فون فراي الإلكترونية المرتبطة بمقياس تجهم الفأر لتقييم الألم والألم في الفئران المصابة بالمثقبيات إيفانسي

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لتقييم nociception في الفئران المصابة بالمثقبية إيفانسي ، باستخدام جهاز فون فراي الإلكتروني كأداة ، وقياس العتبات الميكانيكية للمخلب الخلفي والأحشاء.

Abstract

لا يزال التسبب في الأمراض المعدية مجالا معقدا للدراسة. يمكن ملاحظة مسار العديد من العلامات السريرية ، مثل الألم الخيفي والألم ، في الأليفة. ومع ذلك ، فإن معرفة مساراتهم والعلاج الصحيح يحتاجون إلى تجارب خاضعة للرقابة ، وكثير منهم يستخدمون المختبر. يعد قياس التغيرات في العتبات الميكانيكية للمخلب الخلفي والأحشاء تقنية مفيدة لمراقبة التغيرات في إدراك الألم في القوارض. يمكن قياس استجابة الانسحاب أولا في اختبارات خط الأساس ، مما يخلق تحكما أفضل في المجموعات التجريبية. يمكن إجراء الاختبارات اللاحقة بعد إحداث العدوى وإضافة الأدوية إلى البروتوكول. يسمح استخدام جهاز فون فراي الإلكتروني المرتبط باستخدام مقياس الوجه لمراقبة التغيرات الشبيهة بالألم بإجراء تقييم بسيط ودقيق ومتسق لتقييم الألم الخيفي والألم في الفئران. وبالتالي ، فإن التجارب التي تستخدم المنهجية الحالية لعدوى المثقبية إيفانسي تمثل طريقة مفيدة لتقييم الألم الخيفي والألم في المصابة بالمختبر ، والتي يمكن تطبيقها على العلاج التقليدي لحيوانات الماشية.

Introduction

المثقبية إيفانسي هي العامل المسبب للمرض المسمى "سورا" أو "mal-das-cadeiras" في أمريكا الجنوبية ^1,2. يصيب عادة الخيول والماشية ، ولكن أيضا البرية ، التي تنتقل عن طريق الخفافيش الدموية ، والتابانيدات ، ولدغات الذباب ^1,3. السرة مرض رئيسي في الأليفة ، والذي يمكن أن يكون قاتلا في غياب العلاج الصحيح ، ويظهر علامات سريرية غير محددة مثل فقر الدم وفقدان الشهية والوزن وضعف العضلات والإجهاض ، والتي قد تختلف وفقا للمضيف والمنطقة الجغرافية^2،4،5،6.

لا يزال التعبير عن الألم الخيفي والألم في المصابة أثناء المرض موضوعا جديدا ^2,7. تعد الرغبة في فهم التسبب وراء هذه العلامات خطوة مهمة لتحسين وصقل العلاج المستخدم حاليا عن طريق إضافة أدوية مسكنة فعالة إلى بروتوكول المثقبيات الكلاسيكي ^5,6. في هذا السيناريو ، تمثل إمكانية تكرار المرض باستخدام نموذج الفئران ميزة ، حيث يمكن الاحتفاظ بالفئران بسهولة في بيئات خاضعة للرقابة في المختبر ، وبالتالي ، تسفر عن نتائج أكثر اتساقا من التجارب الميدانية باستخدام الماشية.

عادة ما يتم الحصول على عتبة ميكانيكية باستخدام جهاز فون فراي الإلكتروني (EvF) لتقييم الألم الخيفي في عدد كبير من التجارب^2،8،9. يستخدم هذا الجهاز لتقييم حساسية الأنسجة للتحفيز الميكانيكي: بمجرد أن يلمس الجهاز مخلب ، من خلال طرف 20-200 ميكرولتر متصل بالجهاز ، يتم تسجيل القوة التي يسحب بها المخلب.

عادة ما تستخدم القوارض كحيوانات قياسية في هذه التجارب ، ويتم استقراء معظم النتائج لأنواع أخرى ، حيث أن معظم الأمراض التي تم بحثها تأتي من أنواع أخرى يصعب فيها إجراء دراسة خاضعة للرقابة. علاوة على ذلك ، ترتبط آلام الظهر والألم ارتباطا وثيقا. يلعب استخدام مقياس وجه محدد لتقييم الألم في الفئران المصابة دورا مهما كمساعد مؤكد لتأكيد وجود الألم أثناء عدوى T. evansi ^2,10.

في هذا البروتوكول ، نعرض نموذجا جديدا لتقييم الألم الخيفي والألم في الفئران المصابة تجريبيا ب T. evansi ، مما يدل على وجود علاقة عالية بين المتغيرات ، وبالتالي إثبات أنه نموذج قوي. علاوة على ذلك ، يتطلب الأمر عددا صغيرا من الباحثين لتنفيذ الإجراء بأكمله ، مما يقلل من فرصة التدخل البشري أثناء التجربة. كما أنه يمكن الباحث من تكرار المرض المستهدف خلال دورة حادة وإضافة العديد من الأدوية العلاجية المختلفة في التصميم التجريبي ، وبالتالي الحصول على نتائج متسقة في فترة قصيرة.

Protocol

أجريت جميع التجارب باستخدام إناث الفئران السويسرية البالغة من العمر 10 أسابيع (35-55 جم). تم إيواء في أقفاص بولي سلفون (3-5 لكل قفص) في غرفة ذات درجة حرارة مضبوطة (21 ± 1 درجة مئوية) ، ودورة مظلمة لمدة 12 ساعة / 12 ساعة مظلمة ، ومختبر قياسي وماء مخصص. تم تعيين عشرة لكل مجموعة في كل اختبار لإثبات الآثار المتسقة للعلاجات الدوائية. تم تقديم التصميم التجريبي والموافقة عليه من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة ولاية سانتا كاتارينا (CEUA) (رقم البروتوكول: 6019201123). امتثلت جميع التجارب على لإرشادات REACH (البحوث الحيوانية: الإبلاغ عن التجارب في الجسم الحي ) وتم إجراؤها وفقا لدليل المجلس القومي للبحوث لرعاية واستخدام المختبر.

1. تحضير المثقبيات إيفانسي وتلقيحها

تنبيه: ارتد معطف مختبر يمكن التخلص منه وقفازات وقناع وحماية للعين عند التعامل مع عينات الدم المصابة والكواشف والمركبات الكيميائية الأخرى.

1. قم بتشغيل معدات الحمام المائي واضبطها عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية.
2. خذ أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على عينة الدم المحفوظة من الفريزر الفائق (-80 درجة مئوية). ضعه في حمام مائي حتى يذوب الدم.
   ملاحظة: يجب استخدام نفس العزلة لإصابة جميع الفئران في كل مجموعة من التجارب المختلفة للحفاظ على عدد متساو من ممرات الدم.
3. استخدم محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، 0.1 M) يحتوي على 60٪ D- (+) - جلوكوز (درجة الحموضة 7.4) لإجراء التخفيف التسلسلي (10: 1 v v) حتى يتم تحقيق 1 × 10⁴ تريبانوزومات لكل 0.1 مل. حدد عدد الخلايا الطفيلية عن طريق عد الخلايا يدويا باستخدام غرفة نيوباور على مجهر بعدسة موضوعية 100x².
4. تلقيح 0.1 مل من محلول الدم المخفف (المجموعة المصابة) ، أو نفس الحجم في مركبة ملحية 0.9٪ (مجموعة التحكم) ، داخل الصفاق ، باستخدام إبرة 26 جم 1/2 بوصة مقترنة بحقنة الأنسولين.

2. إعداد وتشغيل جهاز فون فراي الإلكتروني

ملاحظة: كن حذرا حول كيفية تسجيل البيانات التي تم الحصول عليها. تحتوي بعض معدات EvF على برامج محددة لنقل البيانات التي تم الحصول عليها من الجهاز إلى أجهزة إلكترونية أخرى ، مثل أجهزة الكمبيوتر أو الأجهزة اللوحية أو الهواتف الذكية.

1. قم بتشغيل جهاز EvF. تأكد من أن الجهاز مشحون جيدا قبل بدء التجربة ، ومراقبة مستوى البطارية المعروض على شاشة الجهاز وشحنه إذا لزم الأمر.
2. قم بتوصيل جهاز EvF بالجهاز الإلكتروني المختار عبر Wi-Fi لنقل وحفظ البيانات التي تم الحصول عليها.
3. أدخل طرف بولي بروبيلين سعة 10 ميكرولتر في مخروط جهاز EvF واضبط القراءة على صفر (0.00 جم) بالضغط على الزر الذي يحمل رمز مخلب.
4. لاحظ أنه بمجرد فحص الأنسجة التي تم تقييمها ؛ يظهر الحد الأقصى للضغط المطبق على شاشة جهاز EvF. بعد ذلك ، قم بنقله إلى الجهاز الإلكتروني المختار عن طريق الضغط على الزر برمز هوائي للتسجيل الآمن.
5. أعد تعيين القراءة إلى الصفر واستعد لإجراء قياس جديد بمجرد الضغط على الزر برمز المخلب مرة أخرى.

3. اعتبارات عامة لتقييم العتبة الميكانيكية

1. قم بإجراء جميع التجارب في غرفة هادئة مع درجة حرارة مضبوطة عند 21 درجة مئوية ودورة ضوء 12 ساعة / 12 ساعة مظلمة ، وتأكد من احترام دورة الساعة البيولوجية للفأر من خلال إجراء جميع التقييمات في نفس الوقت من اليوم².
2. اطلب من نفس الشخص إجراء تقييمات العتبة الميكانيكية الأساسية والتجريبية لتقليل التحيز وضمان اتساق القياس ؛ تأكد من أن التجارب عمياء.
3. ضع كل ماوس برفق داخل حجرة فردية مصنوعة من بولي ميثيل ميثاكريلات (PMMA) مع قمة مثقبة موضوعة على حامل أرضي شبكي 5 مم² ^2,8.
4. اسمح للفئران بالتأقلم لمدة 30 دقيقة في غرف PMMA قبل تقييم كل من العتبات الميكانيكية الأساسية^{والتجريبية 2}.
5. ضع حامل الأرضية الشبكي على ارتفاع مريح (على سطح ثابت) بحيث يمكن الوصول إلى من جميع الجوانب. تأكد من سهولة الوصول إلى البطن وجميع الكفوف الأربعة للفئران من خلال فتحات الأرضية الشبكية.
6. قم بتغطية السطح الثابت المستخدم لتخصيص الغرف بمواد ماصة لامتصاص أو جمع التبول والتغوط. تأكد من أن أذرع المحقق يمكن أن تتحرك بحرية أسفل الغرف أثناء تشغيل جهاز EvF.

4. تقييم العتبة الميكانيكية الأساسية واستجابة الماوس للمنبهات

1. لقياسات البطن ، قسم البطن إلى ثلاثة أجزاء افتراضية (مناطق الجمجمة والمتوسطة والذيلية). اختر منطقة الجمجمة (التي تحتوي على الكبد تشريحيا) كنسيج مستهدف قياسي لتقييم العتبة الميكانيكية للألم الخيفي الحشوي. لقياسات مخلب ، اختر مخلب الخلف المناسب للتوحيد.
2. خذ قياسا أساسيا من كل فأر قبل 48 ساعة من الإصابة. للقيام بذلك ، ضع الفئران في الغرف المحتوية ، وقم بإعداد جهاز EvF ، واستخدم كلتا يديك لرفع المسبار ببطء لتحفيز الأنسجة المستهدفة.
3. قم بزيادة الضغط تدريجيا على الأنسجة حتى يعبر الماوس عن سلوك مسبب للألم. لتقييم المخلب الخلفي الأيمن ، ابحث عن تراجع المخلب أو لعق المخلب أو القفز بأربعة مخالب^2،8،9. للتقييم الحشوي ، ابحث عن تراجع حاد في البطن ، أو لعق أو خدش فوري للموقع الذي تم فحصه ، أو القفز بأربعة مخالب ^2,11.
4. حفظ القيمة التي تم الحصول عليها عن طريق نقل البيانات إلى الجهاز الإلكتروني المختار الذي يحتوي على برنامج EvF المحدد أو كتابتها في دفتر الدرجات. أعد ضبط الشاشة على الصفر وكرر العملية أربع مرات للحصول على خمسة قياسات⁸.
   ملاحظة: ضع في اعتبارك ثلاثة قياسات متشابهة فقط لتقدير القيمة المتوسطة²
5. قم بقياس العتبة الميكانيكية للفأر الموجود في الغرفة المجاورة حتى يتم فحص كل فأر خمس مرات ويتم الحصول على قيمة متوسطة لكل.
6. كرر قياسات خط الأساس بعد 24 ساعة واستبعد الفئران ذات القيم المتوسطة أقل من 3.00 جم أو مع وجود اختلافات بين القياسات القاعدية أعلى من 2.00 جم ^2,8.
   ملاحظة: يجب اختيار نسيج مستهدف واحد فقط لكل فأر في كل تجربة حتى لا تعتاد على الفحص ، حيث سيكون عدد التقييمات أعلى بكثير في فترة قصيرة.

5. مخلب خلفي أيمن تجريبي وتقييم العتبة الميكانيكية للألم الحشوي

1. قم بتقييم المخلب الخلفي الأيمن أو العتبة الميكانيكية الحشوية بعد 1 ساعة من الإصابة لتقييم اليوم 0.
2. كرر الإجراء كل 24 ساعة على مدار 5 أيام بعد الإصابة.
   ملاحظة: إذا كان هناك علاج يجب إعطاؤه ، فاختر نقطة زمنية مناسبة ضمن التصميم التجريبي.
3. أعد الفئران إلى أقفاصها الأصلية لمنع من قتال بعضها البعض ، مع إمكانية الوصول إلى المختبر القياسي والماء بعد الانتهاء من القياسات.
4. قم بإجراء اختبار الحالة الطبيعية للتحقق من التوزيع الطبيعي للبيانات والمزيد من التحليل الإحصائي المناسب للبيانات التي تم جمعها.

6. تقييم مقياس كشر الماوس

1. تأكد من رؤية كل فأر بسهولة أثناء وجوده داخل الغرفة المحتوية وفحص كل فأر قبل التجربة للتأكد من عدم وجود آفات على الأطراف أو البطن أو الوجه وعدم تغيير المعطف.
2. مراقبة المنطقة المدارية للفأر. صنف العيون المفتوحة على أنها غياب الألم (الدرجة 0) بينما يمكن تمثيل الألم الواضح عندما يغلق الفأر عينيه (النتيجة 2).
3. مراقبة أنف الفأر. صنف الأنف الطبيعي على أنه غياب الألم بينما يمثل وجود انتفاخ على جسر الأنف ألما واضحا.
4. مراقبة الخدين الماوس. صنف الخدين الطبيعيين على أنه غياب الألم بينما يمثل وجود انتفاخ على كلا الخدين ألما واضحا.
5. مراقبة موقف آذان الماوس. صنف الآذان المستديرة على أنها غياب الألم بينما تمثل الأذنان التي تدور للخارج أو للخلف ، بعيدا عن الوجه ، في شكل مدبب ، ألما واضحا. تزداد المسافة بين الأذنين مع درجة الألم.
6. مراقبة شعيرات الماوس. صنف الشعيرات مع منحنى هبوطي طبيعي على أنها غياب الألم بينما الشعيرات التي يتم سحبها للخلف على الخد أو سحبها للأمام تمثل ألما واضحا.
7. نظرا لأن السلوكيات الفطرية ، مثل الاستمالة الذاتية ، قد تتداخل مع تعبيرات الوجه ، فلا تعتبر هذه سلوكيات مرتبطة بالألم⁸. انتظر حتى يتوقف الماوس عن هذا السلوك قبل كل تقييم لوحدة الإجراءات.
8. قم بإجراء اختبار الحالة الطبيعية للتحقق من التوزيع الطبيعي للبيانات والمزيد من التحليل الإحصائي المناسب للبيانات التي تم جمعها.
   ملاحظة: في نهاية جميع التجارب ، تم القتل الرحيم للفئران بشكل إنساني باستخدام الكيتامين (90 مجم / كجم) والزيلازين (7.5 مجم / كجم) ، وتم حقنهم داخل الصفاق. بعد التوصل إلى خطة تخدير عميق مؤكدة ، تم تقديمهم لخلع عنق الرحم.

النتائج

انخفاض في العتبة الميكانيكية بسبب عدوى T. evansi كما تم تقييمها بواسطة جهاز فون فراي الإلكتروني على كل من المخلب الخلفي الأيمن والأنسجة الحشوية
أجريت التجربة على مدار 5 أيام ، وفقا للبيانات السابقة المتعلقة^بعينة T. evansi 2 المتاحة. بدأت الفئران المصابة في إظهار ?...

Discussion

خطوة حاسمة في التجارب التي تشمل المصابة هي السيطرة على مستويات الطفيليات. قد تتصرف سلالات مختلفة من T. evansi بطرق متباينة في الفئران ، مما يؤدي من الالتهابات الحادة إلى المزمنة^2،4،5،6. علاوة على ذلك ، قد تؤدي التغييرات ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G 1/2" needle coupled to insulin syringe	TKL	80288090100	Used to infund solutions on laboratory animals
Accessories for von Frey analgesimeter	INSIGHT	EFF 303	Containment box with support for digital analgesimeter assessment
D-(+)-Glucose	SIGMA-ALDRICH	G7021	A monosaccharide which is the main source of energy in the form of ATP for living organisms
Digital analgesimeter	INSIGHT	von Frey Wi-Fi	The von Frey Wi-Fi is a portable device used to assess tissue sensitivity to mechanical stimuli
Gilson type 10 µL polypropylene tip	CRALPLAST	18261	Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for hind paw allodynia assessment
Laboratory water bath	BEING INSTRUMENT	BW-22P	Used to heat liquid and semi-solid substances contained in appropriate recipients to specific temperature
Phosphate buffered saline	SIGMA-ALDRICH	806552	A balanced salt solution buffer used for a variety of cell culture applications
Swiss mice (Mus musculus) from both gender	UFSC	Swiss Webster	Laboratory animals used for controlled experiments
Trypanosoma evansi cryiopreserved sample	UDESC	-	Sample used to infect all mice, ceded by the Hemoparasites and Vectors Biochemistry Laboratory
Universal type 10 µL polypropylene tip	CRALPLAST	18171	Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for visceral allodynia assessment