Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışma, ortodontik kuvvet altında kemiğin yeniden şekillenmesini incelemek için indüklenebilir osteoblast soyuna özgü Stat3 nakavt farelerin kullanılması için bir protokol sağlar ve ortodontik diş hareketi sırasında alveolar kemiğin yeniden şekillenmesini analiz etme yöntemlerini açıklar, böylece iskelet mekanik biyolojisine ışık tutar.

Özet

Yüksek devir hızına sahip alveol kemiği, vücuttaki en aktif şekilde yeniden şekillenen kemiktir. Ortodontik diş hareketi (OTM), mekanik kuvvete yanıt olarak alveolar kemiğin yeniden şekillenmesinin yaygın bir yapay işlemidir, ancak altta yatan mekanizma belirsizliğini korumaktadır. Önceki çalışmalar, hayvan modeliyle ilgili kısıtlamalar nedeniyle herhangi bir zaman ve mekanda kemiğin yeniden şekillenmesinin kesin mekanizmasını ortaya çıkaramamıştır. Transkripsiyon 3'ün (STAT3) sinyal dönüştürücüsü ve aktivatörü kemik metabolizmasında önemlidir, ancak OTM sırasında osteoblastlardaki rolü belirsizdir. STAT3'ün OTM'ye belirli zaman noktalarında ve OTM sırasında belirli hücrelere katıldığına dair in vivo kanıt sağlamak için, tamoksifen ile indüklenebilir osteoblast soyuna özgü bir Stat3 nakavt fare modeli oluşturduk, ortodontik kuvvet uyguladık ve alveolar kemik fenotipini analiz ettik.

Mikrobilgisayarlı tomografi (Mikro-BT) ve stereo mikroskopi kullanılarak OTM mesafesi sağlandı. Histolojik analiz, ortodontik kuvvetin alveolar kemik üzerindeki etkisini gösteren osteoblastların ve osteoklastların metabolik aktivitesini değerlendirmek için maksiller kemiğin enine kesitinde birinci azı dişinin (M1) üç kökü içinde yer alan alanı ilgilenilen bölge (ROI) olarak seçti. Kısacası, ortodontik kuvvet altında kemik yeniden şekillenmesini incelemek ve OTM sırasında alveolar kemiğin yeniden şekillenmesini analiz etmek için yöntemleri tanımlamak için indüklenebilir osteoblast soyuna özgü Stat3 nakavt fareleri kullanmak için bir protokol sunuyoruz, böylece iskelet mekanik biyolojisine yeni bir ışık tutuyoruz.

Giriş

Wolff yasası 1,2'ye göre mekanik kuvvetlere yanıt olarak kemiğin yaşam boyunca sürekli yeniden yapılanma altında olduğu genel olarak bilinmektedir. Yerçekimi ve günlük egzersiz gibi uygun mekanik stimülasyon, kemik kütlesini ve gücünü korur ve hem osteoblastları hem de osteoklastları uyararak kemik kaybını önler. Kemik rezorpsiyonundan sorumlu osteoklastlar 3,4,5,6,7 ve kemik oluşumundan sorumlu osteoblastlar 8,9,10, kemik homeostazını korur ve kemiğin yeniden şekillenmesinin biyolojik sürecinde birlikte işlev görür. Buna karşılık, uzun süreli mikro yerçekimi altındaki astronotlarda olduğu gibi, yükleme uyaranlarının yokluğunda, kemikler %10 kemik mineral yoğunluğu kaybına uğrar ve böylece osteoporoz riskini artırır11,12. Ayrıca, ortodonti ve distraksiyon osteogenezisi de dahil olmak üzere noninvaziv ve uygun mekanik tedaviler kemik hastalıklarının tedavileri olarak ortaya çıkmıştır13,14. Bütün bunlar, mekanik kuvvetin kemik kalitesini ve miktarını korumada kritik bir rol oynadığını göstermiştir. Son çalışmalar genellikle, kuvvet yükleme veya boşaltmayı simüle etmek için genellikle 4 hafta veya daha fazla süren koşu tekerleği ve kuyruk süspansiyon testleri gibi zaman alıcı modeller kullanılarak mekanik yüklemeye yanıt olarak kemiğin yeniden şekillenmesini analiz etti15,16. Bu nedenle, kuvvet yüklemesi tarafından yönlendirilen kemik yeniden şekillenmesini incelemek için uygun ve verimli bir hayvan modeline talep vardır.

Alveolar kemik, yüksek devir hızı ile kemiğin yeniden şekillenmesi açısından en aktif olanıdır17. Maloklüzyon için yaygın bir tedavi olan ortodontik diş hareketi (OTM), mekanik kuvvete yanıt olarak yapay bir alveol kemiği yeniden şekillenme işlemidir. Bununla birlikte, hızlı kemik yeniden şekillenmesini18 indükleyen OTM, aynı zamanda, uzun bir deney periyoduna sahip diğer modellere kıyasla mekanik kuvvetin kemik yeniden şekillenmesi üzerindeki etkilerini incelemek için zaman kazandıran bir yoldur. Bu nedenle, OTM, mekanik uyaranlar altında kemiğin yeniden şekillenmesini incelemek için ideal bir modeldir. Alveol kemiğinin yeniden şekillenme mekanizmasının genellikle zamana duyarlı olması dikkat çekicidir ve modellemeden sonra belirli zaman noktalarında alveol kemiğinin yeniden şekillenmesindeki değişiklikleri gözlemlemek gerekir. DNA rekombinasyonunun ve doku özgüllüğünün zamansal ve uzamsal kontrolünün ikili avantajları ile, indüklenebilir koşullu gen nakavt fare modeli, OTM çalışmaları için uygun bir seçimdir.

Geleneksel olarak, OTM aracılı alveolar kemik yeniden şekillenmesi, kemik oluşumunu içeren gerilim bölgelerine ve kemik rezorpsiyonunu içeren basınç bölgelerine ayrılmıştır 19,20,21, bu daha ayrıntılı ancak düzenlenmesi zordur. Ayrıca Yuri ve ark. OTM'de kemik oluşum zamanının gerilim ve kompresyon taraflarında farklılık gösterdiğini bildirmişlerdir22. Ek olarak, daha önce yapılan bir çalışma, birinci azı dişinin, ortodontik kuvvet altında maksiller alveolar kemiğin geniş bir şekilde yeniden şekillenmesini başlatabildiğini ve bunun gerginlik ve basınç bölgeleriyle sınırlı olmadığını göstermiştir23. Bu nedenle, maksiller kemiğin enine kesitinde M1'in üç kökü içinde yer alan alanı ilgilenilen bölge (ROI) olarak seçtik ve OTM altında alveolar kemik yeniden şekillenmesini değerlendirmek için aynı bölgedeki osteoblastların ve osteoklastların aktivitesini değerlendirmek için yöntemler tanımladık.

Bir nükleer transkripsiyon faktörü olarak, sinyal transdüseri ve transkripsiyon 3'ün aktivatörünün (STAT3) kemik homeostazında kritik olduğu kanıtlanmıştır24,25. Önceki çalışmalar, Stat3-mutant farelerde düşük kemik mineral yoğunluğu ve tekrarlayan patolojik kırıklar bildirmiştir26,27. Önceki çalışmamız, Osx + osteoblastlarında Stat3 silinmesinin kraniyofasiyal malformasyon ve osteoporozun yanı sıra spontan kemik kırığına neden olduğunu göstermiştir28. Son zamanlarda, indüklenebilir osteoblasta özgü bir Stat3 delesyon fare modeli (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, bundan sonra Stat3Col1α2ERT2 olarak anılacaktır) STAT3'ün ortodontik kuvveti tahrik eden alveolar kemiğin yeniden şekillenmesinin etkilerine aracılık etmede kritik olduğunu29. Bu çalışmada, ortodontik kuvvet altında kemik yeniden şekillenmesini incelemek için indüklenebilir osteoblast soyuna özgü Stat3 nakavt farelerin kullanımına yönelik yöntemler ve protokoller sunuyoruz ve OTM sırasında alveolar kemik yeniden şekillenmesini analiz etme yöntemlerini açıklıyoruz, böylece iskelet mekanik biyolojisine ışık tutuyoruz.

Protokol

Burada açıklanan hayvanları içeren tüm yöntemler, Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi (no. 82101048) etik komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. İndüklenebilir osteoblast soyuna özgü Stat3 nakavt farelerinin oluşturulması

NOT: Stat3 fl/fl fareler ticari olarak elde edilmiştir; Col1α2CreERT2suşu bir hediyeydi (tüm ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın). Tüm hayvanlar için standartlaştırılmış laboratuvar pelet yemi ve suyu ve standart laboratuvar çevre koşulları (22 °C ila 26 °C oda sıcaklığı ve %50-55 nem oranı) sağlandı.

  1. Cinsel olarak olgun bir erkek fareyi iki dişi fareyle aynı kafese koyun. 18 gün sonra, her gün yenidoğanları kontrol edin. Hamile dişi fareleri boş bir kafese alın ve gerekirse yalnız tutun. Dişi fareler 30 gün içinde hamile kalmazsa, erkek fareleri diğer farklı üreme kafeslerine koyun.
  2. Stat3fl/+ oluşturun; Stat3 fl/ fl fareleri Col1α2 CreERT2 fareleri ile melezleştirerek Col1α2 CreERT2 fareleri; tüm bu fareleri C57BL/6 arka planında tutun. Genotipleme için 2-5 mm kuyruk uçları toplayın ve erkek Stat3fl/+'yı tutun; Kol1α2CreERT2 fareleri cinsel olarak olgunlaşana kadar (F1).
  3. 6 haftalık erkek Stat3fl / +'yı melezleyin; Dişi Stat3 fl/fl farelere sahipCol1α2 CreERT2 fareleri. Fareler genotipleme için 2 haftalıkken 2-5 mm kuyruk uçları toplayın ve erkek Stat3 fl/ fl'yi tutun; Kol1α2 CreERT2 (Stat3Kol1α2ERT2) fareleri cinsel olarak olgunlaşana kadar (F2).
  4. 6 haftalık erkek Stat3 fl/ fl'yi melezleyin; Dişi Stat3 fl/fl farelere (F3) sahipCol1α2 CreERT2 fareler. Fareler genotipleme için 2 haftalıkken 2-5 mm kuyruk uçları toplayın ve uygun olduğunda daha yaşlı üreme farelerini değiştirmek için aynı genotipteki genç fareleri kullanın (F3 + N).
    NOT: Farelerin üreme kapasitesi 8 aylıktan sonra azalır, bu nedenle üreme kafeslerindeki fareler dikkatle izlenmeli ve gerektiğinde değiştirilmelidir. Ek olarak, deneysel gereksinimlere göre, hedef gen farelerinin neslinin tükenmesini önlemek için üreme kafeslerinin sayısı uygun şekilde artırılmalıdır.

2. Kol1α2 eksprese eden osteoblastlarda tamoksifen tarafından Stat3'ün indüklenebilir silinmesi

  1. Tamoksifeni mısır yağında bir santrifüj tüpünde 20 mg / mL'ye kadar çözün ve folyoya sararak ışıktan koruyun. Folyo kaplı santrifüj tüpünü döner bir karıştırıcıya koyun ve tamamen eriyene kadar oda sıcaklığında karıştırın.
    NOT: Tamoksifen ticari olarak elde edildi ve karanlıkta 4 ° C'de saklandı.
  2. On adet 6 haftalık erkek fare seçin ve bunları her grupta beş fare olacak şekilde Stat3 fl/fl ve Stat3Col1α2ERT2 gruplarına bölün. İntraperitoneal enjeksiyon ile 1 hafta boyunca her 2 günde bir tamoksifen (100 mg · kg-1 · canlı ağırlık) uygulayın.

3. Ortodontik diş hareketi (OTM) modeli

  1. Fareleri hareketsiz hale getirmek için ameliyat masası olarak sterilize edilmiş bir plastik fare diseksiyon platformu hazırlayın.
    NOT: Fare diseksiyon masası ticari olarak elde edildi ve fareleri hareketsiz hale getirmek için dört ayarlanabilir kauçuk direk ve bir metal çubuktan oluşuyordu. Prosedür boyunca steril aletler ve aletler kullanın.
  2. Uzuv sabitlemesi için her lastik direğe elastik bir bant takın.
  3. İki üst lastik direk arasına bir elastik bant bağlayın; alt kesici dişleri tutmak için elastik banda bir iplik bağlayın; ve üst kesici dişleri tutmak için metal çubuğa başka bir iplik bağlayın.
  4. 7 haftalık erkek fareleri 0.1 mL deksmedetomidin hidroklorür (0.1 mg·kg-1· canlı ağırlık) ve zoletil (20 mg·kg-1· canlı ağırlık için tiletamin hidroklorür ve 20 mg · kg-1 · canlı ağırlık için zolazepam hidroklorür) çözeltisi ile anestezi altına alın. Farelerin operasyon boyunca uygun anestezi altında olduğundan emin olun.
    NOT: İlaçların etkin kullanım tarihine dikkat ediniz ve son kullanma tarihi geçmiş ilaçları kullanmayınız.
  5. Arka bacakların ayak parmaklarını parmaklarınızla sıkarak farelerin uygun anestezi altında olduğunu doğrulayın.
    NOT: Fareler teste cevap vermezse, bilinçsiz oldukları ve anestezinin istenen derinliğe ulaştığı anlamına gelir. O zaman, fareler düzgün nefes alma ve kalp atış hızı ile uzuv kası gevşemesi durumundadır ve operasyon başlatılabilir.
  6. Kuruluğu önlemek için farelerin gözlerine veteriner merhemi kullanın ve anestezi uygulanmış fareyi ameliyat masasına sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Uzuvları sabitlemek için lastik direkler üzerinde dört elastik bant kullanın, üst kesici dişleri tutmak için metal çubuğa bağlı bir iplik ve alt çeneyi açık tutmak için alt kesici dişlerin üzerine asmak için iki üst lastik direk arasındaki elastik bir banda tutturulmuş bir başka iplik kullanın.
  7. Ortodontik kuvvet apareyi için kapalı helezon yaylar (0,25 mm tel boyutu, 0,76 mm çap, 1 mm uzunluk) hazırlayın.
    NOT: Her fare için sekiz yay ipliği kesin. Kuvvet cihazı için ortada 1 mm uzunluğunda dört diş ve çelik ligatür tel kullanarak ligatüre etmek için her iki uçta iki diş.
  8. Yayın bir ucu üst çene sol birinci azı dişine hazırlanır. Bir dinamometre kullanılarak ölçülen 10 g büyüklüğünde sabit bir kuvvet oluşturmak için Q ucu ile kesici dişlere yapıştırıcı uyguladıktan sonra, diğer ucunu ışıkla sertleşen restoratif reçine ile güçlendirilmiş 0,1 mm'lik bir çelik bağ teli ile merkezi kesici dişin merkezine bağlayın.
  9. İşlemi tamamladıktan sonra, fareleri iyileşme sürecinde aynı suştaki diğerleriyle birlikte bir kafese koyun veya her fareyi tek başına boş bir kafese koyun. Sternal yaslığı korumak için ameliyattan 2-4 saat sonra yeterli bilinci yeniden kazanana kadar farelerin gözetimsiz bırakılmadığından emin olun. Önümüzdeki birkaç gün boyunca, fareleri yumuşak bir diyetle besleyin ve herhangi bir komplikasyon oluşmadığından emin olmak ve ameliyat sonrası ağrının derecesini belirlemek için düzenli olarak gözlemleyin; Gerektiğinde analjezik ilaçlar uygulayın.
    NOT: Ameliyat geçiren fareler, tamamen iyileşene kadar diğer farelerin şirketine iade edilmemelidir. Ameliyat sonrası fareleri, anestezi uygulanmayan farelerle iyileşmeye koymayın. İyileşme sırasında fareler sıcak tutulmalıdır.
  10. Ortodontik apareyleri her gün kontrol edin ve yerinden çıkmış deney farelerini hariç tutun.

4. Örnek toplama

  1. Fareleri servikal çıkık yoluyla üç farklı zaman noktasında ötenazi yapın: OTM'nin başlamasından 4 gün (d4), 7 gün (d7) ve 10 gün (d10).
  2. Cildi servikal bölgeden dikey olarak kesmek için oftalmik makas kullanın ve ardından başın tüm derisi diseke edilerek kafayı vücuttan ayırın.
  3. Cildi ve buccinator kaslarını bilateral angulus oris'ten mandibulanın arka bölgesine kesin. Mandibulayı çıkarmak için bukkal kasları ve korakoidlere bağlı tendonları tamamen ayırın ve tam maksilla elde etmek için ekstra kemikleri kesin. Ardından, iki taraflı üçüncü azı dişlerinin arkasındaki kemiği çıkarın ve damak mukozasını yırtın. Son olarak, ortodontik apareyin bağlantısını kesin ve sağ ve sol taraftaki alveol kemiğini elde etmek için median palatin sütür boyunca kesici dişler arasındaki kemiği kesin.
    NOT: Kesici dişlerden üçüncü azı dişine kadar olan bölgenin her iki tarafta da sağlam tutulduğundan emin olun.

5. Parafin bölümü için hazırlık

  1. Fiksasyon: Hasat edilen alveol kemiğini 48 saat boyunca %4 paraformaldehite daldırın ve 6. ve 7. bölümler için çeker ocakta oftalmik makasla düzeltin.
  2. Dekalsifikasyon: Numuneleri 1x PBS ile 3 x 10 dakika boyunca nazikçe yıkayın. Kemiklere bir iğne ucu ile kolayca nüfuz edene kadar 5 hafta boyunca her 2 günde bir taze çözelti ile değiştirilen üniversal doku fiksatifinde (pH 8.0) örnekleri kireçten arındırın.
  3. Dehidrasyon: Numuneleri 1x PBS'de 3 x 10 dakika yıkayın ve ardından sırayla her çözelti için 2 x 1 saat boyunca %95 etanol, %100 etanol ve ksilen içine daldırın.
  4. Numuneleri 30 dakika boyunca 1:1 ksilen ve parafin karışımına ve ardından gece boyunca 65 °C'de parafine daldırın.
  5. Gömme: Uygun gömme tanklarını seçin. Alveol kemiğini, dişleri aynı seviyede olacak şekilde düzgün bir şekilde yerleştirin. Numuneleri gömme tankından çıkarın ve -20 °C'lik bir dondurucuya aktarın, ardından parafin tamamen soğuduğunda ve katılaştığında numaralandırın.
  6. Bir mikrotom kullanarak, enine düzlemde sürekli olarak yirmi ila kırk 4 μm kalınlığında kesitler kesin ve 37 °C su üzerinde yüzdürün. Bölümleri mikroskop lamlarına yapıştırın ve gece boyunca 42 °C'de pişirin.

6. OTM mesafe ölçümü

  1. Stereo mikroskopi ile oklüzal düzlemden dikey olarak üç zaman noktasından örnekleri fotoğraflayın.
  2. Alveol kemiğini bir Mikro-BT tarayıcı ile tarayın. Maksiller alveolar kemiğin maksimum sagital düzleminin, üç azı dişinin tamamen görülebildiği 3D görüntülerini, üreticinin talimatlarını izleyerek tarayıcının destekleyici yazılımını kullanarak yeniden oluşturun.
  3. ImageJ yazılımını kullanarak OTM mesafesini ölçün:
    1. ImageJ yazılımını açın ve mesafesi bilinen bir çizgi parçası oluşturmak için Düz çizgi aracını kullanın.
    2. Analiz Et'e tıklayın ve çizilen çizgi mesafesinin değerini Bilinen mesafe'ye girmek ve Uzunluk birimi'ne birimleri girmek için Ölçeği Ayarla'yı seçin.
    3. M2'nin mesial marjinal sırtının orta noktaları ile M1'in distal marjinal sırtı arasına bir çizgi çizin ve Ölçüm'e tıklayın. Uzunluk sütununda gösterilen sonuçlar OTM mesafesini temsil eder.

7. Histolojik analiz

  1. İlgilenilen Bölge (ROI) seçimi: Birinci azı dişinin (M1) alveolar kemiğini, maksiller kemikteki enine kesitte tam olarak M1'in üç kökü içinde yer alan ROI olarak tanımlayın. Bu bölge sadece bukkal-lingual yönde birinci azı dişinin kortikal kemiğine ulaşmakla kalmaz, aynı zamanda distobukkal kök ile damak kökü arasındaki yarım alan da dahil olmak üzere mezobukkal kökün uzun ekseninin ortasına kadar uzanır.
  2. Osteogenez analizi
    1. Calcein ve alizarin kırmızısı çift etiketleme ve analiz
      1. Kalsein ve alizarin kırmızısı preparatı:% 2 NaHCO3 çözeltisinde kalseini 1 mg / mL'ye ve alizarin kırmızısı S'yiH2Oila 2 mg / mL'ye çözün.
        NOT: Bu çalışmada kalsein ve alizarin kırmızısı ticari olarak elde edilmiştir.
      2. OTM'nin başlamasından sonra intraperitoneal enjeksiyon ile 1. günde kalsein (20 mg · kg-1 · canlı ağırlık) ve 8. günde alizarin kırmızı S (40 mg · kg-1 · canlı ağırlık) uygulayın. Fareleri 10. günde ötenazi yapın ve alveolar kemiği toplayın.
      3. Numuneleri hazırlayın ve 5.1 ve 5.3-5.5 adımlarını izleyerek gömün. Daha fazla ayrıntı için Yang ve ark.30'a bakın.
      4. Döner bir mikrotom kullanarak, enine düzlemde sürekli olarak 5 μm kalınlığında kesitler kesin. Bölümleri mikroskop slaytlarına yapıştırın ve nötr balsam kullanarak lameller ile monte edin.
        NOT: Numunelerin geri kalanı oda sıcaklığında kurutucu ile saklanmalıdır.
      5. Kesitleri bir floresan mikroskobu altında inceleyin ve fotoğraflayın ve daha önce açıklanan yönteme göre mineral atama oranını (MAR) ve kemik oluşum hızını (BFR/BS) hesaplayın30.
    2. İmmünofloresan
      1. Uygun parafin bölümlerini seçin ve 65 °C'de 30 dakika pişirin.
      2. Mum Alma: Bölümleri 5 dakika ksilene batırın ve her seferinde taze ksilen ile iki kez tekrarlayın.
      3. Rehidrasyon: Bölümleri sırayla %95 etanol, %75 etanol, %50 etanol ve ddH2O'ya her biri 5 dakika daldırın.
      4. Bölümleri 1 x PBS ile 2 x 5 dakika boyunca nazikçe yıkayın.
      5. Antijen alımı: Bölümleri ddH2O'da Tris-HCl (0.05 M, pH 8.0), EDTA (0.01 M, pH 8.0) ve proteaz K (10 μg/mL) karışımına daldırın ve 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
      6. Bölümleri 1 x PBS ile 3 x 5 dakika boyunca nazikçe yıkayın.
      7. Engelle: Bölümlerden fazla sıvıyı çıkarın ve hidrofobik bir işaretleyici kullanarak hedef alanın etrafına bir daire çizin. Spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için,% 10 sığır serum albümini içeren bir bloke edici tampon ile örtün ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
        NOT: Sonuçları etkilememek için bölümleri çok uzun süre kurutmamaya dikkat edin.
      8. Birincil antikor inkübasyonu: Anti-osteopontin (OPN) antikorunu önerilen konsantrasyona kadar antikor seyreltici ile seyreltin ve her numuneye 30-50 μL ekleyin; Nemlendirilmiş bir odada gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
        NOT: Antikor sıvısının buharlaşmasını önlemek için haznede biraz su bıraktığınızdan ve üzerini kapattığınızdan emin olun.
      9. Bölümleri 1 x PBS ile 3 x 10 dakika boyunca nazikçe yıkayın.
        NOT: 7.2.2.10-7.2.2.12 adımları karanlıkta gerçekleştirilmelidir.
      10. Floresan sekonder antikor inkübasyonu: Primer antikora karşılık gelen uygun bir floresan sekonder antikor seçin ve önerilen konsantrasyona seyreltin. Her numuneye 30-50 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
      11. Bölümleri 1 x PBS ile 2 x 10 dakika boyunca nazikçe yıkayın.
      12. Numuneleri monte etmek için 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren bir antifade montaj ortamı kullanın. Bölümleri karanlıkta saklayın ve mümkün olan en kısa sürede fotoğraflayın.
      13. Bölümleri incelemek ve fotoğraflamak ve ilgilenilen bölgelerdeki (ROI'ler) pozitif hücreleri saymak için bir dijital kamera içeren floresan mikroskobu gerçekleştirin.
  3. Osteoklastogenez analizi
    1. Tartarat dirençli asit fosfataz (TRAP) boyama
      1. Uygun parafin bölümlerini seçin. 7.2.2.1-7.2.2.3 adımlarını izleyerek mumdan arındırın ve yeniden sulandırın.
      2. Üreticinin talimatlarına göre TRAP boyama kitini kullanarak taze boyama solüsyonu hazırlayın ve 37°C'ye ısıtın.
      3. Her numuneye 30-50 μL boyama solüsyonu ekleyin ve 37 °C'de nemlendirilmiş bir odada 20-30 dakika inkübe edin. Işık mikroskobu altında kırmızı çok çekirdekli osteoklastlar görülene kadar her 5 dakikada bir kontrol edin. ddH2O ile reaksiyonu durdurun.
      4. Hematoksilen çözeltisinde 30 saniye boyunca lekeleyin ve sabit mavi renk için 1 dakika boyunca% 1 amonyak çözeltisine daldırın. Yavaş akan musluk suyu altında durulayın.
      5. Bölümleri nötr balsam kullanarak lamel ile monte edin ve gece boyunca kurutun.
      6. Mikroskop altında fotoğraf çekin ve önceki protokolümüz30'u izleyerek üçten fazla çekirdeğe sahip TRAP pozitif hücrelerin sayısını sayın.
    2. İmmünofloresan: İmmünofloresan için önerilen konsantrasyonda katepsin K (CTSK) antikoru kullanın ve yukarıdaki bölüm 7'de açıklanan protokolü izleyin.

Sonuçlar

Bu protokolü kullanarak, STAT3 delesyonunun ortodontik kuvvete dayalı alveolar kemik yeniden şekillenmesi üzerindeki etkilerini incelemek için indüklenebilir bir osteoblast soyuna özgü Stat3 nakavt fare (Stat3Col1α2ERT2) modeli oluşturduk (Şekil 1A,B). Osteoblastlarda STAT3 delesyonu, alveolar kemiğin immünofloresan boyaması ile doğrulandı (Şekil 1C).

Stereo mikroskopi, WT...

Tartışmalar

Maloklüzyon nefes almayı, çiğnemeyi, konuşmayı ve hatta görünümü bozan en yaygın oral bozukluklar arasında yer aldığından, ortodontiye olan talep her geçen gün artmaktadır ve daha önceki bir epidemiyolojik araştırmaya göre görülme sıklığı %70'ten %93'e yükselmektedir31,32. Ortodontik tedavinin etkinliğini güvenli bir şekilde artırmak için alveolar kemik yeniden şekillenmesinin nasıl hızlandırılacağı bu alanda sıcak bir ko...

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); Şanghay Doğa Bilimleri Vakfı (21ZR1436900, 22ZR1436700); Şangay Akademik/Teknoloji Araştırma Lideri Programı (20XD1422300); SHDC Klinik Araştırma Planı (SHDC2020CR4084); Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi Disiplinlerarası Araştırma Fonu (JYJC201902, JYJC202116); Şanghay'daki Üst Düzey Yerel Üniversitelerin İnovasyon Araştırma Ekibi (SSMUZLCX20180501); Araştırma Disiplin Fonu no. Dokuzuncu Halk Hastanesi, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi ve Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Stomatoloji Fakültesi'nden KQYJXK2020; Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi (JYYC003) Orijinal Keşif Projesi; Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin İki Yüz Yetenek Projesi; Biyomalzemeler ve Rejeneratif Tıp Enstitüsü Ortak Araştırma Projesi Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi (2022LHB02); Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi Biobank Projesi, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi (YBKB201909, YBKB202216).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. P1020
4% paraformaldehydeWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1101
Alizarin redSigma-AldrichA5533
Anti-CTSK antibodySanta Cruzsc-48353
Anti-OPN antibodyR&D Systems, Minneapolis, MN, USAAF808
CalceinSigma-AldrichC0875
Closed-coil springsInnovative Material and Devices, Shanghai, ChinaCS1006B
Col1α2CreERT2 miceA gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences.
Dexmedetomidine hydrochlorideOrionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTABeyotime BiotechanologyST069
Embedding tanksCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd80106-1100-16
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.100092183
ImageJ softwareNIH, Bethesda, MD, USA
Mounting medium with DAPIBeyotime BiotechanologyP0131
Mouse dissection platformShanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd.HK105
ParaffinSangon biotech Co., Ltd.A601889
Primers for genotypingStat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease KSigma-Aldrich539480
Self-curing restorative resin3M ESPE, St. Paul, MN, USA712-035
Stat3fl/fl miceGemPharmatech Co., LtdD000527
TamoxifenSigma-AldrichT5648
TRAP staining kitSigma-Aldrich387A
Tris-HClBeyotime BiotechanologyST780
Universal tissue fixativeWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1105
XyleneSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10023418
ZoletilVIRBAC 

Referanslar

  1. Frost, H. M. The Utah paradigm of skeletal physiology: an overview of its insights for bone, cartilage and collagenous tissue organs. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 18 (6), 305-316 (2000).
  2. Frost, H. M. Wolff's Law and bone's structural adaptations to mechanical usage: an overview for clinicians. The Angle Orthodontist. 64 (3), 175-188 (1994).
  3. Gothlin, G., Ericsson, J. L. The osteoclast: review of ultrastructure, origin, and structure-function relationship. Clinical Orthopaedics and Related Research. (120), 201-231 (1976).
  4. Feng, X., Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: New Insights. Bone Research. 1 (1), 11-26 (2013).
  5. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  6. Zhu, L. X., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), eaaw6143 (2020).
  7. Dai, Q., et al. A RANKL-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mTORC1 in osteoclast formation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), 56468 (2018).
  8. Karsenty, G., Kronenberg, H. M., Settembre, C. Genetic control of bone formation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 629-648 (2009).
  9. Long, F. Building strong bones: molecular regulation of the osteoblast lineage. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (1), 27-38 (2011).
  10. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).
  11. Lang, T., et al. Cortical and trabecular bone mineral loss from the spine and hip in long-duration spaceflight. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (6), 1006-1012 (2004).
  12. Sibonga, J. D. Spaceflight-induced bone loss: is there an osteoporosis risk. Current Osteoporosis Reports. 11 (2), 92-98 (2013).
  13. Yang, Y., et al. Administration of allogeneic mesenchymal stem cells in lengthening phase accelerates early bone consolidation in rat distraction osteogenesis model. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 129 (2020).
  14. Huang, C., Holfeld, J., Schaden, W., Orgill, D., Ogawa, R. Mechanotherapy: revisiting physical therapy and recruiting mechanobiology for a new era in medicine. Trends in Molecular Medicine. 19 (9), 555-564 (2013).
  15. Shu, H. S., et al. Tracing the skeletal progenitor transition during postnatal bone formation. Cell Stem Cell. 28 (12), 2122-2136 (2021).
  16. Wang, X., et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation. Nature Medicine. 19 (1), 93-100 (2013).
  17. Huja, S. S., Fernandez, S. A., Hill, K. J., Li, Y. Remodeling dynamics in the alveolar process in skeletally mature dogs. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (12), 1243-1249 (2006).
  18. Jin, A., et al. FOXO3 mediates tooth movement by regulating force-induced osteogenesis. Journal of Dental Research. 101 (2), 196-205 (2022).
  19. Bumann, A., Carvalho, R. S., Schwarzer, C. L., Yen, E. H. Collagen synthesis from human PDL cells following orthodontic tooth movement. European Journal of Orthodontics. 19 (1), 29-37 (1997).
  20. Kitaura, H., et al. Effect of cytokines on osteoclast formation and bone resorption during mechanical force loading of the periodontal membrane. The Scientific World Journal. 2014, 617032 (2014).
  21. Lu, W., et al. Sclerostin injection enhances orthodontic tooth movement in rats. Archives of Oral Biology. 99, 43-50 (2019).
  22. Seki, Y., et al. Differentiation ability of Gli1(+) cells during orthodontic tooth movement. Bone. 166, 116609 (2023).
  23. Gong, X. Y., et al. Local orthodontic force initiates widespread remodelling of the maxillary alveolar bone. Australasian Orthodontic Journal. 36 (2), 175-183 (2020).
  24. Liu, Y., et al. STAT3 and its targeting inhibitors in osteosarcoma. Cell Proliferation. 54 (2), e12974 (2021).
  25. Guadagnin, E., Mazala, D., Chen, Y. W. STAT3 in skeletal muscle function and disorders. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2265 (2018).
  26. Saikia, B., et al. Clinical profile of hyper-IgE syndrome in India. Frontiers in Immunology. 12, 626593 (2021).
  27. van de Veen, W., et al. Impaired memory B-cell development and antibody maturation with a skewing toward IgE in patients with STAT3 hyper-IgE syndrome. Allergy. 74 (12), 2394-2405 (2019).
  28. Zhou, S. R., et al. STAT3 is critical for skeletal development and bone homeostasis by regulating osteogenesis. Nature Communications. 12 (1), 6891 (2021).
  29. Gong, X. Y., et al. Osteoblastic STAT3 is crucial for orthodontic force driving alveolar bone remodeling and tooth movement. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (1), 214-227 (2023).
  30. Yang, Y., et al. Skeletal phenotype analysis of a conditional Stat3 deletion mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), 61390 (2020).
  31. Egic, B. Prevalence of orthodontic malocclusion in schoolchildren in Slovenia. A prospective aepidemiological study. European Journal of Paediatric Dentistry. 23 (1), 39-43 (2022).
  32. Gois, E. G., et al. Incidence of malocclusion between primary and mixed dentitions among Brazilian children A 5-year longitudinal study. The Angle Orthodontist. 82 (3), 495-500 (2012).
  33. Yang, F., et al. Effects Of triptolide on tooth movement and root resorption in rats. Drug Design, Development and Therapy. 13, 3963-3975 (2019).
  34. Wang, C., Sun, H. Progress in gene knockout mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 35 (5), 784-794 (2019).
  35. Cao, H., et al. Force-induced Adrb2 in periodontal ligament cells promotes tooth movement. Journal of Dental Research. 93 (11), 1163-1169 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 197Ortodontik Di HareketiKemik MetabolizmasMekanik KuvvetHayvan ModeliSTAT3 n Osteoblastlardaki RolTamoksifen ile nd klenebilir Fare ModeliOrtodontik KuvvetAlveolar Kemik FenotipiMikro BTStereo MikroskopiHistolojik AnalizOsteoblastlarOsteoklastlar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır