使用诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠研究正畸牙齿移动过程中的牙槽骨重塑

摘要

本研究提供了一种使用诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠研究正畸力下骨重塑的方案，并描述了分析正畸牙齿移动过程中牙槽骨重塑的方法，从而揭示了骨骼机械生物学。

摘要

牙槽骨，周转率高，是人体重塑最活跃的骨骼。正畸牙齿移动 （OTM） 是一种常见的人工过程，即响应机械力进行牙槽骨重塑，但其潜在机制仍然难以捉摸。由于动物模型相关的限制，以往的研究无法揭示任何时间和空间骨重塑的确切机制。信号转导和转录激活因子 3 （STAT3） 在骨代谢中很重要，但其在 OTM 期间成骨细胞中的作用尚不清楚。为了提供 体内 证据证明 STAT3 在特定时间点参与 OTM，特别是在 OTM 期间参与细胞，我们生成了他莫昔芬诱导的成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠模型，施加正畸力，并分析牙槽骨表型。

显微计算机断层扫描（Micro-CT）和立体显微镜用于访问OTM距离。组织学分析选择位于上颌骨横截面第一磨牙（M1）三个根部内的区域作为感兴趣区域（ROI），评估成骨细胞和破骨细胞的代谢活性，表明正畸力对牙槽骨的影响。简而言之，我们提供了一种使用诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠来研究正畸力下的骨重塑的方案，并描述了分析 OTM 期间牙槽骨重塑的方法，从而为骨骼机械生物学提供了新的思路。

引言

众所周知，根据沃尔夫定律^1,2，^骨骼在一生中不断进行重建^，以响应机械力。适当的机械刺激，如重力和日常锻炼，通过刺激成骨细胞和破骨细胞来维持骨量和力量，并防止骨质流失。负责骨吸收的破骨细胞 3,4,5,6,7 和负责骨形成的成骨细胞 8,9,10 维持骨稳态并在骨重塑的生物过程中共同发挥作用。相反，在没有负荷刺激的情况下，如宇航员在长期微重力下，骨骼会遭受 10% 的骨密度损失，从而增加骨质疏松症的风险^11,12。此外，非侵入性和方便的机械疗法，包括正畸和牵张成骨术，已成为骨骼疾病的治疗方法^13,14

研究方案

本文所述涉及动物的所有方法均经上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会（第82101048号）批准。

1. 建立诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠

注： Stat3 fl^/fl小鼠是商业获得的; Col1α2^CreERT2菌株是一份礼物（详见 材料表 ）。为所有动物提供标准化的实验室颗粒食物和水以及标准的实验室环境条件（室温为22°C至26°C，湿度为50%-55%）。

1. 将一只性成熟的雄性小鼠和两只雌性小鼠放在同一个笼子里。18 天后，每天检查新生儿。将任何怀孕的雌性小鼠移到空笼子中，必要时单独饲养它们。如果雌性小鼠在30天内未怀孕，则将雄性小鼠放入其他不同的繁殖笼中。
2. 生成 Stat3^fl/+;通过将 Stat3 fl^/fl 小鼠与 Col1α2 ^CreERT2 小鼠杂交来 Col1α2 ^CreERT2 小鼠;将所有这些小鼠保持在C57BL / 6背景上。收集 2-5 mm 尾尖进行基因分型，并保持雄性 Stat3^fl/+

讨论

由于咬合不正是影响呼吸、咀嚼、说话甚至外观的最常见口腔疾病之一，因此对正畸的需求与日俱增，发病率从 70% 上升到 93%，根据之前的流行病学调查^31,32。如何加速牙槽骨重塑，安全地提高正畸治疗效率，成为该领域的热点话题;因此，有必要阐明OTM驱动的牙槽骨重塑机制。在以往的研究中，研究人员利用体内药物注射来研究动物模型中OTM的?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P1020
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1101
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A5533
Anti-CTSK antibody	Santa Cruz	sc-48353
Anti-OPN antibody	R&D Systems, Minneapolis, MN, USA	AF808
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Closed-coil springs	Innovative Material and Devices, Shanghai, China	CS1006B
Col1α2CreERT2 mice			A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences.
Dexmedetomidine hydrochloride	Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTA	Beyotime Biotechanology	ST069
Embedding tanks	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	80106-1100-16
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	100092183
ImageJ software	NIH, Bethesda, MD, USA
Mounting medium with DAPI	Beyotime Biotechanology	P0131
Mouse dissection platform	Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd.	HK105
Paraffin	Sangon biotech Co., Ltd.	A601889
Primers for genotyping			Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease K	Sigma-Aldrich	539480
Self-curing restorative resin	3M ESPE, St. Paul, MN, USA	712-035
Stat3fl/fl mice	GemPharmatech Co., Ltd	D000527
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648
TRAP staining kit	Sigma-Aldrich	387A
Tris-HCl	Beyotime Biotechanology	ST780
Universal tissue fixative	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1105
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10023418
Zoletil	VIRBAC