신경교종 줄기세포주에서 스페로이드 약물 감수성 스크리닝

요약

체외 약물 감수성 검사는 항암 약물 조합을 발견하기 위한 중요한 도구입니다. 구체에서 성장한 세포는 서로 다른 신호 경로를 활성화하며 단층 세포주보다 in vivo 모델을 더 잘 대표하는 것으로 간주됩니다. 이 프로토콜은 스페로이드 라인에 대한 체외 약물 스크리닝 방법을 설명합니다.

초록

체외 약물 감수성 검사는 항암 약물 조합 요법을 발견하는 데 중요한 도구입니다. 일반적으로 이러한 체외 약물 스크리닝은 단층에서 성장한 세포에 대해 수행됩니다. 그러나 이러한 2차원(2D) 모델은 3차원(3D) 스페로이드 세포 모델에 비해 정확도가 떨어지는 것으로 간주됩니다. 이는 특히 신경교종 줄기세포주에 해당됩니다. 구체에서 성장한 세포는 서로 다른 신호 경로를 활성화하며 단층 세포주보다 in vivo 모델을 더 잘 대표하는 것으로 간주됩니다. 이 프로토콜은 스페로이드 라인의 체외 약물 스크리닝 방법을 설명합니다. 마우스 및 인간 신경교종 줄기세포주가 예로 사용됩니다. 이 프로토콜은 약물 또는 약물 조합이 세포 사멸을 유도하는지 여부와 두 약물이 시너지를 유발하는지 확인하는 데 사용할 수 있는 3D 스페로이드 약물 민감도 및 시너지 분석을 설명합니다. 신경교종 줄기세포주는 RFP를 발현하도록 변형됩니다. 세포는 낮은 부착 원형 웰 바닥 96 플레이트에 도금되며 구체는 하룻밤 동안 형성 될 수 있습니다. 약물을 첨가하고 조직 배양 인큐베이터에 내장된 형광 현미경인 Incucyte 라이브 이미징 시스템을 사용하여 시간 경과에 따른 RFP 신호를 측정하여 성장을 모니터링합니다. 이후 약물 단독 또는 조합 약물에 대한 민감도를 평가하기 위해 절반 최대 억제 농도(IC50), 치사량 중앙값(LD50) 및 시너지 점수를 계산합니다. 이 분석법의 3차원 특성은 생체 내에서 종양 성장, 행동 및 약물 민감성을 보다 정확하게 반영하여 추가 전임상 조사의 기초를 형성합니다.

서문

교모세포종은 5년 전체 생존율이 5%인 파괴적인 고등급 뇌 신생물입니다¹. 교모세포종과 같은 고급 신경교종(HGG)은 소^{아 인구에서} 암 관련 사망의 주요 원인이며2 성인에서도 치료하기 가장 어려운 종양 중 하나입니다³. HGG의 분자 동인에 대한 이해가 크게 발전했음에도 불구하고 치료 옵션은 여전히 제한적이며³ 이는 임상에서 치료 민감도를 보다 정확하게 예측하는 약물 스크리닝 방법의 필요성을 강조합니다.

3D 세포 배양은 주로 생리학적으로 관련된 세포 행동 모델링에 사용되어 왔습니다⁴. 또한, 종양 미세환경의 3D 구조는 3D 성장 분석을 확립하여 in vitro로 재현할 수 있습니다⁵. 스페로이드 성장은 또한 다양한 신호 경로를 활성화하므로 2D 배양에 비해 생체 내 모델 ^6,7을 더 잘 나타내는 것으로 간주됩니다. 소아 HGG 줄기세포와 마우스 NF1 신경교종 줄기세포주는 자연적으로 신경구로 성장하며, 이러한 마우스 NF1 신경교종 세포주를 중간 처리량의 약물 스크리닝⁸에 사용했습니다. 여기에 사용된 소아 라인은 반구, 정중선 및 소뇌 소아 HGG에서 파생되었으며 소아 뇌종양 네트워크(돌연변이 및 유전자 발현 프로파일)에서 획득하여 완전히 특성화되었습니다⁹. 이 라인은 핵 적색 형광 단백질(RFP)을 발현하도록 변형되었으며, 이를 통해 Incucyte 라이브 이미징 시스템을 사용하여 증식 및 생존을 모니터링할 수 있습니다. RFP 신호의 강도는 존재하는 셀의 수를 나타냅니다. 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 다른 형광단도 사용할 수 있습니다.

소아 급성 림프구 백혈병, 림프종, 상피 악성 종양 및 기타 많은 암에 대한 복합 화학 요법은 종양을 근절하고 단일 제제에 대한 약물 내성을 예방하는 효과적인 방법입니다^10,11. 그러나 HGG에서 치료 민감성을 달성하기 위해 어떤 약제를 결합해야 하는지에 대한 정보가 제한되어 있어 체외 약물 검사에서 보다 정확한 스페로이드 모델을 사용하도록 권장합니다.

프로토콜

모든 프로토콜 절차는 필라델피아 아동병원 기관 검토 위원회(IRB)의 승인을 받았습니다.

1. 3D 스페로이드 세포 도금

1. 신경교종 줄기세포 배지 준비: 기본 배지를 만들려면 증식 보충제 50mL와 100x 페니실린-스트렙토마이신 용액(10,000U/mL) 5mL를 기저 배지(500mL)에 추가합니다. 신경교종 줄기세포 배지를 만들려면 제조업체 설명에 따라 표피 성장 인자(EGF)와 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 각각 20ng/mL 및 10ng/mL의 최종 농도에 추가합니다.
   참고: 신경교종 줄기세포 배지는 4°C에서 보관 시 1주일 동안 사용할 수 있습니다.
2. RFP 발현 세포 해리:
   참고: 이 예에서는 마우스 NF1 HGG 줄기세포주 5746이 사용됩니다.
   1. 신경교종 구체를 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 원심분리기에서 신경교종 구체를 스핀다운합니다(150 x g 에서 5분 동안). 상층액을 제거하고 300μL의 accutase를 추가하여 구체를 분리합니다(37°C에서 5분 동안 배양).
   2. 신경교종 줄기세포 배지 1mL를 추가하고 부드러운 피펫팅으로 구체를 파괴합니다. 해리된 세포를 150 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 흡인하고, 1mL의 신경교종 줄기세포 배지에 펠렛을 용해시킵니다.
3. 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 세포의 농도를 측정합니다. 형광 세포 계수기를 사용하는 경우, 2 μL의 Acridine Orange/Propidium Iodide Stain에 18 μL의 세포 현탁액을 첨가합니다. 이 현탁액 12μL를 혈구계에 로드하여 현탁액에 존재하는 살아있는/죽은 세포의 수를 계산합니다.
4. 신경교종 줄기 세포 배지 100μL당 2,000개의 세포라는 최종 농도로 세포를 희석합니다.
   참고: 세포 농도에 대한 수정은 세포주에 따라 달라질 수 있으며 그에 따라 조정될 수 있습니다.
5. 멀티채널 피펫을 사용하여 리버스 피펫팅을 통해 96웰 둥근 바닥 하단 낮은 부착 플레이트의 각 웰에 100μL의 셀 현탁액(100μL당 2,000개 셀)을 분주합니다.
   알림: 둥근 바닥의 낮은 부착 플레이트를 사용하십시오. 이 플레이트는 각 웰에서 단일 신경교종 구체의 형성을 자극합니다. 역 피펫팅은 살아있는 세포 분석 시스템의 이미지 캡처를 방해하는 기포 형성을 방지합니다.
6. 150 x g 에서 5분 동안 플레이트를 원심분리합니다.
   참고: 원심분리는 3D 신경구 형성을 시작하는 중요한 단계입니다.
7. 각 웰에 하나의 구가 형성될 수 있도록 밤새 배양합니다.

2. 시너지 분석을 위한 약물 추가(그림 1)

1. 96웰 플레이트의 각 웰이 두 약물 1과 2의 특정 농도를 받는지 확인합니다. 약물 1의 각 농도가 약물 2의 각 농도와 중복으로 결합되는 그리드를 만듭니다.
2. 신경교종 줄기세포 배지를 사용하여 시너지 효과를 결정할 두 약물(약물 1의 5회 희석 및 약물 2의 7회 희석)을 연속 희석합니다(그림 1A).
   참고: 이 연구에서는 50% 연속 희석 시리즈가 사용됩니다. 그러나 모든 희석 시리즈를 사용할 수 있습니다.
   1. 희석 시리즈는 각 웰에서 원하는 최종 농도보다 7배 더 농축되어야 합니다. 예를 들어, 약물 1에 대한 가장 높은 최종 농도가 1μM인 경우 약물 1, 7μM( 그림 1A의 튜브 B 또는 I)에 대한 희석 시리즈의 첫 번째 농도를 만듭니다.
   2. 500μL의 신경교종 줄기세포 배지를 희석 시리즈의 각 추가 튜브( 그림 1 참조와 같이 튜브 C-H 및 J-M)에 추가합니다.
   3. 희석 시리즈를 만들려면 튜브 B 또는 튜브 I에서 약물 혼합물 500μL를 흡인하고 각각 희석 시리즈 튜브 C 또는 튜브 J의 다음 튜브(500μL의 신경교종 줄기 세포 배지 포함)에 추가합니다. 잘 섞고 희석 시리즈의 다음 튜브에 반복합니다. DMSO 제어(튜브 A)를 만들고 DMSO 농도가 조건 간에 동일한지 확인합니다.
      참고: 약물 농도 및 희석 시리즈를 수정할 수 있습니다. 희석 시리즈가 변경된 경우 보충 파일 1 에 올바른 약물 농도를 나열해야 합니다.
3. 96개의 웰 플레이트의 각 웰에 그림 1B와 같이 역 피펫팅을 통해 약물 1 20μL와 약물 2 20μL를 추가하여 웰당 140μL의 최종 부피를 얻습니다. 약물 조합은 중복으로 평가됩니다. IC50 및 LD50에 대해 제공된 다운스트림 분석을 사용하는 경우 그림 1B와 같이 약물 레이아웃을 사용합니다.
   1. 이 분석에서는 각 약물 자체(다른 약물이 존재하지 않음)의 효과도 측정됩니다. 각 웰의 최종 부피를 140μL로 만들기 위해 단일 약물 웰에 20μL의 DMSO 제어 매체( 그림 1B의 튜브 A)를 추가해야 합니다.
   2. 우물에 기포가 포함되어 있지 않은지 확인하십시오., 이는 이미징에 영향을 미치므로 합니다.
      참고: 최종 볼륨에 대한 수정이 이루어질 수 있습니다. 그러나 포인트 2.2의 농도를 조정해야 합니다.
4. 플레이트를 라이브 이미저에 배치하고 스페로이드 모듈, 단일 구 설정, 4배 배율에서 명시야와 RFP를 모두 이미징하여 각 웰에서 각 구의 성장을 모니터링합니다.
5. 72시간 동안 플레이트를 모니터링하고 일정한 시간 간격(일반적으로 2시간)으로 플레이트의 각 웰을 이미징합니다.
   참고: 올바른 플레이트 맵을 업로드하십시오. 이를 통해 적절한 다운스트림 분석이 보장됩니다(그림 1C).

3. IC50, LD50 및 시너지 점수 계산(그림 2 및 그림 3)

1. 라이브 이미저 소프트웨어를 사용하여 각 웰 및 각 시점에 대한 RFP 강도를 분석합니다. 사용된 해석 매개변수는 보충 파일(보충 파일 2)에 나열되어 있습니다.
   참고: 다양한 분석 매개변수를 선호하여 사용할 수 있습니다.
2. RFP 데이터를 각 웰에 대한 Total Red Integrated RFP Intensity로 내보내고, 그룹화되지 않은 원시 데이터를 내보내야 합니다(그림 2A).
   참고: 제공된 템플릿(보충 파일 1)을 사용하여 IC50 및 LD50을 계산하는 경우 3.2항을 준수하는 것이 중요합니다
3. 원시 데이터를 제공된 엑셀 시트에 붙여넣어 (1) DMSO와 비교한 폴드 변화(이 계산에서는 0h 값이 필요하지 않음) 및 (2) 0h와 비교한 폴드 변화의 Log2의 각 약물 조합에 대한 평균 및 표준 편차를 결정합니다(그림 2B 및 보충 파일 1의 예 참조).
4. 스프레드시트에서 약물 1과 2의 최대 농도를 조정합니다(그림 2B).
   알림: 약물 1과 2의 농도를 조정해야 합니다. 그렇지 않으면 잘못된 LD50 및 IC50 값이 계산됩니다.
5. 적절한 데이터 분석 소프트웨어 응용 프로그램(여기서는 GraphPad가 사용됨)을 사용하여 IC50 값을 계산합니다. IC50 값 계산을 위해 3.4단계에서만 측정된 DMSO와 비교하여 평균 폴드 변화 및 표준 편차 폴드 변화를 사용하고, 약물 1 및 2의 IC50 표를 데이터 분석 소프트웨어(Log(inhibitor) vs. normalized response, variable slope)에 복사합니다(그림 3A).
   1. IC50 계산을 위해 단일 컴푼드가 추가된 웰의 데이터만 사용합니다. 제공된 스프레드시트에서 자동으로 계산되는 데이터 분석 소프트웨어에서 약물 농도 값을 기록합니다.
6. 시너지 점수 계산:
   1. DMSO와 비교한 평균 폴드 체인을 모든 조합에만 사용하여 소프트웨어 패키지 또는 웹 사이트를 사용하여 시너지 점수를 계산할 수 있습니다. 예를 들어, https://synergyfinder.fimm.fi/ ¹²(매개변수: LL4 곡선 맞춤, 시너지 점수 계산을 위한 ZIP 방법). 보충 파일 1은 SynergyFinder에 업로드할 수 있는 시너지 입력 테이블을 생성하는 데 필요한 값을 자동으로 계산합니다(그림 3B). 시너지 입력 테이블의 예는 보충 파일 3에 제공되어 있습니다.
      참고: 10 이상의 점수는 시너지를 나타내고, -10 미만의 점수는 적대감을 나타내며, -10과 10 사이의 값은 추가 효과를 나타냅니다.
7. LD50 점수를 계산합니다.
   1. 약물 1의 각 농도에 대해 약물 2의 LD50을 계산합니다. 보조 파일은 각 농도에 대한 Log2 값과 표준 편차를 자동으로 계산합니다(그림 3C).
   2. 데이터 분석 소프트웨어에서 0 h와 비교한 Log2 폴드 변화의 평균 및 표준 편차와 반복 횟수(이 연구에서는 2,)를 입력하고 -1에서 농도를 결정하여 LD50 값과 LD50 표준 편차를 계산합니다(Log2 = -1은 0 h에 비해 신호의 50%가 손실된 log2 값을 나타냄). 이 계산에서는 로그(억제제) 대 응답, 가변 기울기 4 매개변수 모형을 사용합니다.
      참고: 데이터 분석 소프트웨어는 log2 = -1 값에 해당하는 약물 농도를 자동으로 계산하지 않습니다. 그러나 이 값은 데이터 분석 소프트웨어의 보고된 계산에 사용자 정의 방정식으로 추가할 수 있습니다(그림 3C). 제공된 스프레드시트에서 자동으로 계산되는 데이터 분석 소프트웨어의 로그 농도 값을 사용해야 합니다. 보충 파일 4 는 GraphPad 소프트웨어의 IC50 및 LD50 패널을 보여줍니다.

결과

예를 들어, 마우스 신경교종 줄기세포주 5746(RFP 발현)에서 두 개의 RAS 다운스트림 효과기 경로를 억제하는 Trametinib(MEK 억제제)와 GDC-0941(PI3K 억제제)의 시너지 효과를 평가했습니다(그림 4). 그림 4A 는 Trametinib과 GDC-0941의 조합으로 처리된 0시간 및 72시간의 동일한 구를 보여줍니다. 이러한 이미지는 라이브 이미저 소프트웨어에?...

토론

이 프로토콜은 신경교종⁸의 스페로이드 모델에서 약물 취약성을 평가하는 데 효과적으로 사용된 3D 약물 스크리닝 분석에 대해 설명합니다. 이 3D 스페로이드 분석 시스템은 구체에서 성장한 신경교종 세포주에 대한 조합 화학요법의 보다 정확한 전임상 조사를 가능하게 하도록 특별히 설계되었습니다. HGG의 경우 이 방법은 이 파괴적인 질병에 대한 잠?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL centrifugation tubes	CELLTREAT	229411	15 mL polypropylene centrifuge tubes, sterile
96- well plate	S-bio	MS9096UZ	96-well round-bottom ultra-low attachment plate
Accutase	STEMCELL Technologies	7922	Cell detachment solution
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain	Logos Biosystems	F23001	Live/dead stain for cell counting
bFGF	STEMCELL Technologies	78003.2	Human recombinant bFGF
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Centrifuging cells and plates
DMSO	Pierce	20688	solvent for compounds
EGF	STEMCELL Technologies	78006.2	Human recombinant EGF
Eppendorf tubes	Costar	07-200-534	Microcentrifuge tubes
Excel	Microsoft		Microsoft excel
GDC-0941	Selleckchem	S1065	Drug 1
GraphPad	GraphPad	GraphPad Prism 9	Calculation of IC50 and LD50
Hemocytometer	Logos Biosystems	LGBD10008	Luna PhotonSlide
Incucyte	Sartorius	S3	Fluorescence microscope embedded in the tissue culture incubator that images every well at specific time intervals.
Incucyte software	Sartorius	Incucyte 2022B	Analysis of proliferation data
Media	STEMCELL Technologies	5702	NeuroCult (Mouse and Rat) proliferation kit containging Basal Medium and growth supplement
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Antibiotics to add to media
Trametinib	Selleckchem	S2673	Drug 2