Uso de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível para estudar a remodelação óssea alveolar durante a movimentação ortodôntica

Resumo

Este estudo fornece um protocolo para o uso de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível para estudar a remodelação óssea sob força ortodôntica e descreve métodos para analisar a remodelação óssea alveolar durante a movimentação ortodôntica, esclarecendo a biologia mecânica esquelética.

Resumo

O osso alveolar, com alta taxa de rotatividade, é o osso que mais ativamente remodela o corpo. A movimentação dentária ortodôntica (MOT) é um processo artificial comum de remodelação óssea alveolar em resposta à força mecânica, mas o mecanismo subjacente permanece indefinido. Estudos anteriores não foram capazes de revelar o mecanismo preciso da remodelação óssea em qualquer tempo e espaço devido a restrições relacionadas ao modelo animal. O transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 (STAT3) é importante no metabolismo ósseo, mas seu papel nos osteoblastos durante a OTM não é claro. Para fornecer evidências in vivo de que o STAT3 participa da OTM em momentos específicos e, em particular, em células durante a OTM, geramos um modelo de camundongo knockout Stat3 específico para linhagem osteoblástica induzível por tamoxifeno, aplicamos força ortodôntica e analisamos o fenótipo do osso alveolar.

Microtomografia computadorizada (Micro-CT) e microscopia estéreo foram utilizadas para acessar a distância OTM. A análise histológica selecionou a área localizada dentro das três raízes do primeiro molar (M1) na secção transversal do osso maxilar como a região de interesse (ROI) para avaliar a atividade metabólica de osteoblastos e osteoclastos, indicando o efeito da força ortodôntica sobre o osso alveolar. Em suma, apresentamos um protocolo para o uso de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível para estudar a remodelação óssea sob força ortodôntica e descrever métodos para analisar a remodelação óssea alveolar durante a OTM, lançando assim uma nova luz sobre a biologia mecânica esquelética.

Introdução

Sabe-se que o osso está em constante reconstrução ao longo da vida, em resposta às forças mecânicas de acordo com a lei de Wolff ^1,2. A estimulação mecânica adequada, como a gravidade e o exercício diário, mantém a massa e a força óssea e previne a perda óssea, estimulando tanto os osteoblastos quanto os osteoclastos. Os osteoclastos, responsáveis pela reabsorção óssea3,4,5,6,7, e os osteoblastos, responsáveis pela formação ^{óssea8,9,10,} mantêm a homeostase óssea e funcionam conjuntamente no processo biológico de remodelação óssea. Por outro lado, na ausência de estímulos de carga, como em astronautas sob microgravidade de longa duração, os ossos sofrem perda de densidade mineral óssea de 10%, aumentando o risco de osteoporose^11,12. Além disso, terapias mecânicas não invasivas e convenientes, incluindo a ortodontia e a osteogênese por distração, têm surgido como tratamentos para doenças ósseas^13,14. Tudo isso tem mostrado que a força mecânica desempenha um papel crítico na manutenção da qualidade e quantidade óssea. Estudos recentes geralmente analisaram a remodelação óssea em resposta à carga mecânica utilizando modelos demorados, como testes de suspensão de roda corrida e de cauda, que geralmente levavam 4 semanas ou mais para simular carga ou descarga de força^15,16. Portanto, há demanda por um modelo animal conveniente e eficiente para o estudo da remodelação óssea impulsionada pela carga de força.

O osso alveolar é o mais ativo em termos de remodelação óssea, com alta taxa de turnover¹⁷. A movimentação dentária ortodôntica (MOT), um tratamento comum para más oclusões, é um processo artificial de remodelação óssea alveolar em resposta à força mecânica. No entanto, o OTM, que induz rápida remodelação^óssea18, também é uma maneira de economizar tempo para estudar os efeitos da força mecânica na remodelação óssea em comparação com outros modelos com um longo período experimental. Portanto, o OTM é um modelo ideal para estudar a remodelação óssea sob estímulos mecânicos. Vale ressaltar que o mecanismo de remodelação óssea alveolar muitas vezes é sensível ao tempo, sendo necessário observar as mudanças na remodelação óssea alveolar em determinados momentos após a modelagem. Com as vantagens duplas do controle temporal e espacial da recombinação de DNA e da especificidade tecidual, um modelo de camundongo knockout de gene condicional induzível é uma escolha adequada para estudos de OTM.

Convencionalmente, a remodelação óssea alveolar mediada por OTM tem sido dividida em zonas de tensão envolvendo a formação óssea e zonas de pressão envolvendo a reabsorção óssea 19,20,21, que é mais detalhada^, mas de difícil regulação. Além disso, Yuri e col. relataram que o tempo de formação óssea no OTM diferiu nos lados de tensão e compressão²². Além disso, um estudo anterior havia demonstrado que o primeiro molar poderia iniciar uma ampla remodelação do osso alveolar superior sob força ortodôntica, que não estava restrita às zonas de tensão e^pressão23. Portanto, selecionamos a área localizada dentro de três raízes de M1 no corte transversal do osso maxilar como a região de interesse (ROI) e descrevemos métodos para avaliar a atividade de osteoblastos e osteoclastos na mesma área para avaliar a remodelação óssea alveolar sob OTM.

Como fator de transcrição nuclear, o transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 (STAT3) tem se mostrado crítico na homeostase^óssea24,25. Estudos prévios relataram baixa densidade mineral óssea e fraturas patológicas recorrentes em camundongos mutantes Stat3 ^26,27. Nosso estudo prévio demonstrou que a deleção do Stat3 em osteoblastos Osx⁺ causou malformação craniofacial e osteoporose, bem como fratura óssea espontânea28. Recentemente, fornecemos evidências in vivo com um modelo induzível de camundongo com deleção osteoblasto-específica Stat3 (Col1α2^CreERT2; Stat3 fl^/fl, doravante denominado Stat3^{Col1α2ERT2) que o STAT3} é fundamental na mediação dos efeitos da força ortodôntica que impulsiona a remodelação óssea alveolar29. Neste estudo, apresentamos métodos e protocolos para o uso de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível para estudar a remodelação óssea sob força ortodôntica e descrevemos métodos para analisar a remodelação óssea alveolar durante a OTM, esclarecendo assim a biologia mecânica esquelética.

Protocolo

Todos os métodos envolvendo animais aqui descritos foram aprovados pelo comitê de ética do Shanghai Nono People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (nº 82101048).

1. Estabelecimento de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível

OBS: Camundongos Stat3 fl^/fl foram obtidos comercialmente; a cepa Col1α2^CreERT2foi um presente (veja a Tabela de Materiais para todos os detalhes). Água e ração padronizada em laboratório e condições ambientais padrão de laboratório (temperatura ambiente de 22 °C a 26 °C e umidade de 50%-55%) foram fornecidas para todos os animais.

1. Coloque um camundongo macho sexualmente maduro com dois camundongos fêmeas na mesma gaiola. Após 18 dias, verifique se há recém-nascidos todos os dias. Retire todas as ratas grávidas para uma gaiola vazia e mantenha-as sozinhas, se necessário. Coloque camundongos machos em outras gaiolas de reprodução diferentes se as fêmeas não estiverem grávidas dentro de 30 dias.
2. Gerar Stat3^fl/+; Camundongos Col1α2 CreERT2 hibridizando camundongos Stat3 fl^/fl com camundongos Col1α2^CreERT2; manter todos esses mouses no fundo C57BL/6. Coletar pontas de cauda de 2-5 mm para genotipagem e manter o macho Stat3^fl/+; Col1α2^CreERT2 camundongos até que estejam sexualmente maduros (F1).
3. Hibridizar machos de 6 semanas de idade Stat3^{fl/ +}; Col1α2^CreERT2 camundongos com fêmeas Stat3 fl^/fl. Coletar pontas da cauda de 2-5 mm quando os camundongos tiverem 2 semanas de idade para genotipagem, e manter o macho Stat3 fl^{/ fl}; Col1α2 CreERT2(Stat3^Col1α2ERT2) camundongos até que estejam sexualmente maduros (^F2).
4. Hibridizar machos de 6 semanas de idade Stat3 fl^{/ fl}; Col1α2^CreERT2 camundongos com fêmeas de Stat3 fl^/fl (F3). Coletar pontas de cauda de 2-5 mm quando os camundongos tiverem 2 semanas de idade para genotipagem e usar os camundongos mais jovens do mesmo genótipo para substituir camundongos reprodutores mais velhos quando apropriado (F3+N).
   NOTA: A capacidade reprodutiva dos ratinhos diminui após os 8 meses de idade, pelo que os ratinhos nas gaiolas de reprodução devem ser cuidadosamente monitorizados e substituídos conforme necessário. Além disso, de acordo com os requisitos experimentais, o número de gaiolas de reprodução deve ser adequadamente aumentado para evitar a extinção dos camundongos do gene alvo.

2. Deleção induzível de Stat3 em osteoblastos que expressam Col1α2 pelo tamoxifeno

1. Dissolva o tamoxifeno em óleo de milho a 20 mg/mL em um tubo de centrífuga e proteja da luz envolvendo papel alumínio. Coloque o tubo centrífugo coberto com folha num misturador rotativo e misture à temperatura ambiente até dissolver completamente.
   NOTA: O tamoxifeno foi obtido comercialmente e armazenado no escuro a 4 °C.
2. Selecione dez camundongos machos de 6 semanas de idade e divida-os em grupos Stat3 fl^/fl e Stat3 ^Col1α2ERT2 com cinco camundongos em cada grupo. Administrar tamoxifeno (100 mg·^kg-1·pc) a cada 2 dias durante 1 semana por injeção intraperitoneal.

3. Modelo de movimentação dentária ortodôntica (MOTO)

1. Prepare uma plataforma de dissecção plástica esterilizada de camundongos como mesa cirúrgica para imobilizar os camundongos.
   OBS: A mesa de dissecção de camundongos foi obtida comercialmente e consistia de quatro pinos de borracha ajustáveis e uma haste metálica para imobilização dos camundongos. Use instrumentos e ferramentas estéreis durante todo o procedimento.
2. Fixe um elástico em cada poste de borracha para fixação do membro.
3. Amarre um elástico entre os dois postes superiores de borracha; amarrar um fio no elástico para prender os incisivos inferiores; e amarre outro fio à haste metálica para segurar os incisivos superiores.
4. Anestesiar camundongos machos com 7 semanas de idade com 0,1 mL de solução de cloridrato de dexmedetomidina (0,1 mg·kg-1·pc) e zoletil (cloridrato de tiletamina para 20 mg·kg-1·bw e cloridrato de zolazepam para 20 mg·^kg-1·bw) dissolvidos em solução salina por injeção intraperitoneal antes da cirurgia. Certifique-se de que os ratos estão sob anestesia adequada durante toda a operação.
   OBS: Fique atento à data de uso efetivo dos medicamentos e não utilize medicamentos vencidos.
5. Confirme se os ratos estão sob anestesia adequada, apertando os dedos dos pés dos membros posteriores com os dedos.
   NOTA: Se os ratos não responderem ao teste, significa que estão inconscientes e a anestesia atingiu a profundidade desejada. Nesse momento, os ratos estão em um estado de relaxamento muscular dos membros, com respiração suave e frequência cardíaca, e a operação pode ser iniciada.
6. Use pomada veterinária nos olhos dos ratos para evitar o ressecamento e coloque o camundongo anestesiado na posição supina na mesa de cirurgia. Use quatro faixas elásticas nos postes de borracha para fixar os membros, um fio preso à haste de metal para segurar os incisivos superiores e outro preso a um elástico entre os dois pinos de borracha superiores para prender sobre os incisivos inferiores para manter a mandíbula inferior aberta.
7. Prepare molas helicoidais fechadas (fio de 0,25 mm, diâmetro de 0,76 mm, comprimento de 1 mm) para aparelhos de força ortodôntica.
   NOTA: Corte oito fios de mola para cada mouse. Quatro roscas de 1 mm de comprimento no meio para o aparelho de força e duas roscas em cada extremidade para ligadura usando fio de ligadura de aço.
8. Ligate uma extremidade da mola preparada para o primeiro molar superior esquerdo. Ligate a outra extremidade do incisivo central com um fio de ligadura de aço 0,1 mm reforçado por resina restauradora fotopolimerizável após a aplicação de adesivo nos incisivos com a ponta Q para gerar uma força estável de magnitude de 10 g medida com o uso de um dinamômetro.
9. Depois de completar a operação, coloque os ratos em uma gaiola com outros da mesma cepa em recuperação, ou coloque cada camundongo em uma gaiola vazia sozinho. Certifique-se de que os ratos não sejam deixados sozinhos até que tenham recuperado a consciência suficiente 2-4 h após a operação para manter a decúbito esternal. Nos próximos dias, alimente os ratos com uma dieta suave e observe-os regularmente para garantir que nenhuma complicação ocorra e para verificar o grau de dor pós-cirúrgica; administrar fármacos analgésicos conforme necessário.
   NOTA: Os ratos que foram submetidos a cirurgia não devem ser devolvidos à companhia de outros ratos até estarem totalmente recuperados. Não coloque camundongos pós-cirúrgicos em recuperação com camundongos que não estão anestesiados. Os ratos devem ser mantidos aquecidos durante a recuperação.
10. Verifique o aparelho ortodôntico todos os dias e exclua qualquer camundongo experimental com deslocamento.

4. Coleta de espécimes

1. Eutanasiar os camundongos em três momentos diferentes via deslocamento cervical: 4 dias (d4), 7 dias (d7) e 10 dias (d10) após o início da OTM.
2. Use tesoura oftálmica para cortar a pele verticalmente da região cervical e, em seguida, separar a cabeça do corpo com toda a pele da cabeça dissecada.
3. Cortar a pele e os músculos bucinadores do ângulo oral bilateral até a região posterior da mandíbula. Desconectar completamente os músculos bucais e os tendões ligados aos coracoides para remover a mandíbula e aparar ossos extras para obter maxilas completas. Em seguida, remova o osso atrás dos terceiros molares bilaterais e retire a mucosa palatina. Por fim, desconecte o aparelho ortodôntico e corte o osso entre os incisivos ao longo da sutura palatina mediana para obter o osso alveolar dos lados direito e esquerdo.
   OBS: Certifique-se de que a região dos incisivos ao terceiro molar seja mantida intacta em ambos os lados.

5. Preparação para secção em parafina

1. Fixação: Imergir o osso alveolar retirado em paraformaldeído a 4% por 48 h e aparar com tesoura oftálmica no exaustor para os cortes 6 e 7.
2. Descalcificação: Lavar suavemente os espécimes com 1x PBS por 3 x 10 min. Descalcificar os espécimes em fixador tecidual universal (pH 8,0), substituído por solução fresca a cada 2 dias, por 5 semanas até que os ossos possam ser facilmente penetrados por uma ponta de agulha.
3. Desidratação: Lavar os espécimes em 1x PBS por 3 x 10 min e, em seguida, mergulhá-los sequencialmente em etanol 95%, etanol 100% e xileno, por 2 x 1 h cada solução.
4. Imergir os espécimes numa mistura 1:1 de xileno e parafina durante 30 minutos e, em seguida, em parafina a 65 °C durante a noite.
5. Incorporação: Selecione tanques de incorporação adequados. Coloque o osso alveolar uniformemente com os dentes para cima no mesmo nível. Retire as amostras do tanque de incorporação e transfira-as para um congelador de -20 °C e, em seguida, numere-as quando a parafina estiver totalmente resfriada e sólida.
6. Usando um micrótomo, corte seções de vinte a quarenta e 4 μm de espessura continuamente no plano transversal e flutue sobre água a 37 °C. Aderir as seções às lâminas do microscópio e assar a 42 °C durante a noite.

6. Medição de distância OTM

1. Fotografar espécimes de três momentos verticalmente do plano oclusal por microscopia estéreo.
2. Escanear o osso alveolar com um scanner de Micro-CT. Reconstruir imagens 3D do plano sagital máximo do osso alveolar maxilar, no qual três molares são completamente visíveis, usando o software de suporte do scanner seguindo as instruções do fabricante.
3. Meça a distância OTM usando o software ImageJ:
   1. Abra o software ImageJ e use a ferramenta Linha reta para criar um segmento de linha de distância conhecida.
   2. Clique em Analisar e escolha Definir Escala para inserir o valor da distância da linha desenhada em Distância conhecida e insira unidades em Unidade de comprimento.
   3. Traçar uma linha entre os pontos médios da crista marginal mesial de M2 e a crista marginal distal de M1 e clicar em Medição. Os resultados mostrados na coluna Comprimento representam a distância OTM.

7. Análise histológica

1. Seleção da Região de Interesse (ROI): Define o osso alveolar do primeiro molar (M1) como a ROI, localizada exatamente dentro das três raízes de M1 na secção transversal no osso maxilar. Essa região não atinge apenas a cortical do primeiro molar no sentido buco-lingual, mas também se estende até o meio do longo eixo da raiz mesiobucal, incluindo a meia área entre a raiz distobucal e a raiz palatina.
2. Análise da osteogênese
   1. Dupla marcação e análise de calceína e alizarina vermelha
      1. Preparação de calceína e vermelho de alizarina: Dissolver a calceína em solução de NaHCO₃ a 2% para 1 mg/mL e o vermelho de alizarina S em H 2 O a₂mg/mL.
         NOTA: Neste estudo, calceína e vermelho de alizarina foram obtidos comercialmente.
      2. Administrar calceína (20 mg·kg-1·pc) no dia 1 e alizarina vermelha S (40 mg·^kg-1·pc) no dia 8 por injeção intraperitoneal após o início da OTM. Eutanasiar os camundongos no dia 10 e colher o osso alveolar.
      3. Preparar amostras e incorporá-las seguindo os passos 5.1 e 5.3-5.5. Para mais detalhes, consultar Yang et ^al.30.
      4. Usando um micrótomo rotativo, corte cortes de 5 μm de espessura continuamente no plano transversal. Adera as seções às lâminas do microscópio e monte com lamínulas usando bálsamo neutro.
         NOTA: O restante das amostras deve ser armazenado com dessecante à temperatura ambiente.
      5. Examinar e fotografar os cortes em microscópio de fluorescência e calcular a taxa de aposição mineral (MAR) e a taxa de formação óssea (BFR/BS) de acordo com o método descrito anteriormente³⁰.
   2. Imunofluorescência
      1. Selecione seções de parafina adequadas e leve ao forno a 65 °C por 30 min.
      2. Desparafinação: Mergulhe as seções em xileno por 5 min e repita duas vezes com xileno fresco de cada vez.
      3. Reidratação: Imergir as seções sequencialmente em etanol 95%, etanol 75%, etanol 50% e ddH₂O, cada um por 5 min.
      4. Lave suavemente as seções com 1 x PBS por 2 x 5 min.
      5. Recuperação de antígenos: Imergir os cortes em uma mistura de Tris-HCl (0,05 M, pH 8,0), EDTA (0,01 M, pH 8,0) e protease K (10 μg/mL) em ddH₂O e incubar a 37 °C por 15 min.
      6. Lave suavemente as seções com 1 x PBS por 3 x 5 min.
      7. Bloco: Retire o líquido extra das seções e desenhe um círculo ao redor da área alvo usando um marcador hidrofóbico. Para bloquear a ligação inespecífica, cobrir com um tampão de bloqueio contendo 10% de albumina de soro bovino e incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
         NOTA: Tenha cuidado para não secar as seções por muito tempo, para não afetar os resultados.
      8. Incubação primária de anticorpos: Diluir o anticorpo anti-osteopontina (OPN) com diluente de anticorpos na concentração recomendada e adicionar 30-50 μL a cada amostra; incubar a 4 °C durante a noite numa câmara humidificada.
         NOTA: Certifique-se de deixar um pouco de água na câmara e cobri-la para evitar que o fluido de anticorpos evapore.
      9. Lave suavemente as seções com 1 x PBS por 3 x 10 min.
         NOTA: As etapas 7.2.2.10-7.2.2.12 devem ser executadas no escuro.
      10. Incubação de anticorpos secundários fluorescentes: Selecione um anticorpo secundário fluorescente apropriado correspondente ao anticorpo primário e dilua-o na concentração recomendada. Adicionar 30-50 μL a cada amostra e incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
      11. Lave suavemente as seções com 1 x PBS por 2 x 10 min.
      12. Use um meio de montagem antifade com 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para montar os espécimes. Guarde as seções no escuro e fotografe-as o mais rápido possível.
      13. Realizar microscopia de fluorescência incorporando uma câmera digital para examinar e fotografar os cortes e contar células positivas nas regiões de interesse (ROIs).
3. Análise da osteoclastogênese
   1. Coloração de fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP)
      1. Selecione seções de parafina adequadas. Descerpar e reidratar seguindo os passos 7.2.2.1-7.2.2.3.
      2. Prepare uma solução de coloração fresca utilizando o kit de coloração TRAP de acordo com as instruções do fabricante e pré-aqueça a 37°C.
      3. Adicionar 30-50 μL de solução corante a cada amostra e incubar a 37 °C numa câmara humidificada durante 20-30 min. Verifique a cada 5 min até que osteoclastos multinucleados vermelhos sejam vistos sob um microscópio de luz. Pare a reação com ddH2O.
      4. Contracoloração em solução de hematoxilina por 30 s e imersão em solução de amônia a 1% por 1 min para obter uma cor azul estável. Enxágue em água da torneira de corrente lenta.
      5. Monte as seções com lamínulas usando bálsamo neutro e seque durante a noite.
      6. Capturar fotografias ao microscópio e contar o número de células positivas para TRAP com mais de três núcleos, seguindo nosso protocolo prévio³⁰.
   2. Imunofluorescência: Use o anticorpo catepsina K (CTSK) na concentração recomendada para imunofluorescência e siga o protocolo descrito na seção 7 acima.

Resultados

Usando esse protocolo, estabelecemos um modelo induzível de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica (Stat3^Col1α2ERT2) para examinar os efeitos da deleção STAT3 na remodelação óssea alveolar dirigida por força ortodôntica (Figura 1A,B). A deleção STAT3 em osteoblastos foi confirmada pela coloração por imunofluorescência do osso alveolar (Figura 1C).

Discussão

Como a má oclusão está entre os distúrbios bucais mais comuns, prejudicando a respiração, a mastigação, a fala e até mesmo a aparência, a demanda por ortodontia vem aumentando a cada dia, com a incidência subindo de 70% para 93%, segundo levantamento epidemiológico^prévio31,32. Como acelerar a remodelação óssea alveolar para aumentar a eficiência do tratamento ortodôntico com segurança tornou-se um tópico quente nessa área; portanto, é necess...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P1020
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1101
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A5533
Anti-CTSK antibody	Santa Cruz	sc-48353
Anti-OPN antibody	R&D Systems, Minneapolis, MN, USA	AF808
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Closed-coil springs	Innovative Material and Devices, Shanghai, China	CS1006B
Col1α2CreERT2 mice			A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences.
Dexmedetomidine hydrochloride	Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTA	Beyotime Biotechanology	ST069
Embedding tanks	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	80106-1100-16
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	100092183
ImageJ software	NIH, Bethesda, MD, USA
Mounting medium with DAPI	Beyotime Biotechanology	P0131
Mouse dissection platform	Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd.	HK105
Paraffin	Sangon biotech Co., Ltd.	A601889
Primers for genotyping			Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease K	Sigma-Aldrich	539480
Self-curing restorative resin	3M ESPE, St. Paul, MN, USA	712-035
Stat3fl/fl mice	GemPharmatech Co., Ltd	D000527
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648
TRAP staining kit	Sigma-Aldrich	387A
Tris-HCl	Beyotime Biotechanology	ST780
Universal tissue fixative	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1105
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10023418
Zoletil	VIRBAC