الأقسام بشرائح المجهر واخبزها على حرارة 42 درجة مئوية طوال الليل.

6. قياس المسافة OTM

  1. صور عينات من ثلاث نقاط زمنية عموديا من مستوى الإطباق بواسطة المجهر الاستريو.
  2. افحص العظم السنخي باستخدام ماسح Micro-CT. إعادة بناء صور 3D للمستوى السهمي الأقصى للعظم السنخي الفكي العلوي ، حيث تكون ثلاثة أضراس مرئية تماما ، باستخدام برنامج دعم الماسح الضوئي باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  3. قياس مسافة OTM باستخدام برنامج ImageJ:
    1. افتح برنامج ImageJ واستخدم أداة الخط المستقيم لإنشاء قطعة خطية من المسافة المعروفة.
    2. انقر فوق تحليل واختر ضبط المقياس لإدخال قيمة مسافة الخط المرسوم في المسافة المعروفة وإدخال الوحدات بوحدة الطول.
    3. ارسم خطا بين نقاط المنتصف للحافة الهامشية المتوسطة ل M2 والحافة الهامشية البعيدة ل M1 وانقر فوق القياس. تمثل النتائج الموضحة في عمود الطول مسافة OTM.

7. التحليل النسيجي

  1. اختيار منطقة الاهتمام (ROI): حدد العظم السنخي للضرس الأول (M1) على أنه عائد الاستثمار ، الموجود بالضبط داخل ثلاثة جذور ل M1 في القسم العرضي عند عظم الفك العلوي. لا تصل هذه المنطقة إلى العظم القشري للضرس الأول في الاتجاه الشدقي اللساني فحسب ، بل تمتد أيضا إلى منتصف المحور الطويل لجذر منتصف الشدق ، بما في ذلك نصف المنطقة الواقعة بين جذر الشدق والجذر الحنكي.
  2. تحليل تكون العظم
    1. وضع العلامات والتحليل المزدوج على الكالسيين والأليزارين الأحمر
      1. تحضير الكالسيين والأليزارين الأحمر: يذوب الكالسيين في محلول NaHCO3 2٪ إلى 1 مجم / مل وأليزارين ريد إس في H 2 O إلى2مجم / مل.
        ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم الحصول على الكالسيين والأليزارين الأحمر تجاريا.
      2. يتم تطبيق الكالسيين (20 ملغ·كغ-1·وزن الجسم) في اليوم الأول وأليزارين ريد إس (40 ملغ·كغ-1·وزن الجسم) في اليوم 8 عن طريق الحقن داخل الصفاق بعد بدء استخدام OTM. القتل الرحيم للفئران في اليوم 10 وحصاد العظم السنخي.
      3. قم بإعداد العينات وتضمينها باتباع الخطوات 5.1 و 5.3-5.5. لمزيد من التفاصيل ، راجع Yang et al.30.
      4. باستخدام ميكروتوم دوار ، قم بقطع مقاطع بسمك 5 ميكرومتر بشكل مستمر في المستوى العرضي. التمسك المقاطع إلى شرائح المجهر وجبل مع أغطية باستخدام بلسم محايد.
        ملاحظة: يجب تخزين بقية العينات مع مادة مجففة في درجة حرارة الغرفة.
      5. فحص وتصوير الأقسام تحت المجهر الفلوري وحساب معدل تركيب المعادن (MAR) ومعدل تكوين العظام (BFR / BS) وفقا للطريقة الموضحة سابقا30.
    2. التألق المناعي
      1. اختر أقسام البارافين المناسبة واخبزها على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      2. إزالة الشمع: اغمر الأقسام في الزيلين لمدة 5 دقائق وكرر مرتين مع الزيلين الطازج في كل مرة.
      3. الإماهة: اغمر الأقسام بالتتابع في 95٪ إيثانول ، 75٪ إيثانول ، 50٪ إيثانول ، و ddH2O ، كل منها لمدة 5 دقائق.
      4. اغسل الأقسام برفق باستخدام 1 × PBS لمدة 2 × 5 دقائق.
      5. استرجاع المستضد: اغمر الأقسام في خليط من Tris-HCl (0.05 M ، pH 8.0) ، EDTA (0.01 M ، pH 8.0) ، والبروتياز K (10 ميكروغرام / مل) في ddH2O واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      6. اغسل الأقسام برفق باستخدام 1 × PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
      7. كتلة: قم بإزالة السوائل الزائدة من الأقسام وارسم دائرة حول المنطقة المستهدفة باستخدام علامة كارهة للماء. لمنع الربط غير النوعي ، قم بتغطيته بمخزن مؤقت مانع يحتوي على 10٪ من ألبومين مصل الأبقار واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
        ملاحظة: احرص على عدم تجفيف الأقسام لفترة طويلة ، حتى لا تؤثر على النتائج.
      8. حضانة الأجسام المضادة الأولية: تمييع الجسم المضاد للأوستيوبونتين (OPN) مع مخفف الأجسام المضادة إلى التركيز الموصى به ، وإضافة 30-50 ميكرولتر لكل عينة ؛ احتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها في غرفة مرطبة.
        ملاحظة: تأكد من ترك بعض الماء في الحجرة وتغطيته لمنع سائل الأجسام المضادة من التبخر.
      9. اغسل الأقسام برفق باستخدام 1 × PBS لمدة 3 × 10 دقائق.
        ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات 7.2.2.10-7.2.2.12 في الظلام.
      10. حضانة الأجسام المضادة الثانوية الفلورية: حدد جسما مضادا ثانويا فلوريا مناسبا يتوافق مع الجسم المضاد الأساسي وقم بتخفيفه إلى التركيز الموصى به. أضف 30-50 ميكرولتر لكل عينة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
      11. اغسل الأقسام برفق باستخدام 1 × PBS لمدة 2 × 10 دقائق.
      12. استخدم وسيط تركيب مضاد للتلاشي مع 4'6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) لتركيب العينات. قم بتخزين الأقسام في الظلام وتصويرها في أسرع وقت ممكن.
      13. قم بإجراء الفحص المجهري الفلوري الذي يتضمن كاميرا رقمية لفحص وتصوير الأقسام وحساب الخلايا الإيجابية في المناطق ذات الاهتمام (ROIs).
  3. تحليل تكوين العظم
    1. تلطيخ حمض الفوسفاتيز المقاوم للطرطرات (TRAP)
      1. حدد أقسام البارافين المناسبة. قم بإزالة الشمع وإعادة الترطيب باتباع الخطوات 7.2.2.1-7.2.2.3.
      2. قم بإعداد محلول تلطيخ جديد باستخدام مجموعة التلوين TRAP وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وقم بالتسخين المسبق إلى 37 درجة مئوية.
      3. أضف 30-50 ميكرولتر من محلول التلوين إلى كل عينة واحتضانها عند 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة لمدة 20-30 دقيقة. تحقق كل 5 دقائق حتى يتم رؤية الخلايا الآكلة للعظم الأحمر متعدد النوى تحت المجهر الضوئي. أوقف التفاعل مع ddH2O.
      4. مسحة مضادة في محلول الهيماتوكسيلين لمدة 30 ثانية وتغمر في محلول الأمونيا 1 ٪ لمدة 1 دقيقة للحصول على لون أزرق مستقر. شطف تحت ماء الصنبور بطيء الجريان.
      5. قم بتركيب الأقسام باستخدام أغطية باستخدام بلسم محايد وجففها طوال الليل.
      6. التقط صورا تحت المجهر واحسب عدد الخلايا الإيجابية ل TRAP التي تحتوي على أكثر من ثلاث نوى ، باتباع بروتوكولنا السابق30.
    2. التألق المناعي: استخدم الجسم المضاد للكاثيبسين K (CTSK) بالتركيز الموصى به للتألق المناعي واتبع البروتوكول الموضح في القسم 7 أعلاه.

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول ، أنشأنا ماوس Stat3 بالضربة القاضية الخاص بنسب بانيات العظم (Stat3Col1α2ERT2) لفحص آثار حذف STAT3 على إعادة تشكيل العظام السنخية المدفوعة بقوة تقويم الأسنان (الشكل 1A ، B). تم تأكيد حذف STAT3 في بانيات العظم من خلال تلطيخ العظم المناعي للعظم...

Discussion

نظرا لأن سوء الإطباق هو من بين أكثر اضطرابات الفم شيوعا التي تضعف التنفس والمضغ والتحدث وحتى المظهر ، فإن الطلب على تقويم الأسنان يتزايد يوما بعد يوم مع ارتفاع معدل الإصابة من 70٪ إلى 93٪ وفقا لمسح وبائي سابق31,32. أصبحت كيفية تسريع إعادة تشكيل العظام السنخية لر...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81870740 ، 82071083 ، 82271006 ، 82101048 ، 81800949) ؛ مؤسسة العلوم الطبيعية في شنغهاي (21ZR1436900 ، 22ZR1436700) ؛ برنامج شنغهاي الأكاديمي / قائد أبحاث التكنولوجيا (20XD1422300) ؛ خطة البحوث السريرية ل SHDC (SHDC2020CR4084) ؛ صندوق البحوث متعدد التخصصات لمستشفى الشعب التاسع في شنغهاي ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (JYJC201902 ، JYJC202116) ؛ فريق أبحاث الابتكار للجامعات المحلية رفيعة المستوى في شنغهاي (SSMUZLCX20180501) ؛ صندوق الانضباط البحثي رقم. KQYJXK2020 من مستشفى الشعب التاسع ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ ، وكلية طب الأسنان ، جامعة شنغهاي جياو تونغ. مشروع الاستكشاف الأصلي لمستشفى شنغهاي الشعبي التاسع ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (JYYC003) ؛ مشروع موهبة مائتي من كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ ؛ مشروع البحث التعاوني لمعهد المواد الحيوية والطب التجديدي كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (2022LHB02) ؛ مشروع البنك الحيوي لمستشفى الشعب التاسع في شنغهاي ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (YBKB201909 ، YBKB202216).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. P1020
4% paraformaldehydeWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1101
Alizarin redSigma-AldrichA5533
Anti-CTSK antibodySanta Cruzsc-48353
Anti-OPN antibodyR&D Systems, Minneapolis, MN, USAAF808
CalceinSigma-AldrichC0875
Closed-coil springsInnovative Material and Devices, Shanghai, ChinaCS1006B
Col1α2CreERT2 miceA gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences.
Dexmedetomidine hydrochlorideOrionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTABeyotime BiotechanologyST069
Embedding tanksCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd80106-1100-16
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.100092183
ImageJ softwareNIH, Bethesda, MD, USA
Mounting medium with DAPIBeyotime BiotechanologyP0131
Mouse dissection platformShanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd.HK105
ParaffinSangon biotech Co., Ltd.A601889
Primers for genotypingStat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease KSigma-Aldrich539480
Self-curing restorative resin3M ESPE, St. Paul, MN, USA712-035
Stat3fl/fl miceGemPharmatech Co., LtdD000527
TamoxifenSigma-AldrichT5648
TRAP staining kitSigma-Aldrich387A
Tris-HClBeyotime BiotechanologyST780
Universal tissue fixativeWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1105
XyleneSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10023418
ZoletilVIRBAC 

References

  1. Frost, H. M. The Utah paradigm of skeletal physiology: an overview of its insights for bone, cartilage and collagenous tissue organs. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 18 (6), 305-316 (2000).
  2. Frost, H. M. Wolff's Law and bone's structural adaptations to mechanical usage: an overview for clinicians. The Angle Orthodontist. 64 (3), 175-188 (1994).
  3. Gothlin, G., Ericsson, J. L. The osteoclast: review of ultrastructure, origin, and structure-function relationship. Clinical Orthopaedics and Related Research. (120), 201-231 (1976).
  4. Feng, X., Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: New Insights. Bone Research. 1 (1), 11-26 (2013).
  5. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  6. Zhu, L. X., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), eaaw6143 (2020).
  7. Dai, Q., et al. A RANKL-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mTORC1 in osteoclast formation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), 56468 (2018).
  8. Karsenty, G., Kronenberg, H. M., Settembre, C. Genetic control of bone formation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 629-648 (2009).
  9. Long, F. Building strong bones: molecular regulation of the osteoblast lineage. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (1), 27-38 (2011).
  10. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).
  11. Lang, T., et al. Cortical and trabecular bone mineral loss from the spine and hip in long-duration spaceflight. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (6), 1006-1012 (2004).
  12. Sibonga, J. D. Spaceflight-induced bone loss: is there an osteoporosis risk. Current Osteoporosis Reports. 11 (2), 92-98 (2013).
  13. Yang, Y., et al. Administration of allogeneic mesenchymal stem cells in lengthening phase accelerates early bone consolidation in rat distraction osteogenesis model. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 129 (2020).
  14. Huang, C., Holfeld, J., Schaden, W., Orgill, D., Ogawa, R. Mechanotherapy: revisiting physical therapy and recruiting mechanobiology for a new era in medicine. Trends in Molecular Medicine. 19 (9), 555-564 (2013).
  15. Shu, H. S., et al. Tracing the skeletal progenitor transition during postnatal bone formation. Cell Stem Cell. 28 (12), 2122-2136 (2021).
  16. Wang, X., et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation. Nature Medicine. 19 (1), 93-100 (2013).
  17. Huja, S. S., Fernandez, S. A., Hill, K. J., Li, Y. Remodeling dynamics in the alveolar process in skeletally mature dogs. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (12), 1243-1249 (2006).
  18. Jin, A., et al. FOXO3 mediates tooth movement by regulating force-induced osteogenesis. Journal of Dental Research. 101 (2), 196-205 (2022).
  19. Bumann, A., Carvalho, R. S., Schwarzer, C. L., Yen, E. H. Collagen synthesis from human PDL cells following orthodontic tooth movement. European Journal of Orthodontics. 19 (1), 29-37 (1997).
  20. Kitaura, H., et al. Effect of cytokines on osteoclast formation and bone resorption during mechanical force loading of the periodontal membrane. The Scientific World Journal. 2014, 617032 (2014).
  21. Lu, W., et al. Sclerostin injection enhances orthodontic tooth movement in rats. Archives of Oral Biology. 99, 43-50 (2019).
  22. Seki, Y., et al. Differentiation ability of Gli1(+) cells during orthodontic tooth movement. Bone. 166, 116609 (2023).
  23. Gong, X. Y., et al. Local orthodontic force initiates widespread remodelling of the maxillary alveolar bone. Australasian Orthodontic Journal. 36 (2), 175-183 (2020).
  24. Liu, Y., et al. STAT3 and its targeting inhibitors in osteosarcoma. Cell Proliferation. 54 (2), e12974 (2021).
  25. Guadagnin, E., Mazala, D., Chen, Y. W. STAT3 in skeletal muscle function and disorders. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2265 (2018).
  26. Saikia, B., et al. Clinical profile of hyper-IgE syndrome in India. Frontiers in Immunology. 12, 626593 (2021).
  27. van de Veen, W., et al. Impaired memory B-cell development and antibody maturation with a skewing toward IgE in patients with STAT3 hyper-IgE syndrome. Allergy. 74 (12), 2394-2405 (2019).
  28. Zhou, S. R., et al. STAT3 is critical for skeletal development and bone homeostasis by regulating osteogenesis. Nature Communications. 12 (1), 6891 (2021).
  29. Gong, X. Y., et al. Osteoblastic STAT3 is crucial for orthodontic force driving alveolar bone remodeling and tooth movement. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (1), 214-227 (2023).
  30. Yang, Y., et al. Skeletal phenotype analysis of a conditional Stat3 deletion mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), 61390 (2020).
  31. Egic, B. Prevalence of orthodontic malocclusion in schoolchildren in Slovenia. A prospective aepidemiological study. European Journal of Paediatric Dentistry. 23 (1), 39-43 (2022).
  32. Gois, E. G., et al. Incidence of malocclusion between primary and mixed dentitions among Brazilian children A 5-year longitudinal study. The Angle Orthodontist. 82 (3), 495-500 (2012).
  33. Yang, F., et al. Effects Of triptolide on tooth movement and root resorption in rats. Drug Design, Development and Therapy. 13, 3963-3975 (2019).
  34. Wang, C., Sun, H. Progress in gene knockout mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 35 (5), 784-794 (2019).
  35. Cao, H., et al. Force-induced Adrb2 in periodontal ligament cells promotes tooth movement. Journal of Dental Research. 93 (11), 1163-1169 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

197 STAT3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved