胶质瘤干细胞系中的球状体药物敏感性筛选

摘要

体外 药物敏感性筛选是发现抗癌药物组合的重要工具。在球体中生长的细胞会激活不同的信号通路，并且被认为比单层细胞系更能代表 体内 模型。该方案描述了一种球状体系的 体外 药物筛选方法。

摘要

体外 药物敏感性筛选是发现抗癌药物联合疗法的重要工具。通常，这些 体外 药物筛选是在单层生长的细胞上进行的。然而，与三维 （3D） 球状体单元模型相比，这些二维 （2D） 模型被认为不太准确;对于神经胶质瘤干细胞系尤其如此。在球体中生长的细胞会激活不同的信号通路，并且被认为比单层细胞系更能代表 体内 模型。该方案描述了一种球状体系的 体外 药物筛选方法;以小鼠和人神经胶质瘤干细胞系为例。该方案描述了 3D 球状体药物敏感性和协同测定，可用于确定药物或药物组合是否诱导细胞死亡以及两种药物是否协同作用。神经胶质瘤干细胞系经过修饰以表达 RFP。将细胞接种在低附着圆孔底 96 板中，并让球体形成过夜。添加药物，并使用 Incucyte® 实时成像系统（嵌入组织培养箱中的荧光显微镜）测量 RFP 信号随时间的变化，从而监测生长情况。随后计算半数最大抑制浓度 （IC50），中位致死量 （LD50） 和协同评分，以评估对单独或联合使用的药物的敏感性。该测定的三维性质提供了更准确的体内肿瘤生长、行为和药物 敏感性的反映，从而为进一步的临床前研究奠定了基础。

引言

胶质母细胞瘤是一种毁灭性的高级别脑肿瘤，五年总生存率为 5%¹。像胶质母细胞瘤这样的高级别神经胶质瘤 （HGG） 是儿科人群中癌症相关死亡的主要原因² ，也是成人中最难治疗的肿瘤之一³。尽管我们对 HGG 分子驱动因素的理解取得了重大进展，但治疗选择仍然有限³，这强调了需要更准确地预测临床治疗敏感性的药物筛选方法。

3D 细胞培养物主要用于模拟生理相关的细胞行为⁴。此外，可以通过建立 3D 生长测定在体外概括肿瘤微环境的 3D 结构⁵。球状体生长还会激活不同的信号通路，因此与 2D 培养相比，球状体生长被认为更能代表体内模型 ^6,7。儿科 HGG 干细胞和我们的小鼠 NF1 神经胶质瘤干细胞系自然生长为神经球，并在中等通量药物筛选中使用这些小鼠 NF1 神经胶质瘤细胞系⁸。此处使用的儿科品系来源于半球、中线和小脑儿科 HGG，取自儿童脑肿瘤网络并由其完全表征（突变和基因表达谱）⁹。这些细胞系经过修饰以表达核红荧光蛋白 （RFP），从而允许使用 Incucyte® 实时成像系统监测增殖和存活。RFP 信号的强度代表存在的细胞数量。也可以使用其他荧光团，如绿色荧光蛋白 （GFP）。

儿童急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、上皮恶性肿瘤和许多其他癌症的联合化疗是根除肿瘤和防止对单一药物耐药的有效方法^10,11。然而，关于联合使用哪些药物以实现 HGG 的治疗敏感性的信息有限，鼓励在体外药物测试中使用更准确的球状体模型。

研究方案

所有方案程序均已获得费城儿童医院机构审查委员会 （IRB） 的批准。

1. 3D球状细胞铺板

1. 制备神经胶质瘤干细胞培养基：要制备基础培养基，向基础培养基 （500 mL） 中加入 50 mL 增殖补充剂和 5 mL 100x 青霉素-链霉素溶液 （10,000 U/mL）。要制备神经胶质瘤干细胞培养基，请按照制造商说明添加表皮生长因子 （EGF） 和碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF） 至终浓度分别为 20 ng/mL 和 10 ng/mL。
   注：神经胶质瘤干细胞培养基在 4 °C 下储存时可使用 1 周。
2. 解离表达 RFP 的细胞：
   注：在本例中，使用小鼠 NF1 HGG 干细胞系 5746。
   1. 将神经胶质瘤球转移到 15 mL 锥形管中，并在离心机（150 x g ，5 分钟）中旋转神经胶质瘤球体。去除上清液并加入 300 μL accutase 以解离球体（在 37 °C 下孵育 5 分钟）。
   2. 加入 1 mL 神经胶质瘤干细胞培养基，轻轻移液破坏球体。将解离的细胞以 150 x g 离心 5 分钟，吸出上清液，并将沉淀溶解在 1 mL 神经胶质瘤干细胞培养基中。
3. 使用细胞计数器或血细胞计数器测量细胞浓度。使用荧光细胞计数仪时，将 18 μL 细胞悬液添加到 2 μL 吖啶橙/碘化丙啶染色剂中。在血细胞计数器中加载 12 μL 这种悬浮液，以计算悬浮液中存在的活/死细胞的数量。
4. 将细胞稀释至每 100 μL 神经胶质瘤干细胞培养基 2,000 个细胞的最终浓度。
   注：细胞浓度的修饰可能依赖于细胞系，并且可以相应地进行调整。
5. 使用多通道移液器，通过反向移液在 96 孔圆底低连接板的每个孔中分配 100 μL 细胞悬液（每 100 μL 2,000 个细胞）。
   注意：使用圆底低连接板;这些板将刺激在每个孔中形成单个胶质瘤球。反向移液可避免气泡的形成，气泡会干扰活细胞分析系统的图像捕获。
6. 将板以 150 x g 离心 5 分钟。
   注意：离心是启动 3D 神经球形成的关键步骤。
7. 孵育过夜，让每个孔中形成一个球体。

2. 添加用于协同测定的药物（图 1）

1. 确保 96 孔板的每个孔都接受特定浓度的药物 1 和 2。创建一个网格，其中药物 1 的每种浓度与药物 2 的每种浓度一式两份组合在一起。
2. 使用神经胶质瘤干细胞培养基对将要确定协同作用的两种药物（药物 1 的 5 个稀释液和药物 2 的 7 个稀释液）进行连续稀释（图 1A）。
   注：在本研究中，使用 50% 连续稀释系列;但是，可以使用任何稀释系列。
   1. 稀释系列的浓度应比每个孔中所需的最终浓度高 7 倍。例如，如果药物 1 的最高最终浓度为 1 μM，则将药物 1 稀释系列的第一个浓度设置为 7 μM（1 mL， 图 1A 中的试管 B 或 I）。
   2. 将 500 μL 神经胶质瘤干细胞培养基添加到稀释系列的每个额外试管中（试管 CH 和 JM，如图 1 所示）。
   3. 要创建稀释系列，请从试管 B 或试管 I 中吸出 500 μL 药物混合物，并将其分别添加到稀释系列试管 C 或试管 J 中的下一个试管中（含有 500 μL 胶质瘤干细胞培养基）。充分混合并重复稀释系列中的下一管。制作 DMSO 对照（管 A）并确保 DMSO 浓度在不同条件下相同。
      注：可以修改药物浓度和稀释系列。如果稀释系列发生变化，请确保在 补充文件 1 中列出正确的药物浓度。
3. 如图 1B 所示，向 96 孔板的每个孔中，通过反向移液加入 20 μL 药物 1 和 20 μL 药物 2，最终体积为每孔 140 μL;药物组合一式两份进行评估。如果使用提供的 IC50 和 LD50 下游分析，请使用如图 1B 所示的药物布局。
   1. 在该测定中，还测量每种药物本身（不存在其他药物）的效果。确保向这些单个药物孔中加入 20 μL DMSO 对照培养基（ 图 1B 中的试管 A），以使每个孔的最终体积达到 140 μL。
   2. 确保孔中不包含气泡，因为这会影响成像。
      注意：可以对最终卷进行修改;但是，请确保在第 2.2 点中调整浓度。
4. 将板放入实时成像仪中，并使用球体模块、单球体设置监测每个孔中每个球体的生长，以 4 倍放大倍率对明场和 RFP 进行成像。
5. 监测板 72 小时，以固定的时间间隔（通常为 2 小时）对板的每个孔进行成像。
   注意：上传正确的板图;这将确保适当的下游分析（图 1C）。

3. IC50、LD50 和协同评分的计算（图 2 和 图 3）

1. 使用实时成像仪软件分析每个孔和每个时间点的 RFP 强度。使用的分析参数列在补充文件 （补充文件 2） 中。
   注意：可根据需要使用不同的分析参数。
2. 将 RFP 数据导出为每个孔 的总红色综合 RFP 强度 ，确保导出原始非分组数据（图 2A）。
   注意：如果使用提供的模板（补充文件 1）计算 IC50 和 LD50，则必须遵守第 3.2 点
3. 通过将原始数据粘贴到提供的 excel 表中，确定 （1） 仅与 DMSO 相比的倍数变化（对于此计算，不需要 0 h 值）和 （2） 与 0 h 相比倍数变化的 Log2 与提供的 excel 表格（图 2B 并参见 补充文件 1 中的示例）。
4. 在电子表格中调整药物 1 和 2 的最大浓度（图 2B）。
   注意：确保调整药物 1 和 2 的浓度;否则，将计算出不正确的 LD50 和 IC50 值。
5. 使用适当的数据分析软件应用程序计算IC 50值（此处使用GraphPad）。对于 IC 50 值计算，使用仅在步骤 3.4 中确定 的与 DMSO 相比的平均倍数变化和标准差倍数变化 ，并将药物 1 和 2 的 IC 50 表复制到数据分析软件中（Log（抑制剂）与归一化响应，可变斜率）（图 3A）。
   1. 仅使用来自添加单个成分的孔的数据进行 IC 50 计算。使用数据分析软件中的 Log drug concentration 值，这些值在提供的电子表格中自动计算。
6. 计算协同效应分数：
   1. 仅使用每种组合与 DMSO 相比的平均倍数变化来计算使用软件包或网站的协同评分。例如，https://synergyfinder.fimm.fi/ ¹²（参数：LL4 曲线拟合，用于协同分数计算的 ZIP 方法）。补充文件 1 自动计算创建可上传到 SynergyFinder 的 synergy 输入表所需的值（图 3B）。补充文件 3 中提供了 synergy 输入表的示例。
      注意：高于 10 的分数表示协同作用，低于 -10 的分数表示对抗，介于 -10 和 10 之间的值表示附加效果。
7. 计算 LD50 分数：
   1. 对于药物 1 的每种浓度，计算药物 2 的 LD 50 。补充文件会自动计算每个浓度的 Log2 值和标准偏差（图 3C）。
   2. 输入 与 0 h 相比 Log2 倍数变化的平均和标准偏差，以及数据分析软件中的重复次数（在本研究中为 2），并通过确定 -1 时的浓度来计算 LD 50 值和 LD 50 标准偏差（Log 2 = -1 表示与 0 h 相比丢失 50% 信号的 log 2 值）。在这些计算中，使用 Log（inhibitor） vs. response， variable slope 4 parameters 模型。
      注意：数据分析软件不会自动计算对应于 log2 = -1 值的药物浓度;但是，该值可以作为用户定义的方程添加到数据分析软件的报告计算中（图 3C）。确保使用数据分析软件中的 Log concentration 值，这些值在提供的电子表格中自动计算。 补充文件 4 显示了 GraphPad 软件中的 IC50 和 LD50 面板。

结果

例如，评估了曲美替尼（MEK 抑制剂）和 GDC-0941（PI3K 抑制剂）的协同作用，它们抑制小鼠神经胶质瘤干细胞系 5746（表达 RFP）中的两种 RAS 下游效应通路（图 4）。 图 4A 显示了用 Trametinib 和 GDC-0941 的组合处理的 0 小时和 72 小时的相同球体。这些图像直接从实时成像软件中导出。按照 GraphPad 中的描述计算 IC50 和 LD50（

讨论

该方案描述了 3D 药物筛选测定，这些测定已有效用于评估神经胶质瘤⁸ 球状体模型中的药物脆弱性。该 3D 球状体检测系统经过专门设计，可对球体中生长的神经胶质瘤细胞系的组合化疗进行更准确的临床前研究。对于 HGG，这种方法为识别这种毁灭性疾病的潜在药物脆弱性提供了一个框架。然而，该系统的潜在应用不仅限于神经胶质瘤，该方案可用于在?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL centrifugation tubes	CELLTREAT	229411	15 mL polypropylene centrifuge tubes, sterile
96- well plate	S-bio	MS9096UZ	96-well round-bottom ultra-low attachment plate
Accutase	STEMCELL Technologies	7922	Cell detachment solution
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain	Logos Biosystems	F23001	Live/dead stain for cell counting
bFGF	STEMCELL Technologies	78003.2	Human recombinant bFGF
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Centrifuging cells and plates
DMSO	Pierce	20688	solvent for compounds
EGF	STEMCELL Technologies	78006.2	Human recombinant EGF
Eppendorf tubes	Costar	07-200-534	Microcentrifuge tubes
Excel	Microsoft		Microsoft excel
GDC-0941	Selleckchem	S1065	Drug 1
GraphPad	GraphPad	GraphPad Prism 9	Calculation of IC50 and LD50
Hemocytometer	Logos Biosystems	LGBD10008	Luna PhotonSlide
Incucyte	Sartorius	S3	Fluorescence microscope embedded in the tissue culture incubator that images every well at specific time intervals.
Incucyte software	Sartorius	Incucyte 2022B	Analysis of proliferation data
Media	STEMCELL Technologies	5702	NeuroCult (Mouse and Rat) proliferation kit containging Basal Medium and growth supplement
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Antibiotics to add to media
Trametinib	Selleckchem	S2673	Drug 2