Uso de ratones knockout Stat3 específicos del linaje osteoblástico inducible para estudiar la remodelación del hueso alveolar durante el movimiento de los dientes de ortodoncia

Resumen

Este estudio proporciona un protocolo para el uso de ratones knockout Stat3 específicos del linaje osteoblástico inducible para estudiar la remodelación ósea bajo fuerza ortodóncica y describe métodos para analizar la remodelación ósea alveolar durante el movimiento dental de ortodoncia, arrojando así luz sobre la biología mecánica esquelética.

Resumen

El hueso alveolar, con una alta tasa de recambio, es el hueso que más activamente remodela en el cuerpo. El movimiento dental ortodóncico (OTM) es un proceso artificial común de remodelación ósea alveolar en respuesta a la fuerza mecánica, pero el mecanismo subyacente sigue siendo difícil de alcanzar. Estudios anteriores no han podido revelar el mecanismo preciso de la remodelación ósea en ningún momento y espacio debido a las restricciones relacionadas con los modelos animales. El transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3) es importante en el metabolismo óseo, pero su papel en los osteoblastos durante la OTM no está claro. Para proporcionar evidencia in vivo de que STAT3 participa en OTM en puntos de tiempo específicos y en células particulares durante OTM, generamos un modelo de ratón knockout Stat3 específico del linaje osteoblástico inducible por tamoxifeno, aplicamos fuerza ortodóncica y analizamos el fenotipo óseo alveolar.

Se utilizó microtomografía computarizada (Micro-TC) y microscopía estereoscópica para acceder a la distancia OTM. El análisis histológico seleccionó el área ubicada dentro de tres raíces del primer molar (M1) en la sección transversal del hueso maxilar como la región de interés (ROI) para evaluar la actividad metabólica de osteoblastos y osteoclastos, indicando el efecto de la fuerza ortodóncica sobre el hueso alveolar. En resumen, proporcionamos un protocolo para el uso de ratones knockout Stat3 específicos del linaje osteoblástico inducible para estudiar la remodelación ósea bajo fuerza ortodóncica y describimos métodos para analizar la remodelación ósea alveolar durante la OTM, arrojando así nueva luz sobre la biología mecánica esquelética.

Introducción

Es generalmente conocido que el hueso está en constante reconstrucción a lo largo de la vida, en respuesta a fuerzas mecánicas de acuerdo con la ley de Wolff ^1,2. La estimulación mecánica adecuada, como la gravedad y el ejercicio diario, mantiene la masa ósea y la fuerza y previene la pérdida ósea al estimular tanto los osteoblastos como los osteoclastos. Los osteoclastos, responsables de la resorción ósea 3,4,5,6,7, y los osteoblastos, responsables de la formación ósea ^8,9,10, mantienen la homeostasis ósea y funcionan conjuntamente en el proceso biológico de remodelación ósea. Por el contrario, en ausencia de estímulos de carga, como en los astronautas sometidos a microgravedad a largo plazo, los huesos sufren una pérdida de densidad mineral ósea del 10%, aumentando así el riesgo de osteoporosis^11,12. Además, las terapias mecánicas no invasivas y convenientes, como la ortodoncia y la osteogénesis por distracción, han surgido como tratamientos para las enfermedades óseas^13,14. Todo esto ha demostrado que la fuerza mecánica juega un papel fundamental en el mantenimiento de la calidad y cantidad de los huesos. En general, estudios recientes analizaron la remodelación ósea en respuesta a la carga mecánica utilizando modelos que consumen mucho tiempo, como las pruebas de suspensión de la rueda y la cola, que generalmente tardaron 4 semanas o más en simular la carga o descarga forzada^15,16. Por lo tanto, existe la demanda de un modelo animal conveniente y eficiente para estudiar la remodelación ósea impulsada por la carga de fuerza.

El hueso alveolar es el más activo en términos de remodelado óseo, con una alta tasa de recambio¹⁷. El movimiento dental ortodóncico (OTM), un tratamiento común para la maloclusión, es un proceso artificial de remodelación ósea alveolar en respuesta a la fuerza mecánica. Sin embargo, la OTM, que induce un rápido remodelado óseo¹⁸, es también una forma de ahorrar tiempo para estudiar los efectos de la fuerza mecánica sobre el remodelado óseo en comparación con otros modelos con un largo período experimental. Por lo tanto, la OTM es un modelo ideal para estudiar el remodelado óseo bajo estímulos mecánicos. Cabe destacar que el mecanismo de remodelación ósea alveolar suele ser sensible al tiempo, y es necesario observar los cambios en la remodelación ósea alveolar en ciertos momentos después del modelado. Con las ventajas duales del control temporal y espacial de la recombinación del ADN y la especificidad tisular, un modelo de ratón knockout de genes condicionales inducible es una opción adecuada para los estudios de OTM.

Convencionalmente, el remodelado óseo alveolar mediado por OTM se ha dividido en zonas de tensión que involucran la formación ósea y zonas de presión que involucran la resorción ósea 19,20,21^, que es más detallada pero difícil de regular. Además, Yuri et al. reportaron que el tiempo de formación ósea en OTM difirió en los lados de tensión y compresión²². Además, un estudio previo había demostrado que el primer molar podía iniciar una amplia remodelación del hueso alveolar maxilar bajo la fuerza ortodóncica, que no estaba constreñida a las zonas de tensión y presión²³. Por lo tanto, seleccionamos el área ubicada dentro de tres raíces de M1 en la sección transversal del hueso maxilar como la región de interés (ROI) y describimos métodos para evaluar la actividad de osteoblastos y osteoclastos en la misma área para evaluar el remodelado óseo alveolar bajo OTM.

Como factor de transcripción nuclear, el transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3) ha demostrado ser crítico en la homeostasis ósea^24,25. Estudios previos han reportado baja densidad mineral ósea y fracturas patológicas recurrentes en ratones con mutación Stat3 ^26,27. Nuestro estudio previo demostró que la deleción de Stat3 en osteoblastos Osx⁺ causaba malformación craneofacial y osteoporosis, así como fractura ósea espontánea²⁸. Recientemente, proporcionamos evidencia in vivo con un modelo de ratón de deleción Stat3 específico de osteoblasto inducible (Col1α2^CreERT2; Stat3 fl^/fl, en lo sucesivo denominado Stat3^{Col1α2ERT2) que STAT3} es fundamental para mediar los efectos de la fuerza ortodóncica que impulsa la remodelación ósea alveolar²⁹. En este estudio, proporcionamos métodos y protocolos para el uso de ratones knockout Stat3 específicos del linaje osteoblástico inducible para estudiar la remodelación ósea bajo fuerza ortodóncica y describimos métodos para analizar la remodelación ósea alveolar durante la OTM, arrojando así luz sobre la biología mecánica esquelética.

Protocolo

Todos los métodos con animales descritos aquí fueron aprobados por el comité de ética del Noveno Hospital Popular de Shanghái, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (n.º 82101048).

1. Establecimiento de ratones knockout Stat3 específicos del linaje osteoblástico inducible

NOTA: Los ratones^{Stat3 fl/fl} se obtuvieron comercialmente; la cepa Col1α2^CreERT2fue un regalo (consulte la Tabla de materiales para obtener todos los detalles). Se proporcionaron alimentos y agua en gránulos de laboratorio estandarizados y condiciones ambientales estándar de laboratorio (temperatura ambiente de 22 °C a 26 °C y humedad del 50 % al 55 %) para todos los animales.

1. Pon un ratón macho sexualmente maduro con dos ratones hembra en la misma jaula. Después de 18 días, revise si hay recién nacidos todos los días. Retira a los ratones hembra preñados a una jaula vacía y mantenlos solos si es necesario. Coloque a los ratones machos en otras jaulas de cría diferentes si las hembras no están preñadas dentro de los 30 días.
2. Generar Stat3^fl/+; ratones Col1α2 CreERT2 mediante la hibridación de ratones ^{Stat3 fl/fl} con ratones Col1α2^CreERT2; mantener todos estos ratones en el fondo C57BL/6. Recoja las puntas de la cola de 2-5 mm para el genotipado y mantenga el macho Stat3^fl/+; Ratones Col1α2^CreERT2 hasta que alcanzan la madurez sexual (F1).
3. Hibridar macho de 6 semanas de edad Stat3^{fl/ +}; Ratones Col1α2^CreERT2 con ratones hembra Stat3 fl^/fl. Recoja las puntas de la cola de 2-5 mm cuando los ratones tengan 2 semanas de edad para el genotipado, y mantenga el macho Stat3 fl^{/ fl}; Ratones Col1α2 CreERT2(Stat3^Col1α2ERT2) hasta que alcanzan la madurez sexual (^F2).
4. Hibridar macho Stat3 de 6 semanas de edad fl^/fl; Ratones Col1α2^CreERT2 con ratones ^{hembra Stat3 fl/fl} (F3). Recoja las puntas de la cola de 2 a 5 mm cuando los ratones tengan 2 semanas de edad para el genotipado, y use los ratones más jóvenes del mismo genotipo para reemplazar a los ratones reproductores más viejos cuando sea apropiado (F3 + N).
   NOTA: La capacidad reproductiva de los ratones disminuye después de los 8 meses de edad, por lo que los ratones en las jaulas de cría deben ser monitoreados cuidadosamente y reemplazados según sea necesario. Además, de acuerdo con los requisitos experimentales, el número de jaulas reproductoras debe aumentarse adecuadamente para evitar la extinción de los ratones genéticamente diana.

2. Deleción inducible de Stat3 en osteoblastos que expresan Col1α2 por tamoxifeno

1. Disuelva el tamoxifeno en aceite de maíz a 20 mg/ml en un tubo de centrífuga y protéjalo de la luz envolviéndolo en papel de aluminio. Coloque el tubo de centrífuga cubierto con papel de aluminio en una batidora rotativa y mezcle a temperatura ambiente hasta que se disuelva por completo.
   NOTA: El tamoxifeno se obtuvo comercialmente y se almacenó en la oscuridad a 4 °C.
2. Seleccione diez ratones machos de 6 semanas de edad y divídalos en grupos Stat3 fl^/fl y Stat3 ^Col1α2ERT2 con cinco ratones en cada grupo. Administrar tamoxifeno (100 mg·^kg-1·pc) cada 2 días durante 1 semana mediante inyección intraperitoneal.

3. Modelo de movimiento dental de ortodoncia (OTM)

1. Prepare una plataforma de disección de ratones de plástico esterilizada como mesa de operaciones para inmovilizar a los ratones.
   NOTA: La mesa de disección de ratones se obtuvo comercialmente y consistía en cuatro postes de goma ajustables y una varilla de metal para inmovilizar a los ratones. Utilice instrumentos y herramientas estériles durante todo el procedimiento.
2. Coloque una banda elástica en cada poste de goma para la fijación de las extremidades.
3. Ata una banda elástica entre los dos postes de goma superiores; atar un hilo a la banda elástica para sujetar los incisivos inferiores; y ata otro hilo a la varilla de metal para sujetar los incisivos superiores.
4. Anestesiar ratones machos de 7 semanas de edad con una solución de 0,1 ml de clorhidrato de dexmedetomidina (0,1 mg·kg-1·pc) y zoletil (clorhidrato de tiletamina para 20 mg·kg-1·bw y clorhidrato de zolazepam para 20 mg·^kg-1·bw) disueltos en solución salina mediante inyección intraperitoneal antes de la cirugía. Asegúrese de que los ratones estén bajo la anestesia adecuada durante toda la operación.
   NOTA: Preste atención a la fecha de uso efectivo de los medicamentos y no use medicamentos vencidos.
5. Confirme que los ratones están bajo la anestesia adecuada apretando los dedos de las extremidades traseras con los dedos.
   NOTA: Si los ratones no responden a la prueba, significa que están inconscientes y que la anestesia ha alcanzado la profundidad deseada. En ese momento, los ratones se encuentran en un estado de relajación muscular de las extremidades, con respiración y frecuencia cardíaca suaves, y se puede iniciar la operación.
6. Use ungüento veterinario en los ojos de los ratones para evitar la sequedad y coloque al ratón anestesiado en posición supina en la mesa de operaciones. Use cuatro bandas elásticas en los postes de goma para fijar las extremidades, un hilo unido a la varilla de metal para sujetar los incisivos superiores y otro unido a una banda elástica entre los dos postes de goma superiores para enganchar sobre los incisivos inferiores para mantener abierta la mandíbula inferior.
7. Prepare resortes helicoidales cerrados (tamaño de alambre de 0,25 mm, diámetro de 0,76 mm, longitud de 1 mm) para el aparato de fuerza de ortodoncia.
   NOTA: Corta ocho hilos de resorte para cada ratón. Cuatro hilos de 1 mm de longitud en el centro para el dispositivo de fuerza y dos hilos en cada extremo para ligadura con alambre de ligadura de acero.
8. Ligar un extremo del resorte preparado para el primer molar maxilar izquierdo. Lime el otro extremo del incisivo central con un alambre de ligadura de acero de 0,1 mm reforzado con resina restauradora fotopolimerizable después de aplicar adhesivo a los incisivos con el hisopo para generar una fuerza estable de una magnitud de 10 g medida mediante el uso de un dinamómetro.
9. Después de completar la operación, coloque a los ratones en una jaula con otros de la misma cepa en recuperación, o coloque a cada ratón solo en una jaula vacía. Asegúrese de que los ratones no se dejen desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente 2-4 h después de la operación para mantener la decúbito esternal. Durante los próximos días, alimente a los ratones con una dieta blanda y obsérvelos regularmente para asegurarse de que no se produzcan complicaciones y determinar el grado de dolor postquirúrgico; Administre medicamentos analgésicos según sea necesario.
   NOTA: Los ratones que se han sometido a cirugía no deben devolverse a la compañía de otros ratones hasta que estén completamente recuperados. No ponga ratones posquirúrgicos en recuperación con ratones que no están anestesiados. Los ratones deben mantenerse calientes durante la recuperación.
10. Revise el aparato de ortodoncia todos los días y excluya cualquier ratón experimental con desplazamiento.

4. Recogida de muestras

1. Sacrificar a los ratones en tres momentos diferentes a través de la luxación cervical: 4 días (d4), 7 días (d7) y 10 días (d10) después del inicio de OTM.
2. Use tijeras oftálmicas para cortar la piel verticalmente de la región cervical y luego separe la cabeza del cuerpo con toda la piel de la cabeza diseccionada.
3. Cortar la piel y los músculos buccinadores desde el angulus oris bilateral hasta la región posterior de la mandíbula. Desconecte completamente los músculos bucales y los tendones unidos a los coracoides para eliminar la mandíbula y recortar los huesos adicionales para obtener maxilares completos. Luego, retire el hueso detrás de los terceros molares bilaterales y arranque la mucosa palatina. Finalmente, desconecte el aparato de ortodoncia y corte el hueso entre los incisivos a lo largo de la sutura palatina mediana para obtener el hueso alveolar de los lados derecho e izquierdo.
   NOTA: Asegúrese de que la región desde los incisivos hasta el tercer molar se mantenga intacta en ambos lados.

5. Preparación para la sección de parafina

1. Fijación: Sumergir el hueso alveolar extraído en paraformaldehído al 4% durante 48 h y recortar con tijeras oftálmicas en la campana extractora para las secciones 6 y 7.
2. Descalcificación: Lave suavemente las muestras con 1x PBS durante 3 x 10 min. Descalcificar las muestras en un fijador tisular universal (pH 8,0), sustituido por una solución fresca cada 2 días, durante 5 semanas hasta que los huesos puedan penetrarse fácilmente con la punta de una aguja.
3. Deshidratación: Lave las muestras en 1 x PBS durante 3 x 10 min, y luego sumérjalas secuencialmente en etanol al 95%, etanol al 100% y xileno, durante 2 x 1 h cada solución.
4. Sumerja las muestras en una mezcla 1:1 de xileno y parafina durante 30 minutos y luego en parafina a 65 °C durante la noche.
5. Incrustación: Seleccione los tanques de incrustación adecuados. Coloque el hueso alveolar uniformemente con los dientes hacia arriba al mismo nivel. Retire las muestras del tanque de inclusión y transfiéralas a un congelador a -20 °C, luego numere cuando la parafina esté completamente enfriada y sólida.
6. Con un micrótomo, corte de veinte a cuarenta secciones de 4 μm de espesor de forma continua en el plano transversal y flote en agua a 37 °C. Adherir las secciones a portaobjetos de microscopio y hornear a 42 °C durante la noche.

6. Medición de distancia OTM

1. Fotografiar muestras de tres puntos de tiempo verticalmente desde el plano oclusal mediante microscopía estereoscópica.
2. Escanee el hueso alveolar con un escáner de microtomografía computarizada. Reconstruya imágenes en 3D del plano sagital máximo del hueso alveolar maxilar, en el que tres molares son completamente visibles, utilizando el software de soporte del escáner siguiendo las instrucciones del fabricante.
3. Mida la distancia OTM con el software ImageJ:
   1. Abra el software ImageJ y utilice la herramienta Línea recta para crear un segmento de línea de distancia conocida.
   2. Haga clic en Analizar y elija Establecer escala para introducir el valor de la distancia de línea dibujada en Distancia conocida e introducir unidades en Unidad de longitud.
   3. Dibuje una línea entre los puntos medios de la cresta marginal mesial de M2 y la cresta marginal distal de M1 y haga clic en Medición. Los resultados que se muestran en la columna Longitud representan la distancia OTM.

7. Análisis histológico

1. Selección de la región de interés (ROI): Defina el hueso alveolar del primer molar (M1) como el ROI, ubicado exactamente dentro de tres raíces de M1 en la sección transversal del hueso maxilar. Esta región no solo alcanza el hueso cortical del primer molar en dirección buco-lingual, sino que también se extiende hasta la mitad del eje largo de la raíz mesiobucal, incluyendo la mitad del área entre la raíz distobucal y la raíz palatina.
2. Análisis de la osteogénesis
   1. Doble marcaje y análisis de calceína y rojo de alizarina
      1. Preparación de calceína y rojo de alizarina: Disolver la calceína en una solución de NaHCO₃ al 2% a 1 mg/ml y el rojo de alizarina S en_H2O a 2 mg/ml.
         NOTA: En este estudio, la calceína y el rojo de alizarina se obtuvieron comercialmente.
      2. Administrar calceína (20 mg·kg-1·pc) el día 1 y alizarina roja S (40 mg·^kg-1·pc) el día 8 mediante inyección intraperitoneal después del inicio de la OTM. Sacrificar a los ratones el día 10 y extraer el hueso alveolar.
      3. Prepare las muestras e insértelas siguiendo los pasos 5.1 y 5.3-5.5. Para más detalles, véase Yang et ^al.30.
      4. Con un micrótomo giratorio, corte secciones de 5 μm de espesor de forma continua en el plano transversal. Adherir las secciones a portaobjetos de microscopio y montarlas con cubreobjetos utilizando bálsamo neutro.
         NOTA: El resto de las muestras deben almacenarse con desecante a temperatura ambiente.
      5. Examinar y fotografiar las secciones bajo un microscopio de fluorescencia y calcular la tasa de aposición mineral (MAR) y la tasa de formación ósea (BFR/BS) de acuerdo con el método descrito anteriormente³⁰.
   2. Inmunofluorescencia
      1. Seleccione las secciones de parafina adecuadas y hornee a 65 °C durante 30 min.
      2. Desparafinado: Sumerja las secciones en xileno durante 5 minutos y repita dos veces con xileno fresco cada vez.
      3. Rehidratación: Sumerja las secciones secuencialmente en etanol al 95%, etanol al 75%, etanol al 50% y ddH₂O, cada una durante 5 min.
      4. Lave suavemente las secciones con 1 x PBS durante 2 x 5 min.
      5. Recuperación de antígenos: Sumergir las secciones en una mezcla de Tris-HCl (0,05 M, pH 8,0), EDTA (0,01 M, pH 8,0) y proteasa K (10 μg/mL) en ddH₂O e incubar a 37 °C durante 15 min.
      6. Lave suavemente las secciones con 1 x PBS durante 3 x 5 min.
      7. Bloquear: Elimina el exceso de líquido de las secciones y dibuja un círculo alrededor del área objetivo con un marcador hidrofóbico. Para bloquear la unión inespecífica, cubrir con un tampón de bloqueo que contenga un 10% de albúmina sérica bovina e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
         NOTA: Tenga cuidado de no secar las secciones durante demasiado tiempo, para no afectar los resultados.
      8. Incubación primaria de anticuerpos: diluir el anticuerpo antiosteopontina (OPN) con diluyente de anticuerpos a la concentración recomendada y añadir 30-50 μL a cada muestra; incubar a 4 °C durante la noche en una cámara humidificada.
         NOTA: Asegúrese de dejar un poco de agua en la cámara y cubrirla para evitar que el líquido de anticuerpos se evapore.
      9. Lave suavemente las secciones con 1 x PBS durante 3 x 10 min.
         NOTA: Los pasos 7.2.2.10-7.2.2.12 deben realizarse en la oscuridad.
      10. Incubación de anticuerpos secundarios fluorescentes: seleccione un anticuerpo secundario fluorescente apropiado que corresponda al anticuerpo primario y dilúyalo a la concentración recomendada. Añadir 30-50 μL a cada muestra e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
      11. Lave suavemente las secciones con 1 x PBS durante 2 x 10 min.
      12. Utilice un medio de montaje antidecoloración con 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para montar las muestras. Guarde las secciones en la oscuridad y fotografíelas lo antes posible.
      13. Realizar microscopía de fluorescencia incorporando una cámara digital para examinar y fotografiar las secciones y contar las células positivas en las regiones de interés (ROIs).
3. Análisis de la osteoclastogénesis
   1. Tinción con fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP)
      1. Seleccione las secciones de parafina adecuadas. Desparafinar y rehidratar siguiendo los pasos 7.2.2.1-7.2.2.3.
      2. Prepare una solución de tinción fresca con el kit de tinción TRAP de acuerdo con las instrucciones del fabricante y precaliente a 37 °C.
      3. Añadir 30-50 μL de solución de tinción a cada muestra e incubar a 37 °C en una cámara humidificada durante 20-30 min. Revise cada 5 minutos hasta que se vean osteoclastos multinucleados rojos bajo un microscopio óptico. Detenga la reacción con ddH2O.
      4. Contratinción en solución de hematoxilina durante 30 s y sumergir en solución de amoníaco al 1% durante 1 min para obtener un color azul estable. Enjuague con agua del grifo a fuego lento.
      5. Monta las secciones con cubreobjetos usando bálsamo neutro y sécalas durante la noche.
      6. Tomar fotografías bajo un microscopio y contar el número de células TRAP-positivas con más de tres núcleos, siguiendo nuestro protocolo anterior³⁰.
   2. Inmunofluorescencia: Utilizar el anticuerpo de catepsina K (CTSK) a la concentración recomendada para la inmunofluorescencia y seguir el protocolo descrito en la sección 7 anterior.

Resultados

Utilizando este protocolo, establecimos un modelo de ratón knockout Stat3 específico del linaje osteoblástico inducible (Stat3^Col1α2ERT2) para examinar los efectos de la deleción de STAT3 en la remodelación ósea alveolar impulsada por la fuerza ortodóncica (Figura 1A,B). La deleción de STAT3 en osteoblastos se confirmó mediante tinción por inmunofluorescencia del hueso alveolar (Figura 1C).

Discusión

Dado que la maloclusión es uno de los trastornos bucales más comunes que afectan la respiración, la masticación, el habla e incluso la apariencia, la demanda de ortodoncia aumenta día a día, con una incidencia que aumenta del 70% al 93% según una encuesta epidemiológica previa^31,32. Cómo acelerar la remodelación ósea alveolar para aumentar la eficiencia del tratamiento de ortodoncia de forma segura se ha convertido en un tema candente en este campo; po...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P1020
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1101
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A5533
Anti-CTSK antibody	Santa Cruz	sc-48353
Anti-OPN antibody	R&D Systems, Minneapolis, MN, USA	AF808
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Closed-coil springs	Innovative Material and Devices, Shanghai, China	CS1006B
Col1α2CreERT2 mice			A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences.
Dexmedetomidine hydrochloride	Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTA	Beyotime Biotechanology	ST069
Embedding tanks	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	80106-1100-16
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	100092183
ImageJ software	NIH, Bethesda, MD, USA
Mounting medium with DAPI	Beyotime Biotechanology	P0131
Mouse dissection platform	Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd.	HK105
Paraffin	Sangon biotech Co., Ltd.	A601889
Primers for genotyping			Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease K	Sigma-Aldrich	539480
Self-curing restorative resin	3M ESPE, St. Paul, MN, USA	712-035
Stat3fl/fl mice	GemPharmatech Co., Ltd	D000527
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648
TRAP staining kit	Sigma-Aldrich	387A
Tris-HCl	Beyotime Biotechanology	ST780
Universal tissue fixative	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1105
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10023418
Zoletil	VIRBAC