Screening della sensibilità ai farmaci sferoidi nelle linee cellulari staminali di glioma

Riepilogo

Gli screening in vitro della sensibilità ai farmaci sono strumenti importanti per scoprire combinazioni di farmaci antitumorali. Le cellule coltivate in sfere attivano diverse vie di segnalazione e sono considerate più rappresentative dei modelli in vivo rispetto alle linee cellulari monostrato. Questo protocollo descrive un metodo per lo screening farmacologico in vitro per linee sferoidi.

Abstract

Gli screening in vitro della sensibilità ai farmaci sono strumenti importanti per la scoperta di terapie combinate di farmaci antitumorali. Tipicamente, questi screening farmacologici in vitro vengono eseguiti su cellule coltivate in un monostrato. Tuttavia, questi modelli bidimensionali (2D) sono considerati meno accurati rispetto ai modelli tridimensionali (3D) di cellule sferoidali; Ciò è particolarmente vero per le linee di cellule staminali di glioma. Le cellule coltivate in sfere attivano diverse vie di segnalazione e sono considerate più rappresentative dei modelli in vivo rispetto alle linee cellulari monostrato. Questo protocollo descrive un metodo per lo screening farmacologico in vitro di linee sferoidali; Come esempio vengono utilizzate linee di cellule staminali di glioma umano e di topo. Questo protocollo descrive un saggio 3D di sensibilità e sinergia dei farmaci sferoidi che può essere utilizzato per determinare se un farmaco o una combinazione di farmaci induce la morte cellulare e se due farmaci si sinergizzano. Le linee di cellule staminali di glioma vengono modificate per esprimere RFP. Le celle sono placcate in 96 piastre a fondo rotondo a pozzetto a basso attacco e le sfere possono formarsi durante la notte. Vengono aggiunti farmaci e la crescita viene monitorata misurando il segnale RFP nel tempo utilizzando il sistema di imaging dal vivo Incucyte, un microscopio a fluorescenza incorporato nell'incubatore di coltura tissutale. La concentrazione inibitoria semimassima (IC50), la dose letale mediana (LD50) e il punteggio di sinergia vengono successivamente calcolati per valutare la sensibilità ai farmaci da soli o in combinazione. La natura tridimensionale di questo test fornisce una riflessione più accurata della crescita tumorale, del comportamento e della sensibilità ai farmaci in vivo, costituendo così la base per ulteriori indagini precliniche.

Introduzione

Il glioblastoma è una neoplasia cerebrale devastante di alto grado con una sopravvivenza globale a cinque anni^{del 5% 1}. I gliomi di alto grado (HGG) come il glioblastoma rappresentano la principale causa di mortalità correlata al cancro nella popolazione pediatrica² e sono uno dei tumori più recalcitranti da trattare anche negli adulti³. Nonostante i significativi progressi nella nostra comprensione dei driver molecolari dell'HGG, le opzioni di trattamento^{rimangono limitate}, sottolineando la necessità di metodi di screening farmacologico che prevedano in modo più accurato le sensibilità terapeutiche in clinica.

Le colture cellulari 3D sono state utilizzate principalmente per la modellazione del comportamento cellulare fisiologicamente rilevante⁴. Inoltre, l'architettura 3D del microambiente tumorale può essere ricapitolata in vitro stabilendo saggi di crescita 3D⁵. La crescita degli sferoidi attiva anche diverse vie di segnalazione ed è quindi considerata più rappresentativa dei modelli in vivo ^6,7 rispetto alla coltura 2D. Le cellule staminali pediatriche HGG e le nostre linee di cellule staminali di glioma NF1 di topo crescono naturalmente come neurosfere e hanno utilizzato queste linee cellulari di glioma NF1 di topo in uno screening farmacologico a media produttività⁸. Le linee pediatriche qui utilizzate sono derivate da HGG pediatriche emisferiche, della linea mediana e cerebellari e sono state acquisite e completamente caratterizzate dal Children's Brain Tumor Network (profili di mutazione e espressione genica)⁹. Queste linee sono state modificate per esprimere una proteina fluorescente rossa nucleare (RFP), che consente il monitoraggio della proliferazione e della sopravvivenza utilizzando il sistema di imaging live Incucyte. L'intensità del segnale RFP è rappresentativa del numero di celle presenti. Potrebbero essere utilizzati anche altri fluorofori, come la proteina fluorescente verde (GFP).

La chemioterapia combinata per la leucemia linfoblastica acuta infantile, i linfomi, le neoplasie epiteliali e molti altri tumori è un modo efficace per eradicare i tumori e prevenire la resistenza ai farmaci ai singoli agenti^10,11. Tuttavia, ci sono informazioni limitate su quali agenti combinare per ottenere sensibilità terapeutiche nell'HGG, incoraggiando l'uso di modelli di sferoidi più accurati nei test farmacologici in vitro.

Protocollo

Tutte le procedure del protocollo sono state approvate dal Children's Hospital of Philadelphia Institutional Review Board (IRB).

1. 3D placcatura di celle sferoidi

1. Preparare i terreni di base delle cellule staminali del glioma: per creare i terreni di base, aggiungere 50 ml di integratore di proliferazione e 5 ml di una soluzione 100x di penicillina-streptomicina (10.000 U/mL) al terreno basale (500 ml). Per produrre terreni di coltura con cellule staminali di glioma, aggiungere il fattore di crescita epidermico (EGF) e il fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF) a una concentrazione finale di 20 ng/mL e 10 ng/mL, rispettivamente, secondo la descrizione del produttore.
   NOTA: I terreni di coltura con cellule staminali di glioma possono essere utilizzati per 1 settimana se conservati a 4 °C.
2. Dissociare le cellule che esprimono RFP:
   NOTA: In questo esempio, viene utilizzata la linea di cellule staminali NF1 HGG di topo 5746.
   1. Trasferire le sfere di glioma in una provetta conica da 15 ml e centrifugare le sfere di glioma in una centrifuga (150 x g per 5 minuti). Rimuovere il surnatante e aggiungere 300 μl di accutasi alle sfere dissociate (incubare per 5 minuti a 37 °C).
   2. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura con cellule staminali di glioma e disgregare le sfere mediante pipettaggio delicato. Centrifugare le cellule dissociate per 5 minuti a 150 x g, aspirare il surnatante e sciogliere il pellet in 1 mL di terreno di coltura di cellule staminali di glioma.
3. Misurare la concentrazione di cellule utilizzando un contatore di cellule o un emocitometro. Quando si utilizza un contatore di cellule a fluorescenza, aggiungere 18 μl di sospensione cellulare a 2 μl di colorazione di arancio acridina/ioduro di propidio. Caricare 12 μl di questa sospensione in un emocitometro per contare il numero di cellule vive/morte presenti nella sospensione.
4. Diluire le cellule a una concentrazione finale di 2.000 cellule per 100 μL di terreno di coltura staminale del glioma.
   NOTA: Le modifiche alla concentrazione cellulare possono dipendere dalla linea cellulare e possono essere regolate di conseguenza.
5. Utilizzando una pipetta multicanale, erogare 100 μl di sospensione cellulare (2.000 cellule per 100 μl) in ciascun pozzetto di una piastra di attacco inferiore rotonda a fondo basso a 96 pozzetti mediante pipettaggio inverso.
   NOTA: Utilizzare piastre di fissaggio basse a fondo tondo; Queste piastre stimoleranno la formazione di una singola sfera di glioma in ogni pozzetto. Il pipettaggio inverso evita la formazione di bolle, che interferiscono con l'acquisizione delle immagini del sistema di analisi delle cellule vive.
6. Centrifugare le piastre a 150 x g per 5 min.
   NOTA: La centrifugazione è un passaggio fondamentale per avviare la formazione della neurosfera 3D.
7. Incubare durante la notte per consentire la formazione di una singola sfera in ogni pozzetto.

2. Aggiunta di farmaci per il saggio di sinergia (Figura 1)

1. Assicurarsi che ogni pozzetto della piastra a 96 pozzetti riceva una concentrazione specifica di entrambi i farmaci 1 e 2. Crea una griglia in cui ogni concentrazione di farmaco 1 viene combinata con ogni concentrazione di farmaco 2 in duplicato.
2. Effettuare una diluizione seriale dei due farmaci per i quali verrà determinata la sinergia (5 diluizioni del farmaco 1 e 7 diluizioni del farmaco 2) utilizzando i terreni delle cellule staminali del glioma (Figura 1A).
   NOTA: In questo studio viene utilizzata una serie di diluizioni seriali al 50%; Tuttavia, è possibile utilizzare qualsiasi serie di diluizione.
   1. La serie di diluizione dovrebbe essere 7 volte più concentrata della concentrazione finale desiderata in ciascun pozzetto. Ad esempio, se la concentrazione finale più alta per il farmaco 1 è 1 μM, effettuare la prima concentrazione della serie di diluizione per il farmaco 1, 7 μM (1 mL, provetta B o I nella Figura 1A).
   2. Aggiungere 500 μl di terreno di coltura con cellule staminali di glioma a ciascuna provetta aggiuntiva della serie di diluizione (provette C-H e J-M, come mostrato nella Figura 1).
   3. Per creare la serie di diluizione, aspirare 500 μl della miscela di farmaci dalla provetta B o dalla provetta I e aggiungerla alla provetta successiva nella serie di diluizioni rispettivamente nella provetta C o nella provetta J (contenente 500 μl di terreno di coltura con cellule staminali di glioma). Mescolare bene e ripetere l'operazione con la provetta successiva della serie di diluizione. Effettuare un controllo DMSO (Tubo A) e assicurarsi che la concentrazione di DMSO sia la stessa in tutte le condizioni.
      NOTA: È possibile apportare modifiche alle concentrazioni dei farmaci e alle serie di diluizione. Assicurati di elencare le concentrazioni corrette del farmaco nel file supplementare 1 se la serie di diluizioni viene modificata.
3. A ciascun pozzetto delle piastre da 96 pozzetti, aggiungere 20 μL di farmaco 1 e 20 μL di farmaco 2 mediante pipettaggio inverso, come mostrato nella Figura 1B, per un volume finale di 140 μL per pozzetto; Le combinazioni di farmaci sono valutate in duplice copia. Se si utilizza l'analisi a valle fornita per IC50 e LD50, utilizzare il layout del farmaco come mostrato nella Figura 1B.
   1. In questo test, viene misurato anche l'effetto di ciascun farmaco da solo (senza che l'altro farmaco sia presente). Assicurarsi di aggiungere 20 μl di terreno di controllo DMSO (provetta A nella Figura 1B) a quei singoli pozzetti di farmaco per portare il volume finale di ciascun pozzetto a 140 μl.
   2. Assicurarsi che i pozzetti non contengano bolle, poiché ciò influirà sull'imaging.
      NOTA: È possibile apportare modifiche al volume finale; Tuttavia, assicurarsi di regolare le concentrazioni di cui al punto 2.2.
4. Posiziona le piastre nell'imager live e monitora la crescita di ciascuna sfera in ogni pozzetto utilizzando il modulo sferoide, l'impostazione della sfera singola, l'imaging sia in campo chiaro che RFP con ingrandimento 4x.
5. Monitorare le piastre per 72 ore, visualizzando ogni pozzetto della piastra a un intervallo di tempo regolare, in genere 2 ore.
   NOTA: Carica una mappa delle piastre corretta; ciò garantirà un'adeguata analisi a valle (Figura 1C).

3. Calcolo di IC50, LD50 e punteggio di sinergia (Figura 2 e Figura 3)

1. Analizza l'intensità della RFP per ogni pozzetto e ogni punto temporale utilizzando il software live imager. I parametri di analisi utilizzati sono elencati nei file supplementari (File supplementare 2).
   NOTA: A seconda delle preferenze, è possibile utilizzare diversi parametri di analisi.
2. Esportare i dati RFP come intensità RFP integrata totale rossa per ciascun pozzo, assicurandosi di esportare i dati grezzi non raggruppati (Figura 2A).
   NOTA: Se si utilizza il modello fornito (File supplementare 1) per calcolare IC50 e LD50, è essenziale attenersi al punto 3.2
3. Determinare la media e la deviazione standard per ciascuna combinazione di farmaci di (1) la variazione della piega rispetto al solo DMSO (per questo calcolo, i valori di 0 h non sono necessari) e (2) il Log2 della variazione della riduzione rispetto a 0 h incollando i dati grezzi nel foglio excel fornito (Figura 2B e vedere l'esempio nel File supplementare 1).
4. Regolare la concentrazione massima dei farmaci 1 e 2 nel foglio di calcolo (Figura 2B).
   NOTA: Assicurarsi di regolare le concentrazioni dei farmaci 1 e 2; in caso contrario, verranno calcolati valori LD50 e IC50 errati.
5. Calcola i valori IC50 utilizzando un'applicazione software di analisi dei dati appropriata (qui viene utilizzato GraphPad). Per il calcolo del valore IC50, utilizzare la variazione media della piega e la variazione della piega della deviazione standard rispetto al DMSO determinato solo nel passaggio 3.4 e copiare le tabelle IC50 dei farmaci 1 e 2 nel software di analisi dei dati (Log(inibitore) vs. risposta normalizzata, pendenza variabile) (Figura 3A).
   1. Utilizzare solo i dati dei pozzi a cui è stato aggiunto un singolo composto per i calcoli IC50. Utilizzare i valori di concentrazione del farmaco Log nel software di analisi dei dati, che vengono calcolati automaticamente nel foglio di calcolo fornito.
6. Calcola il punteggio di sinergia:
   1. Utilizza la variazione media della piega rispetto al DMSO solo di ogni combinazione per calcolare il punteggio di sinergia utilizzando un pacchetto software o un sito web. Ad esempio, https://synergyfinder.fimm.fi/ ¹² (parametri: adattamento della curva LL4, metodo ZIP per il calcolo del punteggio di sinergia). Il File supplementare 1 calcola automaticamente i valori necessari per creare la tabella di input delle sinergie che può essere caricata su SynergyFinder (Figura 3B). Un esempio della tabella di input delle sinergie è fornito nel File supplementare 3.
      NOTA: Un punteggio superiore a 10 denota sinergia, uno inferiore a -10 denota antagonismo e un valore compreso tra -10 e 10 mostra effetti additivi.
7. Calcola il punteggio LD50:
   1. Per ogni concentrazione di farmaco 1, calcolare la LD50 del farmaco 2. Il file supplementare calcola automaticamente il valore Log2 e la deviazione standard per ogni concentrazione (Figura 3C).
   2. Inserire la media e la deviazione standard della variazione della piega Log2 rispetto a 0 h, nonché il numero di repliche nel software di analisi dei dati (in questo studio, 2,) e calcolare il valore LD50 e la deviazione standard LD50 determinando la concentrazione a -1 (Log2 = -1 rappresenta il valore log2 per il quale il 50% del segnale viene perso rispetto a 0 h). In questi calcoli, utilizzare il modello di parametri Log(inibitore) rispetto alla risposta, pendenza variabile 4.
      NOTA: Il software di analisi dei dati non calcola automaticamente la concentrazione del farmaco corrispondente a un valore log2 = -1; tuttavia, questo valore può essere aggiunto ai calcoli riportati dal software di analisi dei dati come equazione definita dall'utente (Figura 3C). Assicurati di utilizzare i valori di concentrazione del log nel software di analisi dei dati, che vengono calcolati automaticamente nel foglio di calcolo fornito. Il file supplementare 4 mostra i pannelli IC50 e LD50 nel software GraphPad.

Risultati

Ad esempio, è stata valutata la sinergia di Trametinib (inibitore di MEK) e GDC-0941 (inibitore di PI3K), che inibiscono due vie effettrici a valle di RAS nella linea di cellule staminali di glioma di topo 5746 (espressione di RFP) (Figura 4). La Figura 4A mostra la stessa sfera a 0 h e 72 h trattata con una combinazione di Trametinib e GDC-0941. Queste immagini sono state esportate direttamente dal software live imager. IC50 e...

Discussione

Questo protocollo descrive i saggi 3D di screening farmacologico che sono stati efficacemente utilizzati per valutare le vulnerabilità ai farmaci in modelli sferoidi di glioma⁸. Questo sistema di analisi 3D degli sferoidi è stato specificamente progettato per consentire un'indagine preclinica più accurata delle chemioterapie combinatorie per le linee cellulari di glioma coltivate in sfere. Per l'HGG, questo metodo fornisce un quadro di riferimento per identific...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL centrifugation tubes	CELLTREAT	229411	15 mL polypropylene centrifuge tubes, sterile
96- well plate	S-bio	MS9096UZ	96-well round-bottom ultra-low attachment plate
Accutase	STEMCELL Technologies	7922	Cell detachment solution
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain	Logos Biosystems	F23001	Live/dead stain for cell counting
bFGF	STEMCELL Technologies	78003.2	Human recombinant bFGF
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Centrifuging cells and plates
DMSO	Pierce	20688	solvent for compounds
EGF	STEMCELL Technologies	78006.2	Human recombinant EGF
Eppendorf tubes	Costar	07-200-534	Microcentrifuge tubes
Excel	Microsoft		Microsoft excel
GDC-0941	Selleckchem	S1065	Drug 1
GraphPad	GraphPad	GraphPad Prism 9	Calculation of IC50 and LD50
Hemocytometer	Logos Biosystems	LGBD10008	Luna PhotonSlide
Incucyte	Sartorius	S3	Fluorescence microscope embedded in the tissue culture incubator that images every well at specific time intervals.
Incucyte software	Sartorius	Incucyte 2022B	Analysis of proliferation data
Media	STEMCELL Technologies	5702	NeuroCult (Mouse and Rat) proliferation kit containging Basal Medium and growth supplement
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Antibiotics to add to media
Trametinib	Selleckchem	S2673	Drug 2