فحص حساسية الدواء الكروي في خطوط الخلايا الجذعية للورم الدبقي

Summary

تعد شاشات حساسية الدواء في المختبر أدوات مهمة لاكتشاف تركيبات الأدوية المضادة للسرطان. تعمل الخلايا المزروعة في الكرات على تنشيط مسارات إشارات مختلفة وتعتبر أكثر تمثيلا لنماذج في الجسم الحي من خطوط الخلايا أحادية الطبقة. يصف هذا البروتوكول طريقة لفحص المختبر للخطوط الكروية.

Abstract

تعد شاشات حساسية الأدوية في المختبر أدوات مهمة في اكتشاف العلاجات المركبة للأدوية المضادة للسرطان. عادة ، يتم إجراء شاشات الأدوية المختبرية هذه على الخلايا المزروعة في طبقة أحادية. ومع ذلك ، تعتبر هذه النماذج ثنائية الأبعاد (2D) أقل دقة مقارنة بنماذج الخلايا الكروية ثلاثية الأبعاد (3D). هذا ينطبق بشكل خاص على خطوط الخلايا الجذعية للورم الدبقي. تعمل الخلايا المزروعة في الكرات على تنشيط مسارات إشارات مختلفة وتعتبر أكثر تمثيلا لنماذج في الجسم الحي من خطوط الخلايا أحادية الطبقة. يصف هذا البروتوكول طريقة لفحص المختبر للخطوط الكروية. تستخدم خطوط الخلايا الجذعية للفأر والورم الدبقي البشري كمثال. يصف هذا البروتوكول حساسية الدواء الكروي ثلاثي الأبعاد ومقايسة التآزر التي يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان دواء أو تركيبة دواء تؤدي إلى موت الخلايا وما إذا كان هناك دواءان يتآزران. يتم تعديل خطوط الخلايا الجذعية للورم الدبقي للتعبير عن RFP. يتم طلاء الخلايا في 96 لوحة مستديرة منخفضة التعلق ، ويسمح للكرات بالتشكل بين عشية وضحاها. تتم إضافة الأدوية ، ويتم مراقبة النمو عن طريق قياس إشارة RFP بمرور الوقت باستخدام نظام التصوير الحي Incucyte ، وهو مجهر فلوري مدمج في حاضنة زراعة الأنسجة. يتم بعد ذلك حساب نصف الحد الأقصى للتركيز المثبط (IC50) ، والجرعة المميتة المتوسطة (LD50) ، ودرجة التآزر لتقييم الحساسيات للأدوية وحدها أو مجتمعة. توفر الطبيعة ثلاثية الأبعاد لهذا الاختبار انعكاسا أكثر دقة لنمو الورم وسلوكه وحساسيته للأدوية في الجسم الحي ، وبالتالي تشكل الأساس لمزيد من الفحص قبل السريري.

Introduction

الورم الأرومي الدبقي هو ورم مدمر عالي الجودة في الدماغ مع بقاء إجمالي لمدة خمس سنوات بنسبة^{5٪ 1}. تمثل الأورام الدبقية عالية الدرجة (HGG) مثل الورم الأرومي الدبقي السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان لدى الأطفال² وهي واحدة من أكثر الأورام تمردا للعلاج عند البالغين أيضا³. على الرغم من التقدم الكبير في فهمنا للمحركات الجزيئية ل HGG ، إلا أن خيارات العلاج لا تزال محدودة³ ، مع التأكيد على الحاجة إلى طرق فحص الأدوية التي تتنبأ بدقة أكبر بالحساسيات العلاجية في العيادة.

تم استخدام مزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد بشكل أساسي لنمذجة سلوك الخلية ذي الصلة من الناحية^{الفسيولوجية 4}. علاوة على ذلك ، يمكن تلخيص البنية ثلاثية الأبعاد للبيئة المكروية للورم في المختبر من خلال إنشاء فحوصات نمو ثلاثية الأبعاد⁵. ينشط النمو الكروي أيضا مسارات إشارات مختلفة ، وبالتالي يعتبر أكثر تمثيلا للنماذج في الجسم الحي ^6،7 مقارنة بالثقافة ثنائية الأبعاد. تنمو الخلايا الجذعية HGG للأطفال وخطوط الخلايا الجذعية للورم الدبقي NF1 للفأر بشكل طبيعي كمجالات عصبية ، وتستخدم خطوط خلايا الورم الدبقي NF1 للفأر في شاشة دواء متوسطة^{الإنتاجية 8}. تم اشتقاق خطوط الأطفال المستخدمة هنا من HGG للأطفال في نصف الكرة الأرضية والخط الأوسط والمخيخ وتم الحصول عليها من شبكة أورام الدماغ للأطفال (ملامح الطفرات والتعبير الجيني) ^{وتميزت بها بالكامل9}. تم تعديل هذه الخطوط للتعبير عن بروتين فلورسنت أحمر نووي (RFP) ، والذي يسمح بمراقبة الانتشار والبقاء على قيد الحياة باستخدام نظام التصوير الحي Incucyte. تمثل شدة إشارة RFP عدد الخلايا الموجودة. يمكن أيضا استخدام الفلوروفورات الأخرى ، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP).

يعد العلاج الكيميائي المركب لسرطان الدم الليمفاوي الحاد في مرحلة الطفولة والأورام اللمفاوية والأورام الخبيثة الظهارية والعديد من أنواع السرطان الأخرى طريقة فعالة للقضاء على الأورام ومنع مقاومة الأدوية للعوامل الفردية^10،11. ومع ذلك ، هناك معلومات محدودة حول العوامل التي يجب دمجها لتحقيق الحساسيات العلاجية في HGG ، مما يشجع على استخدام نماذج كروية أكثر دقة في اختبار المخدرات في المختبر .

Protocol

تمت الموافقة على جميع إجراءات البروتوكول من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى الأطفال في فيلادلفيا (IRB).

1. 3D طلاء الخلايا الكروية

1. تحضير وسائط الخلايا الجذعية للورم الدبقي: لعمل الوسائط الأساسية ، أضف 50 مل من مكمل التكاثر و 5 مل من محلول البنسلين والستربتومايسين 100x (10,000 وحدة / مل) إلى الوسط القاعدي (500 مل). لعمل وسائط الخلايا الجذعية للورم الدبقي ، أضف عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) إلى التركيز النهائي البالغ 20 نانوغرام / مل و 10 نانوغرام / مل ، على التوالي ، وفقا لوصف الشركة المصنعة.
   ملاحظة: يمكن استخدام وسائط الخلايا الجذعية للورم الدبقي لمدة أسبوع واحد عند تخزينها عند 4 درجات مئوية.
2. فصل الخلايا التي تعبر عن RFP:
   ملاحظة: في هذا المثال، يتم إستخدام خط الخلايا الجذعية NF1 HGG 5746 للماوس.
   1. انقل كرات الورم الدبقي إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وقم بتدوير كرات الورم الدبقي في جهاز طرد مركزي (150 × جم لمدة 5 دقائق). قم بإزالة المادة الطافية وأضف 300 ميكرولتر من الأكوتاز لفصل الكرات (احتضانها لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية).
   2. أضف 1 مل من وسائط الخلايا الجذعية للورم الدبقي وقم بتعطيل الكرات عن طريق سحب العينة اللطيف. الطرد المركزي للخلايا المنفصلة لمدة 5 دقائق عند 150 × جم ، وشفط المادة الطافية ، وإذابة الحبيبات في 1 مل من وسائط الخلايا الجذعية للورم الدبقي.
3. قم بقياس تركيز الخلايا باستخدام عداد الخلايا أو مقياس كثافة الدم. عند استخدام عداد الخلايا الفلورية ، أضف 18 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 2 ميكرولتر من صبغة Acridine Orange / Propidium Iodide. قم بتحميل 12 ميكرولتر من هذا المعلق في مقياس كثافة الدم لحساب عدد الخلايا الحية / الميتة الموجودة في المعلق.
4. تمييع الخلايا إلى تركيز نهائي يبلغ 2,000 خلية لكل 100 ميكرولتر من وسط الخلايا الجذعية للورم الدبقي.
   ملاحظة: قد تعتمد التعديلات على تركيز الخلية على خط الخلية ويمكن تعديلها وفقا لذلك.
5. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بتوزيع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (2,000 خلية لكل 100 ميكرولتر) في كل بئر من لوحة التثبيت المنخفضة القاع المستديرة المكونة من 96 بئرا عن طريق سحب العينات العكسي.
   ملاحظة: استخدم لوحات مرفقة منخفضة القاع المستديرة. ستحفز هذه الصفائح تكوين كرة واحدة من الورم الدبقي في كل بئر. يتجنب سحب العينات العكسي تكوين الفقاعات ، والتي ستتداخل مع التقاط الصور لنظام تحليل الخلايا الحية.
6. جهاز الطرد المركزي للألواح عند 150 × جم لمدة 5 دقائق.
   ملاحظة: الطرد المركزي هو خطوة حاسمة لبدء تكوين الغلاف العصبي ثلاثي الأبعاد.
7. احتضن بين عشية وضحاها للسماح بتكوين كرة واحدة في كل بئر.

2. إضافة أدوية لمقايسة التآزر (الشكل 1)

1. تأكد من أن كل بئر من الصفيحة المكونة من 96 بئرا يتلقى تركيزا محددا لكل من الدواءين 1 و 2. قم بإنشاء شبكة حيث يتم دمج كل تركيز من تركيز الدواء 1 مع كل تركيز من تركيز الدواء 2 في نسختين.
2. قم بعمل تخفيف تسلسلي للعقارين اللذين سيتم تحديد التآزر لهما (5 تخفيفات من الدواء 1 و 7 تخفيفات من الدواء 2) باستخدام وسائط الخلايا الجذعية للورم الدبقي (الشكل 1 أ).
   ملاحظة: في هذه الدراسة ، يتم استخدام سلسلة تخفيف تسلسلية بنسبة 50٪. ومع ذلك ، يمكن استخدام أي سلسلة تخفيف.
   1. يجب أن تكون سلسلة التخفيف أكثر تركيزا بمقدار 7 مرات من التركيز النهائي المطلوب في كل بئر. على سبيل المثال ، إذا كان أعلى تركيز نهائي للعقار 1 هو 1 ميكرومتر ، فقم بعمل التركيز الأول لسلسلة التخفيف للعقار 1 أو 7 ميكرومتر (1 مل ، الأنبوب B أو I في الشكل 1 أ).
   2. أضف 500 ميكرولتر من وسائط الخلايا الجذعية للورم الدبقي إلى كل أنبوب إضافي من سلسلة التخفيف (الأنبيبات C-H و J-M ، كما هو موضح في الشكل 1).
   3. لإنشاء سلسلة التخفيف ، قم بشفط 500 ميكرولتر من خليط الدواء من الأنبوب B أو الأنبوب I وأضفه إلى الأنبوب التالي في سلسلة التخفيف Tube C أو Tube J ، على التوالي (يحتوي على 500 ميكرولتر من وسائط الخلايا الجذعية للورم الدبقي). تخلط جيدا وتكرر مع الأنبوب التالي في سلسلة التخفيف. قم بإجراء عنصر تحكم DMSO (الأنبوب A) وتأكد من أن تركيز DMSO هو نفسه عبر الظروف.
      ملاحظة: يمكن إجراء تعديلات على تركيزات الدواء وسلسلة التخفيف. تأكد من إدراج تركيزات الدواء الصحيحة في الملف التكميلي 1 إذا تم تغيير سلسلة التخفيف.
3. إلى كل بئر من ألواح الآبار البالغ عددها 96 ، أضف 20 ميكرولتر من الدواء 1 و 20 ميكرولتر من المخدرات 2 عن طريق سحب العينات العكسي ، كما هو موضح في الشكل 1 ب ، للحصول على حجم نهائي قدره 140 ميكرولتر لكل بئر ؛ يتم تقييم تركيبات الأدوية في نسختين. إذا كنت تستخدم التحليل النهائي المقدم ل IC50 و LD50 ، فاستخدم تخطيط الدواء كما هو موضح في الشكل 1 ب.
   1. في هذا الفحص ، يتم أيضا قياس تأثير كل دواء بمفرده (دون وجود الدواء الآخر). تأكد من إضافة 20 ميكرولتر من وسائط التحكم DMSO (الأنبوب A في الشكل 1 ب) إلى آبار الأدوية المفردة لرفع الحجم النهائي لكل بئر إلى 140 ميكرولتر.
   2. تأكد من أن الآبار لا تحتوي على فقاعات ، لأن ذلك سيؤثر على التصوير.
      ملاحظة: يمكن إجراء تعديلات على المجلد النهائي. ومع ذلك ، تأكد من ضبط التركيزات في النقطة 2.2.
4. ضع الألواح في جهاز التصوير المباشر وراقب نمو كل كرة في كل بئر باستخدام الوحدة الكروية ، وإعداد الكرة المفردة ، وتصوير كل من المجال الساطع و RFP بتكبير 4x.
5. مراقبة لوحات لمدة 72 ساعة, تصوير كل بئر من اللوحة في فاصل زمني منتظم, عادة 2 ساعة.
   ملاحظة: قم بتحميل خريطة اللوحة الصحيحة ؛ سيضمن ذلك التحليل النهائي المناسب (الشكل 1 ج).

3. حساب IC50 و LD50 ودرجة التآزر (الشكل 2 والشكل 3)

1. قم بتحليل شدة طلب تقديم العروض لكل بئر وكل نقطة زمنية باستخدام برنامج التصوير المباشر. يتم سرد معلمات التحليل المستخدمة في الملفات التكميلية (الملف التكميلي 2).
   ملاحظة: يمكن استخدام معلمات التحليل المختلفة حسب الرغبة.
2. قم بتصدير بيانات طلب تقديم العروض كإجمالي كثافة طلب تقديم العروض المتكاملة باللون الأحمر لكل بئر ، مع التأكد من تصدير البيانات الأولية غير المجمعة (الشكل 2 أ).
   ملاحظة: إذا كنت تستخدم النموذج المقدم (الملف التكميلي 1) لحساب IC50 و LD50 ، فمن الضروري الالتزام بالنقطة 3.2
3. حدد المتوسط والانحراف المعياري لكل مجموعة دوائية من (1) تغيير الطية مقارنة ب DMSO فقط (لهذا الحساب ، ليست هناك حاجة إلى قيم 0 ساعة) و (2) Log2 لتغيير الطي مقارنة ب 0 ساعة عن طريق لصق البيانات الأولية في ورقة Excel المقدمة (الشكل 2 ب وانظر المثال في الملف التكميلي 1).
4. اضبط الحد الأقصى لتركيز الأدوية 1 و 2 في جدول البيانات (الشكل 2 ب).
   ملاحظة: تأكد من ضبط تركيزات الأدوية 1 و 2 ؛ خلاف ذلك ، سيتم حساب قيم LD50 و IC50 غير الصحيحة.
5. احسب قيم IC50 باستخدام تطبيق برمجي مناسب لتحليل البيانات (هنا ، يتم استخدام GraphPad). لحساب قيمة IC50 ، استخدم متوسط تغيير الطية وتغيير أضعاف الانحراف المعياري مقارنة ب DMSO المحدد فقط في الخطوة 3.4 ، وانسخ جداول IC50 للأدوية 1 و 2 إلى برنامج تحليل البيانات (Log (المثبط) مقابل الاستجابة الطبيعية ، المنحدر المتغير) (الشكل 3 أ).
   1. استخدم فقط البيانات من الآبار التي تمت إضافة مكونات واحدة إليها لحسابات IC50. استخدم قيم تركيز الدواء Log في برنامج تحليل البيانات، والتي يتم حسابها تلقائيا في جدول البيانات المقدم.
6. احسب درجة التآزر:
   1. استخدم متوسط تغيير الطية مقارنة ب DMSO فقط لكل مجموعة لحساب درجة التآزر باستخدام حزمة برامج أو موقع ويب. على سبيل المثال ، https://synergyfinder.fimm.fi/ ¹² (المعلمات: ملاءمة منحنى LL4 ، طريقة ZIP لحساب درجة التآزر). يقوم الملف التكميلي 1 تلقائيا بحساب القيم اللازمة لإنشاء جدول إدخال التآزر الذي يمكن تحميله إلى SynergyFinder (الشكل 3 ب). يتم توفير مثال على جدول إدخال التآزر في الملف التكميلي 3.
      ملاحظة: تشير النتيجة التي تزيد عن 10 إلى التآزر ، وتشير الدرجة الأقل من -10 إلى العداء والقيمة بين -10 تظهر تأثيرات مضافة.
7. احسب درجة LD50:
   1. لكل تركيز من الدواء 1 ، احسب LD50 للعقار 2. يقوم الملف التكميلي تلقائيا بحساب قيمة Log2 والانحراف المعياري لكل تركيز (الشكل 3C).
   2. أدخل المتوسط والانحراف المعياري لتغيير أضعاف Log2 مقارنة ب 0 ساعة ، بالإضافة إلى عدد التكرارات في برنامج تحليل البيانات (في هذه الدراسة ، 2 ،) واحسب قيمة LD50 والانحراف المعياري LD50 عن طريق تحديد التركيز عند -1 (يمثل Log2 = -1 قيمة log2 التي يتم فقد 50٪ من الإشارة مقارنة ب 0 ساعة). في هذه العمليات الحسابية ، استخدم نموذج معلمات Log (inhibitor) مقابل الاستجابة ، المنحدر المتغير 4 المعلمات.
      ملاحظة: لا يحسب برنامج تحليل البيانات تلقائيا تركيز الدواء المقابل لقيمة log2 = -1 ؛ ومع ذلك ، يمكن إضافة هذه القيمة إلى الحسابات المبلغ عنها لبرنامج تحليل البيانات كمعادلة محددة من قبل المستخدم (الشكل 3C). تأكد من استخدام قيم تركيز السجل في برنامج تحليل البيانات، والتي يتم حسابها تلقائيا في جدول البيانات المقدم. يعرض الملف التكميلي 4 لوحتي IC50 و LD50 في برنامج GraphPad.

النتائج

على سبيل المثال ، تم تقييم التآزر بين Trametinib (مثبط MEK) و GDC-0941 (مثبط PI3K) ، والذي يثبط مسارين مستجيبين من RAS في خط الخلايا الجذعية للورم الدبقي للفأر 5746 (التعبير عن RFP) (الشكل 4). يوضح الشكل 4 أ نفس الكرة في 0 ساعة و 72 ساعة معالجة بمزيج من Trametinib و GDC-0941....

Discussion

يصف هذا البروتوكول فحوصات فحص الأدوية ثلاثية الأبعاد التي تم استخدامها بشكل فعال لتقييم نقاط الضعف الدوائية في النماذج الكروية للورم الدبقي⁸. تم تصميم نظام الفحص الكروي ثلاثي الأبعاد هذا خصيصا للسماح بإجراء تحقيق أكثر دقة قبل السريرية للعلاجات الكيميائية ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL centrifugation tubes	CELLTREAT	229411	15 mL polypropylene centrifuge tubes, sterile
96- well plate	S-bio	MS9096UZ	96-well round-bottom ultra-low attachment plate
Accutase	STEMCELL Technologies	7922	Cell detachment solution
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain	Logos Biosystems	F23001	Live/dead stain for cell counting
bFGF	STEMCELL Technologies	78003.2	Human recombinant bFGF
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Centrifuging cells and plates
DMSO	Pierce	20688	solvent for compounds
EGF	STEMCELL Technologies	78006.2	Human recombinant EGF
Eppendorf tubes	Costar	07-200-534	Microcentrifuge tubes
Excel	Microsoft		Microsoft excel
GDC-0941	Selleckchem	S1065	Drug 1
GraphPad	GraphPad	GraphPad Prism 9	Calculation of IC50 and LD50
Hemocytometer	Logos Biosystems	LGBD10008	Luna PhotonSlide
Incucyte	Sartorius	S3	Fluorescence microscope embedded in the tissue culture incubator that images every well at specific time intervals.
Incucyte software	Sartorius	Incucyte 2022B	Analysis of proliferation data
Media	STEMCELL Technologies	5702	NeuroCult (Mouse and Rat) proliferation kit containging Basal Medium and growth supplement
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Antibiotics to add to media
Trametinib	Selleckchem	S2673	Drug 2