Screening der Empfindlichkeit von Sphäroiden in Gliom-Stammzelllinien

Zusammenfassung

In-vitro-Sensitivitätsscreenings sind wichtige Instrumente zur Entdeckung von Kombinationen von Krebsmedikamenten. Zellen, die in Kugeln gezüchtet werden, aktivieren unterschiedliche Signalwege und gelten als repräsentativer für in vivo-Modelle als Monolayer-Zelllinien. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum in vitro Wirkstoffscreening auf Sphäroidlinien.

Zusammenfassung

In-vitro-Sensitivitätsscreenings sind wichtige Instrumente bei der Entdeckung von Kombinationstherapien gegen Krebsmedikamente. In der Regel werden diese In-vitro-Wirkstoffscreenings an Zellen durchgeführt, die in einer Monoschicht gezüchtet wurden. Diese zweidimensionalen (2D) Modelle gelten jedoch im Vergleich zu dreidimensionalen (3D) Sphäroidzellmodellen als weniger genau. Dies gilt insbesondere für Gliom-Stammzelllinien. Zellen, die in Kugeln gezüchtet werden, aktivieren unterschiedliche Signalwege und gelten als repräsentativer für in vivo-Modelle als Monolayer-Zelllinien. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für das In-vitro-Wirkstoffscreening von Sphäroidlinien; Als Beispiel dienen Stammzelllinien von Maus und humanen Gliomen. Dieses Protokoll beschreibt einen 3D-Sphäroid-Sensitivitäts- und Synergie-Assay, mit dem bestimmt werden kann, ob ein Medikament oder eine Wirkstoffkombination den Zelltod induziert und ob zwei Medikamente synergistisch wirken. Gliom-Stammzelllinien werden so modifiziert, dass sie RFP exprimieren. Die Zellen werden in geringer Bindung um die Platten mit dem Boden von 96 plattiert, und die Kugeln werden über Nacht gebildet. Medikamente werden hinzugefügt, und das Wachstum wird überwacht, indem das RFP-Signal im Laufe der Zeit mit dem Incucyte Live Imaging System gemessen wird, einem Fluoreszenzmikroskop, das in den Gewebekultur-Inkubator eingebettet ist. Anschließend werden die Hälfte der maximalen Hemmkonzentration (IC50), der medianen letalen Dosis (LD50) und des Synergie-Scores berechnet, um die Empfindlichkeit gegenüber Arzneimitteln allein oder in Kombination zu bewerten. Die dreidimensionale Natur dieses Assays ermöglicht eine genauere Reflexion des Tumorwachstums, des Verhaltens und der Arzneimittelempfindlichkeit in vivo und bildet somit die Grundlage für weitere präklinische Untersuchungen.

Einleitung

Das Glioblastom ist eine verheerende, hochgradige Neubildung des Gehirns mit einer Gesamtüberlebensrate von 5 % über fünf Jahre¹. Hochgradige Gliome (HGG) wie das Glioblastom stellen die häufigste Ursache für krebsbedingte Mortalität in der pädiatrischen Bevölkerung^{dar 2} und sind auch bei Erwachsenen eine der hartnäckigsten Tumoren, die behandelt werden^{müssen 3}. Trotz erheblicher Fortschritte in unserem Verständnis der molekularen Treiber von HGG sind die Behandlungsmöglichkeiten nach wie vor begrenzt³, was den Bedarf an Wirkstoff-Screening-Methoden unterstreicht, die die therapeutische Sensitivität in der Klinik genauer vorhersagen.

3D-Zellkulturen werden bisher vor allem für die Modellierung physiologisch relevanten Zellverhaltens eingesetzt⁴. Darüber hinaus kann die 3D-Architektur der Tumormikroumgebung in vitro durch die Etablierung von 3D-Wachstumsassays rekapituliert werden⁵. Das Sphäroidwachstum aktiviert auch verschiedene Signalwege und gilt daher als repräsentativer für in vivo-Modelle ^6,7 im Vergleich zur 2D-Kultur. Pädiatrische HGG-Stammzellen und unsere Maus-NF1-Gliom-Stammzelllinien wachsen auf natürliche Weise als Neurosphären und verwendeten diese Maus-NF1-Gliom-Zelllinien in einem Wirkstoffscreening mit mittlerem Durchsatz⁸. Die hier verwendeten pädiatrischen Linien stammen aus hemisphärischem, mittellinienförmigem und zerebellärem pädiatrischem HGG und wurden aus dem Children's Brain Tumor Network gewonnen und vollständig charakterisiert (Mutations- und Genexpressionsprofile⁾⁹. Diese Linien wurden so modifiziert, dass sie ein nukleäres rot fluoreszierendes Protein (RFP) exprimieren, das die Überwachung der Proliferation und des Überlebens mit dem Incucyte-Live-Imaging-System ermöglicht. Die Intensität des RFP-Signals ist repräsentativ für die Anzahl der vorhandenen Zellen. Andere Fluorophore, wie das grün fluoreszierende Protein (GFP), könnten ebenfalls verwendet werden.

Die Kombinationschemotherapie bei akuter lymphatischer Leukämie im Kindesalter, Lymphomen, epithelialen Malignomen und vielen anderen Krebsarten ist ein wirksames Mittel, um Tumore auszurotten und eine Arzneimittelresistenz gegen einzelne Wirkstoffe zu verhindern^10,11. Es gibt jedoch nur begrenzte Informationen darüber, welche Wirkstoffe kombiniert werden müssen, um therapeutische Sensitivitäten bei HGG zu erreichen, was die Verwendung genauerer Sphäroidmodelle in In-vitro-Arzneimitteltests fördert.

Protokoll

Alle protokollarischen Verfahren wurden vom Institutional Review Board (IRB) des Kinderkrankenhauses von Philadelphia genehmigt.

1. 3D Sphäroid-Zellplattierung

1. Präparat des Gliom-Stammzellmediums: Um das Basismedium herzustellen, fügen Sie dem Basalmedium (500 ml) 50 ml des Proliferationspräparats und 5 ml einer 100-fachen Penicillin-Streptomycin-Lösung (10.000 U/ml) hinzu. Zur Herstellung von Gliom-Stammzellmedien fügen Sie den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) in einer Endkonzentration von 20 ng/ml bzw. 10 ng/ml hinzu, wie in der Herstellerbeschreibung angegeben.
   HINWEIS: Gliom-Stammzellmedien können bei Lagerung bei 4 °C 1 Woche lang verwendet werden.
2. Dissoziieren Sie RFP-exprimierende Zellen:
   HINWEIS: In diesem Beispiel wird die Maus NF1 HGG-Stammzelllinie 5746 verwendet.
   1. Übertragen Sie die Gliomkugeln in ein konisches 15-ml-Röhrchen und schleudern Sie die Gliomkugeln in einer Zentrifuge (150 x g für 5 Minuten). Den Überstand entfernen und 300 μl Accutase zugeben, um die Kugeln zu dissoziieren (5 min bei 37 °C inkubieren).
   2. Fügen Sie 1 ml Gliom-Stammzellmedium hinzu und zerkleinern Sie die Kugeln durch sanftes Pipettieren. Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen 5 Minuten lang bei 150 x g, aspirieren Sie den Überstand und lösen Sie das Pellet in 1 ml Gliom-Stammzellmedium auf.
3. Messen Sie die Konzentration der Zellen mit einem Zellzähler oder Hämozytometer. Wenn Sie einen Fluoreszenzzellzähler verwenden, fügen Sie 18 μl der Zellsuspension zu 2 μl Acridinorange/Propidiumiodid-Färbung hinzu. Laden Sie 12 μl dieser Suspension in ein Hämozytometer, um die Anzahl der in der Suspension vorhandenen lebenden/toten Zellen zu zählen.
4. Verdünnen Sie die Zellen auf eine Endkonzentration von 2.000 Zellen pro 100 μl Gliom-Stammzellmedium.
   HINWEIS: Änderungen an der Zellkonzentration können von der Zelllinie abhängen und entsprechend angepasst werden.
5. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl der Zellsuspension (2.000 Zellen pro 100 μl) in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit rundem Boden und niedrigem Aufsatz durch umgekehrtes Pipettieren.
   HINWEIS: Verwenden Sie niedrige Befestigungsplatten mit rundem Boden; Diese Platten stimulieren die Bildung einer einzelnen Gliomkugel in jeder Vertiefung. Durch das Rückwärtspipettieren wird die Bildung von Blasen vermieden, die die Bilderfassung des Lebendzellanalysesystems beeinträchtigen.
6. Die Platten bei 150 x g 5 min zentrifugieren.
   HINWEIS: Die Zentrifugation ist ein kritischer Schritt, um die Bildung von 3D-Neurosphären zu initiieren.
7. Über Nacht inkubieren, damit sich in jeder Vertiefung eine einzelne Kugel bilden kann.

2. Hinzufügen von Medikamenten für den Synergie-Assay (Abbildung 1)

1. Stellen Sie sicher, dass jede Vertiefung der 96-Well-Platte eine bestimmte Konzentration der Arzneimittel 1 und 2 erhält. Erstellen Sie ein Raster, in dem jede Konzentration von Wirkstoff 1 mit jeder Konzentration von Wirkstoff 2 in doppelter Kombination kombiniert wird.
2. Führen Sie eine serielle Verdünnung der beiden Arzneimittel durch, für die die Synergie bestimmt wird (5 Verdünnungen von Arzneimittel 1 und 7 Verdünnungen von Arzneimittel 2) unter Verwendung des Gliom-Stammzellmediums (Abbildung 1A).
   HINWEIS: In dieser Studie wird eine serielle Verdünnungsreihe von 50 % verwendet; Es können jedoch beliebige Verdünnungsreihen verwendet werden.
   1. Die Verdünnungsreihe sollte 7x konzentrierter sein als die gewünschte Endkonzentration in jeder Vertiefung. Wenn z. B. die höchste Endkonzentration für Arzneimittel 1 1 μM beträgt, wird die erste Konzentration der Verdünnungsreihe für Arzneimittel 1, 7 μM (1 ml, Röhrchen B oder I in Abbildung 1A) hergestellt.
   2. Geben Sie 500 μl Gliom-Stammzellmedium in jedes weitere Röhrchen der Verdünnungsreihe (Röhrchen C-H und J-M, wie in Abbildung 1 gezeigt).
   3. Um die Verdünnungsreihe zu erzeugen, aspirieren Sie 500 μl des Wirkstoffgemisches aus Röhrchen B oder Röhrchen I und geben Sie es in das nächste Röhrchen der Verdünnungsreihe Röhrchen C bzw. Röhrchen J (das 500 μl Gliom-Stammzellmedium enthält). Gut mischen und bis zum nächsten Röhrchen in der Verdünnungsreihe wiederholen. Führen Sie eine DMSO-Kontrolle (Röhre A) durch und stellen Sie sicher, dass die DMSO-Konzentration unter allen Bedingungen gleich ist.
      HINWEIS: Änderungen an den Arzneimittelkonzentrationen und Verdünnungsreihen können vorgenommen werden. Stellen Sie sicher, dass die korrekten Arzneimittelkonzentrationen in der Zusatzdatei 1 aufgeführt sind, wenn die Verdünnungsreihe geändert wird.
3. In jede Vertiefung der 96-Well-Platten werden 20 μl Wirkstoff 1 und 20 μl Wirkstoff 2 durch Rückwärtspipettieren gegeben, wie in Abbildung 1B gezeigt, für ein Endvolumen von 140 μl pro Vertiefung; Medikamentenkombinationen werden doppelt bewertet. Wenn Sie die mitgelieferte Downstream-Analyse für IC50 und LD50 verwenden, verwenden Sie das Wirkstofflayout wie in Abbildung 1B gezeigt.
   1. Bei diesem Assay wird auch die Wirkung jedes Medikaments für sich (ohne dass das andere Medikament vorhanden ist) gemessen. Stellen Sie sicher, dass Sie 20 μl DMSO-Kontrollmedium (Röhrchen A in Abbildung 1B) in diese einzelnen Wirkstoffvertiefungen geben, um das endgültige Volumen jeder Vertiefung auf 140 μl zu bringen.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Vertiefungen keine Blasen enthalten, da dies die Bildgebung beeinträchtigt.
      HINWEIS: Änderungen am endgültigen Volumen können vorgenommen werden. Es ist jedoch darauf zu achten, dass die Konzentrationen in Nummer 2.2 angepasst werden.
4. Platzieren Sie die Platten in den Live-Imager und überwachen Sie das Wachstum jeder Kugel in jeder Vertiefung mit dem Sphäroidmodul, Einzelkugeleinstellung, wobei sowohl Hellfeld als auch RFP bei 4-facher Vergrößerung abgebildet werden.
5. Überwachen Sie die Platten 72 Stunden lang, wobei Sie jede Vertiefung der Platte in einem regelmäßigen Zeitintervall abbilden, in der Regel 2 Stunden.
   HINWEIS: Laden Sie eine korrekte Plattenkarte hoch; Dies gewährleistet eine ordnungsgemäße nachgelagerte Analyse (Abbildung 1C).

3. Berechnung von IC50, LD50 und Synergie-Score (Abbildung 2 und Abbildung 3)

1. Analysieren Sie die RFP-Intensität für jedes Well und jeden Zeitpunkt mit der Live-Imager-Software. Die verwendeten Analyseparameter sind in den Zusatzdateien (Zusatzdatei 2) aufgeführt.
   HINWEIS: Es können je nach Wunsch unterschiedliche Analyseparameter verwendet werden.
2. Exportieren Sie die RFP-Daten als Total Red Integrated RFP Intensity für jedes Bohrloch und stellen Sie sicher, dass die nicht gruppierten Rohdaten exportiert werden (Abbildung 2A).
   HINWEIS: Bei Verwendung der mitgelieferten Vorlage (Ergänzungsdatei 1) zur Berechnung von IC50 und LD50 ist unbedingt Punkt 3.2 einzuhalten
3. Bestimmen Sie den Durchschnitt und die Standardabweichung für jede Wirkstoffkombination aus (1) der Faltenänderung im Vergleich zu DMSO (für diese Berechnung werden die 0-h-Werte nicht benötigt) und (2) dem Log2 der Faltenänderung im Vergleich zu 0 h, indem Sie die Rohdaten in die bereitgestellte Excel-Tabelle einfügen (Abbildung 2B und siehe Beispiel in der Ergänzungsdatei 1).
4. Passen Sie die maximale Konzentration der Arzneimittel 1 und 2 in der Tabelle an (Abbildung 2B).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die Konzentrationen der Arzneimittel 1 und 2 anpassen. Andernfalls werden falsche LD50- und IC50-Werte berechnet.
5. Berechnen Sie IC50-Werte mit einer geeigneten Datenanalyse-Software (hier kommt GraphPad zum Einsatz). Verwenden Sie für die Berechnung des IC50-Wertes die durchschnittliche Faltungsänderung und die Standardabweichungsänderung der Faltung im Vergleich zu DMSO, die nur in Schritt 3.4 ermittelt wurden, und kopieren Sie die IC50-Tabellen der Medikamente 1 und 2 in die Datenanalysesoftware (Log(inhibitor) vs. normalisierte Reaktion, variable Steigung) (Abbildung 3A).
   1. Verwenden Sie für die IC50-Berechnungen nur Daten aus Bohrlöchern, zu denen eine einzelne Komponente hinzugefügt wurde. Verwenden Sie die Protokollwerte für die Arzneimittelkonzentration in der Datenanalysesoftware, die automatisch in der bereitgestellten Tabelle berechnet werden.
6. Synergie-Score berechnen:
   1. Verwenden Sie nur die durchschnittliche Fold-Änderung im Vergleich zu DMSO jeder Kombination, um den Synergie-Score mithilfe eines Softwarepakets oder einer Website zu berechnen. Zum Beispiel https://synergyfinder.fimm.fi/ ¹² (Parameter: LL4-Kurvenanpassung, ZIP-Methode zur Berechnung des Synergie-Scores). Ergänzende Datei 1 berechnet automatisch die Werte, die zum Erstellen der Synergie-Eingabetabelle erforderlich sind, die in SynergyFinder hochgeladen werden kann (Abbildung 3B). Ein Beispiel für die Eingabetabelle für Synergien finden Sie in der Zusatzdatei 3.
      HINWEIS: Eine Punktzahl über 10 bedeutet Synergie, eine unter -10 bedeutet Antagonismus und ein Wert zwischen -10 und 10 zeigt additive Effekte.
7. Berechnen Sie den LD50-Score:
   1. Berechnen Sie für jede Konzentration von Arzneimittel 1 die LD50 von Arzneimittel 2. Die Zusatzdatei berechnet automatisch den Log2-Wert und die Standardabweichung für jede Konzentration (Abbildung 3C).
   2. Geben Sie den Durchschnitt und die Standardabweichung der Log2-Faltungsänderung im Vergleich zu 0 h sowie die Anzahl der Wiederholungen in der Datenanalysesoftware ein (in dieser Studie 2,) und berechnen Sie den LD50-Wert und die LD50-Standardabweichung, indem Sie die Konzentration bei -1 bestimmen (Log2 = -1 steht für den log2-Wert, bei dem 50% des Signals im Vergleich zu 0 h verloren gehen). Verwenden Sie in diesen Berechnungen das Modell Log(inhibitor) vs. response, variable slope 4 parameters.
      HINWEIS: Die Datenanalysesoftware berechnet nicht automatisch die Arzneimittelkonzentration, die einem log2 = -1-Wert entspricht; Dieser Wert kann jedoch als benutzerdefinierte Gleichung zu den gemeldeten Berechnungen der Datenanalysesoftware addiert werden (Abbildung 3C). Stellen Sie sicher, dass Sie die Log-Konzentrationswerte in der Datenanalysesoftware verwenden, die automatisch in der bereitgestellten Tabelle berechnet werden. Die ergänzende Datei 4 zeigt die Panels IC50 und LD50 in der GraphPad-Software.

Ergebnisse

Als Beispiel wurde die Synergie von Trametinib (MEK-Inhibitor) und GDC-0941 (PI3K-Inhibitor) untersucht, die zwei RAS-Downstream-Effektorwege in der Maus-Gliom-Stammzelllinie 5746 (RFP-exprimierend) hemmen (Abbildung 4). Abbildung 4A zeigt die gleiche Kugel bei 0 h und 72 h, behandelt mit einer Kombination aus Trametinib und GDC-0941. Diese Bilder wurden direkt aus der Live-Imager-Software exportiert. IC50 und LD50 wurden wie in...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die 3D-Wirkstoffscreening-Assays, die effektiv zur Bewertung von Arzneimittelanfälligkeiten in Sphäroidmodellen von Gliomen⁸ eingesetzt wurden. Dieses 3D-Sphäroid-Assay-System wurde speziell entwickelt, um eine genauere präklinische Untersuchung von kombinatorischen Chemotherapien für Gliomzelllinien zu ermöglichen, die in Kugeln gezüchtet wurden. Für HGG bietet diese Methode einen Rahmen für die Identifizierung potenzieller An...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL centrifugation tubes	CELLTREAT	229411	15 mL polypropylene centrifuge tubes, sterile
96- well plate	S-bio	MS9096UZ	96-well round-bottom ultra-low attachment plate
Accutase	STEMCELL Technologies	7922	Cell detachment solution
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain	Logos Biosystems	F23001	Live/dead stain for cell counting
bFGF	STEMCELL Technologies	78003.2	Human recombinant bFGF
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Centrifuging cells and plates
DMSO	Pierce	20688	solvent for compounds
EGF	STEMCELL Technologies	78006.2	Human recombinant EGF
Eppendorf tubes	Costar	07-200-534	Microcentrifuge tubes
Excel	Microsoft		Microsoft excel
GDC-0941	Selleckchem	S1065	Drug 1
GraphPad	GraphPad	GraphPad Prism 9	Calculation of IC50 and LD50
Hemocytometer	Logos Biosystems	LGBD10008	Luna PhotonSlide
Incucyte	Sartorius	S3	Fluorescence microscope embedded in the tissue culture incubator that images every well at specific time intervals.
Incucyte software	Sartorius	Incucyte 2022B	Analysis of proliferation data
Media	STEMCELL Technologies	5702	NeuroCult (Mouse and Rat) proliferation kit containging Basal Medium and growth supplement
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Antibiotics to add to media
Trametinib	Selleckchem	S2673	Drug 2