Dépistage de la sensibilité aux médicaments sphéroïdes dans les lignées de cellules souches de gliome

Résumé

Les dépistages de sensibilité aux médicaments in vitro sont des outils importants pour découvrir des associations de médicaments anticancéreux. Les cellules cultivées dans des sphères activent différentes voies de signalisation et sont considérées comme plus représentatives des modèles in vivo que les lignées cellulaires monocouches. Ce protocole décrit une méthode de criblage in vitro de lignées sphéroïdes.

Résumé

Les dépistages in vitro de sensibilité aux médicaments sont des outils importants dans la découverte de combinaisons de médicaments anticancéreux. En règle générale, ces criblages de médicaments in vitro sont effectués sur des cellules cultivées en monocouche. Cependant, ces modèles bidimensionnels (2D) sont considérés comme moins précis que les modèles tridimensionnels (3D) de cellules sphéroïdes ; Cela est particulièrement vrai pour les lignées de cellules souches de gliome. Les cellules cultivées dans des sphères activent différentes voies de signalisation et sont considérées comme plus représentatives des modèles in vivo que les lignées cellulaires monocouches. Ce protocole décrit une méthode de criblage in vitro de lignées de sphéroïdes ; Les lignées de cellules souches de gliome de souris et d’homme sont utilisées à titre d’exemple. Ce protocole décrit un test de sensibilité et de synergie de médicament sphéroïde 3D qui peut être utilisé pour déterminer si un médicament ou une combinaison de médicaments induit la mort cellulaire et si deux médicaments agissent en synergie. Les lignées de cellules souches de gliome sont modifiées pour exprimer RFP. Les cellules sont plaquées dans des plaques à faible fixation autour du fond du puits 96, et les sphères sont autorisées à se former pendant la nuit. Des médicaments sont ajoutés et la croissance est surveillée en mesurant le signal RFP au fil du temps à l’aide du système d’imagerie en direct Incucyte, un microscope à fluorescence intégré dans l’incubateur de culture tissulaire. La concentration inhibitrice demi-maximale (CI50), la dose létale médiane (DL50) et le score de synergie sont ensuite calculés pour évaluer les sensibilités aux médicaments seuls ou en combinaison. La nature tridimensionnelle de ce test fournit une réflexion plus précise de la croissance tumorale, du comportement et des sensibilités aux médicaments in vivo, constituant ainsi la base d’une enquête préclinique plus approfondie.

Introduction

Le glioblastome est un néoplasme cérébral dévastateur de haut grade avec une survie globale à cinq ans de 5 %¹. Les gliomes de haut grade (HGG) comme le glioblastome représentent la principale cause de mortalité liée au cancer dans la population pédiatrique² et sont l’une des tumeurs les plus récalcitrantes à traiter chez les^{adultes 3.} Malgré des progrès significatifs dans notre compréhension des moteurs moléculaires de HGG, les options de traitement restent limitées³, ce qui souligne la nécessité de méthodes de dépistage de médicaments qui prédisent plus précisément les sensibilités thérapeutiques en clinique.

Les cultures cellulaires 3D ont été principalement utilisées pour la modélisation du comportement cellulaire physiologiquement pertinent⁴. De plus, l’architecture 3D du microenvironnement tumoral peut être récapitulée in vitro en établissant des tests de croissance 3D⁵. La croissance des sphéroïdes active également différentes voies de signalisation et est donc considérée comme plus représentative des modèles in vivo ^6,7 par rapport à la culture 2D. Les cellules souches HGG pédiatriques et nos lignées de cellules souches de gliome NF1 de souris se développent naturellement comme des neurosphères, et ont utilisé ces lignées cellulaires de gliome NF1 de souris dans un criblage de médicaments à débit moyen⁸. Les lignées pédiatriques utilisées ici ont été dérivées de HGG pédiatriques hémisphériques, médianes et cérébelleux et ont été acquises et entièrement caractérisées par le Children’s Brain Tumor Network (profils de mutation et d’expression génique)⁹. Ces lignées ont été modifiées pour exprimer une protéine fluorescente rouge nucléaire (RFP), qui permet de surveiller la prolifération et la survie à l’aide du système d’imagerie en direct Incucyte. L’intensité du signal RFP est représentative du nombre de cellules présentes. D’autres fluorophores, comme la protéine fluorescente verte (GFP), pourraient également être utilisés.

La chimiothérapie combinée pour la leucémie lymphoblastique aiguë de l’enfant, les lymphomes, les tumeurs malignes épithéliales et de nombreux autres cancers est un moyen efficace d’éradiquer les tumeurs et de prévenir la résistance aux médicaments à des agents uniques^10,11. Cependant, il existe peu d’informations sur les agents à combiner pour obtenir des sensibilités thérapeutiques dans le HGG, ce qui encourage l’utilisation de modèles sphéroïdes plus précis dans les tests de médicaments in vitro.

Protocole

Toutes les procédures du protocole ont été approuvées par le Children’s Hospital of Philadelphia Institutional Review Board (IRB).

1. 3D placage de cellules sphéroïdes

1. Préparez le milieu de base pour les cellules souches du gliome : Ajoutez 50 ml du supplément de prolifération et 5 ml d’une solution de pénicilline et de streptomycine 100x (10 000 U/mL) au milieu basal (500 mL). Pour fabriquer un milieu de cellules souches de gliome, ajoutez le facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) à une concentration finale de 20 ng/mL et 10 ng/mL, respectivement, selon la description du fabricant.
   REMARQUE : Les milieux de cellules souches de gliome peuvent être utilisés pendant 1 semaine lorsqu’ils sont conservés à 4 °C.
2. Dissocier les cellules exprimant RFP :
   REMARQUE : Dans cet exemple, la lignée de cellules souches NF1 HGG 5746 de souris est utilisée.
   1. Transférez les sphères de gliome dans un tube conique de 15 ml et faites tourner les sphères de gliome dans une centrifugeuse (150 x g pendant 5 min). Retirer le surnageant et ajouter 300 μL d’accutase pour dissocier les sphères (incuber 5 min à 37 °C).
   2. Ajouter 1 mL de milieu de cellules souches de gliome et perturber les sphères par un pipetage doux. Centrifuger les cellules dissociées pendant 5 minutes à 150 x g, aspirer le surnageant et dissoudre la pastille dans 1 mL de milieu de cellules souches de gliome.
3. Mesurez la concentration des cellules à l’aide d’un compteur de cellules ou d’un hémocytomètre. Lorsque vous utilisez un compteur de cellules à fluorescence, ajoutez 18 μL de suspension cellulaire à 2 μL de colorant à l’orange d’acridine/iodure de propidium. Chargez 12 μL de cette suspension dans un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules vivantes/mortes présentes dans la suspension.
4. Diluer les cellules jusqu’à une concentration finale de 2 000 cellules par 100 μL de milieu de cellules souches de gliome.
   REMARQUE : Les modifications de la concentration cellulaire peuvent dépendre de la lignée cellulaire et peuvent être ajustées en conséquence.
5. À l’aide d’une pipette multicanaux, distribuer 100 μL de suspension cellulaire (2 000 cellules par 100 μL) dans chaque puits d’une plaque de fixation basse à fond rond à 96 puits par pipetage inversé.
   REMARQUE : Utilisez des plaques de fixation basses à fond rond ; Ces plaques stimuleront la formation d’une seule sphère de gliome dans chaque puits. Le pipetage inverse évite la formation de bulles, ce qui interférera avec la capture d’image du système d’analyse de cellules vivantes.
6. Centrifuger les plaques à 150 x g pendant 5 min.
   REMARQUE : La centrifugation est une étape critique pour initier la formation de la neurosphère 3D.
7. Incuber toute la nuit pour permettre à une seule sphère de se former dans chaque puits.

2. Ajout de médicaments pour le test de synergie (Figure 1)

1. Assurez-vous que chaque puits de la plaque de 96 puits reçoit une concentration spécifique des médicaments 1 et 2. Créez une grille où chaque concentration du médicament 1 est combinée avec chaque concentration du médicament 2 en double.
2. Effectuez une dilution en série des deux médicaments pour lesquels la synergie sera déterminée (5 dilutions du médicament 1 et 7 dilutions du médicament 2) à l’aide du milieu de cellules souches de gliome (Figure 1A).
   REMARQUE : Dans cette étude, une série de dilutions en série de 50 % est utilisée ; Cependant, n’importe quelle série de dilution peut être utilisée.
   1. La série de dilution doit être 7 fois plus concentrée que la concentration finale souhaitée dans chaque puits. Par exemple, si la concentration finale la plus élevée pour le médicament 1 est de 1 μM, effectuer la première concentration de la série de dilution pour le médicament 1, 7 μM (1 mL, tube B ou I sur la figure 1A).
   2. Ajouter 500 μL de milieu de cellules souches de gliome dans chaque tube supplémentaire de la série de dilution (tubes C-H et J-M, comme illustré à la figure 1).
   3. Pour créer la série de dilution, aspirez 500 μL du mélange médicamenteux du tube B ou du tube I et ajoutez-le dans le tube suivant de la série de dilution Tube C ou Tube J, respectivement (contenant 500 μL de cellules souches de gliome). Mélangez bien et répétez l’opération jusqu’au tube suivant de la série de dilution. Effectuez un contrôle DMSO (tube A) et assurez-vous que la concentration de DMSO est la même dans toutes les conditions.
      REMARQUE : Des modifications aux concentrations du médicament et aux séries de dilution peuvent être apportées. Assurez-vous d’indiquer les concentrations correctes du médicament dans le fichier supplémentaire 1 si la série de dilution est modifiée.
3. À chaque puits des plaques de 96 puits, ajouter 20 μL de médicament 1 et 20 μL de médicament 2 par pipetage inverse, comme le montre la figure 1B, pour un volume final de 140 μL par puits ; Les combinaisons de médicaments sont évaluées en double. Si vous utilisez l’analyse en aval fournie pour la CI50 et la DL50, utilisez la présentation du médicament comme illustré à la figure 1B.
   1. Dans ce test, l’effet de chaque médicament seul (sans la présence de l’autre médicament) est également mesuré. Assurez-vous d’ajouter 20 μL de média de contrôle DMSO (tube A sur la figure 1B) à ces puits de médicament uniques pour porter le volume final de chaque puits à 140 μL.
   2. Assurez-vous que les puits ne contiennent pas de bulles, car cela affecterait l’imagerie.
      REMARQUE : Des modifications au volume final peuvent être apportées ; Cependant, assurez-vous d’ajuster les concentrations au point 2.2.
4. Placez les plaques dans l’imageur en direct et surveillez la croissance de chaque sphère dans chaque puits à l’aide du module sphéroïde, du réglage de la sphère unique, de l’imagerie en fond clair et RFP à un grossissement de 4x.
5. Surveillez les plaques pendant 72 h, en imageant chaque puits de la plaque à un intervalle de temps régulier, généralement 2 h.
   REMARQUE : Téléchargez une carte de plaque correcte ; cela garantira une analyse en aval correcte (Figure 1C).

3. Calcul de la CI50, de la DL50 et du score de synergie (Figure 2 et Figure 3)

1. Analysez l’intensité de l’appel d’offres pour chaque puits et chaque point temporel à l’aide du logiciel d’imagerie en direct. Les paramètres d’analyse utilisés sont répertoriés dans les fichiers supplémentaires (Fichier supplémentaire 2).
   REMARQUE : Différents paramètres d’analyse peuvent être utilisés selon les préférences.
2. Exportez les données de l’appel d’offres sous forme d’intensité totale de l’appel d’offres intégré rouge pour chaque puits, en veillant à exporter les données brutes non groupées (Figure 2A).
   REMARQUE : Si vous utilisez le modèle fourni (fichier supplémentaire 1) pour calculer la CI50 et la DL50, il est essentiel de respecter le point 3.2
3. Déterminez la moyenne et l’écart-type pour chaque association médicamenteuse de (1) le changement de pli par rapport au DMSO uniquement (pour ce calcul, les valeurs de 0 h ne sont pas nécessaires) et (2) le Log2 du changement de pli par rapport à 0 h en collant les données brutes dans la feuille Excel fournie (Figure 2B et voir l’exemple dans le fichier supplémentaire 1).
4. Ajustez la concentration maximale des médicaments 1 et 2 dans la feuille de calcul (figure 2B).
   REMARQUE : Assurez-vous d’ajuster les concentrations des médicaments 1 et 2 ; sinon, des valeurs DL50 et IC50 incorrectes seront calculées.
5. Calculez les valeurs CI50 à l’aide d’un logiciel d’analyse de données approprié (ici, GraphPad est utilisé). Pour le calcul de la valeur de la CI50, utilisez la variation moyenne du pli et la variation du pli de l’écart-type par rapport au DMSO uniquement déterminées à l’étape 3.4, et copiez les tables de la CI50 des médicaments 1 et 2 dans le logiciel d’analyse des données (log(inhibiteur) par rapport à la réponse normalisée, pente variable) (figure 3A).
   1. N’utilisez que les données des puits auxquels un seul composant a été ajouté pour les calculs de la CI50. Utilisez l’option Log les valeurs de concentration de médicament dans le logiciel d’analyse de données, qui sont automatiquement calculées dans la feuille de calcul fournie.
6. Calculer le score de synergie :
   1. Utilisez uniquement le changement de pli moyen par rapport au DMSO de chaque combinaison pour calculer le score de synergie à l’aide d’un progiciel ou d’un site Web. Par exemple, https://synergyfinder.fimm.fi/ ¹² (paramètres : ajustement de la courbe LL4, méthode ZIP pour le calcul du score de synergie). Le fichier supplémentaire 1 calcule automatiquement les valeurs nécessaires à la création de la table d’entrée de synergie qui peut être téléchargée sur SynergyFinder (figure 3B). Un exemple du tableau d’entrée des synergies est fourni dans le fichier supplémentaire 3.
      REMARQUE : Un score supérieur à 10 indique une synergie, un score inférieur à -10 indique un antagonisme et une valeur comprise entre -10 et 10 montre des effets additifs.
7. Calculez le score DL50 :
   1. Pour chaque concentration du médicament 1, calculer la DL50 du médicament 2. Le fichier supplémentaire calcule automatiquement la valeur Log2 et l’écart-type pour chaque concentration (figure 3C).
   2. Entrez la moyenne et l’écart-type de la variation de pli Log2 par rapport à 0 h, ainsi que le nombre de répétitions dans le logiciel d’analyse de données (dans cette étude, 2,) et calculez la valeur DL50 et l’écart-type DL50 en déterminant la concentration à -1 (Log2 = -1 représente la valeur log2 pour laquelle 50 % du signal est perdu par rapport à 0 h). Dans ces calculs, utilisez le modèle de paramètres Log(inhibiteur) en fonction de la réponse, pente variable 4.
      REMARQUE : Le logiciel d’analyse de données ne calcule pas automatiquement la concentration du médicament correspondant à une valeur log2 = -1 ; cependant, cette valeur peut être ajoutée aux calculs rapportés par le logiciel d’analyse de données sous la forme d’une équation définie par l’utilisateur (figure 3C). Assurez-vous d’utiliser les valeurs de concentration logarithmique dans le logiciel d’analyse de données, qui sont automatiquement calculées dans la feuille de calcul fournie. Le fichier supplémentaire 4 montre les panneaux IC50 et LD50 dans le logiciel GraphPad.

Résultats

À titre d’exemple, la synergie du Trametinib (inhibiteur de MEK) et du GDC-0941 (inhibiteur de PI3K), qui inhibent deux voies effectrices en aval de RAS dans la lignée de cellules souches de gliome de souris 5746 (expression de RFP) a été évaluée (Figure 4). La figure 4A montre la même sphère à 0 h et 72 h traitée avec une combinaison de Trametinib et de GDC-0941. Ces images ont été exportées directement depuis le...

Discussion

Ce protocole décrit les tests de criblage de médicaments en 3D qui ont été utilisés efficacement pour évaluer les vulnérabilités aux médicaments dans des modèles sphéroïdes de gliome⁸. Ce système de dosage de sphéroïdes 3D a été spécialement conçu pour permettre une investigation préclinique plus précise des chimiothérapies combinatoires pour les lignées cellulaires de gliome cultivées en sphères. Pour HGG, cette méthode fournit un cadre ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL centrifugation tubes	CELLTREAT	229411	15 mL polypropylene centrifuge tubes, sterile
96- well plate	S-bio	MS9096UZ	96-well round-bottom ultra-low attachment plate
Accutase	STEMCELL Technologies	7922	Cell detachment solution
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain	Logos Biosystems	F23001	Live/dead stain for cell counting
bFGF	STEMCELL Technologies	78003.2	Human recombinant bFGF
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Centrifuging cells and plates
DMSO	Pierce	20688	solvent for compounds
EGF	STEMCELL Technologies	78006.2	Human recombinant EGF
Eppendorf tubes	Costar	07-200-534	Microcentrifuge tubes
Excel	Microsoft		Microsoft excel
GDC-0941	Selleckchem	S1065	Drug 1
GraphPad	GraphPad	GraphPad Prism 9	Calculation of IC50 and LD50
Hemocytometer	Logos Biosystems	LGBD10008	Luna PhotonSlide
Incucyte	Sartorius	S3	Fluorescence microscope embedded in the tissue culture incubator that images every well at specific time intervals.
Incucyte software	Sartorius	Incucyte 2022B	Analysis of proliferation data
Media	STEMCELL Technologies	5702	NeuroCult (Mouse and Rat) proliferation kit containging Basal Medium and growth supplement
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Antibiotics to add to media
Trametinib	Selleckchem	S2673	Drug 2