פון פריי האלקטרוני קשור לסולם גרימס עכבר להערכת אלודיניה וכאב בעכברים נגועים בטריפנוסומה אוונסי

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת nociception בעכברים נגועים Trypanosoma evansi, באמצעות מכשיר פון פריי האלקטרוני ככלי, מדידת סף מכני של הכף האחורית ואת הקרביים.

Abstract

פתוגנזה של מחלות זיהומיות היא עדיין תחום מורכב למחקר. מהלך של מספר סימנים קליניים, כגון אלודיניה וכאב, ניתן לראות בחיות בית. עם זאת, הידע על המסלולים שלהם והטיפול הנכון דורשים ניסויים מבוקרים, רבים מהם באמצעות חיות מעבדה. מדידת שינויים בספים המכניים של הכף האחורית והקרביים היא טכניקה שימושית לצפייה בשינויים בתפיסת הכאב אצל מכרסמים. תגובת נסיגה יכולה להימדד תחילה בבדיקות בסיסיות, מה שיוצר שליטה טובה יותר בקבוצות הניסוי. ניתן לבצע בדיקות עוקבות לאחר גרימת זיהום והוספת תרופות לפרוטוקול. השימוש במכשיר פון פריי אלקטרוני הקשור לשימוש בסולם פנים כדי לצפות בשינויים דמויי כאב מאפשר הערכה פשוטה, מדויקת ועקבית להערכת אלודיניה וכאב בעכברים. לפיכך, ניסויים המשתמשים במתודולוגיה הנוכחית עבור זיהום Trypanosoma evansi מייצגים שיטה שימושית להערכת allodynia וכאב בבעלי חיים נגועים במעבדה, אשר ניתן ליישם על הטיפול הקונבנציונאלי עבור בעלי חיים.

Introduction

Trypanosoma evansi הוא סוכן אטיולוגי של המחלה המכונה "surra" או "mal-das-cadeiras" בדרום אמריקה ^1,2. זה בדרך כלל משפיע על סוסים ובקר, אבל גם בעלי חיים פראיים, להיות מועבר על ידי עטלפים hematophagous, tabanids, ו stomoxes עקיצות זבוב ^1,3. סורה היא מחלה מרכזית בחיות בית, אשר יכולה להיות קטלנית בהיעדר הטיפול הנכון, הצגת סימנים קליניים לא ספציפיים כגון אנמיה, אובדן תיאבון ומשקל, חולשת שרירים והפלה, אשר עשויים להשתנות בהתאם המארח ואת האזור הגיאוגרפי 2,4,5,6.

הביטוי של אלודיניה וכאב בבעלי חיים נגועים במהלך המחלה הוא עדיין נושא חדש ^2,7. הדחף להבין את הפתוגנזה שמאחורי סימנים אלה הוא צעד חשוב לשיפור ולשכלול הטיפול המשמש כיום על ידי הוספת תרופות משככות כאבים יעילות לפרוטוקול הטריפנוצידלי הקלאסי ^5,6. בתרחיש זה, האפשרות לשכפל את המחלה באמצעות מודל מורין מהווה יתרון, שכן עכברים יכולים להישמר בקלות תחת סביבה מבוקרת במעבדה ולכן להניב תוצאות עקביות יותר מאשר ניסויי שדה באמצעות בעלי חיים.

סף מכני מתקבל בדרך כלל באמצעות מכשיר פון פריי אלקטרוני (EvF) להערכת אלודיניה במספר עצום של ניסויים ^2,8,9. מכשיר זה משמש להערכת רגישות הרקמה לגירוי מכני: ברגע שהמנגנון נוגע בכפה של החיה, דרך קצה של 20-200 מיקרוליטר המחובר למכשיר, נרשם הכוח שבו החיה מושכת את הכפה.

מכרסמים משמשים בדרך כלל כבעלי חיים סטנדרטיים בניסויים אלה, ורוב התוצאות מוסקות למינים אחרים, מכיוון שרוב המחלות הנחקרות מגיעות ממינים אחרים שבהם יהיה קשה לערוך מחקר מבוקר. יתר על כן, אלודיניה וכאב קשורים זה לזה באופן הדוק. השימוש בסולם פנים ספציפי להערכת כאב בעכברים נגועים ממלא תפקיד חשוב כאדג'ובנט מאשר כדי לאשר את נוכחות הכאב במהלך זיהום T. evansi ^2,10.

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים מודל חדשני להערכת אלודיניה וכאב בעכברים שנדבקו בניסוי ב- T. evansi, המראה מתאם גבוה בין משתנים, ובכך הוכח כמודל חזק. יתר על כן, זה דורש מספר קטן של חוקרים לבצע את כל ההליך, להקטין את הסיכוי להתערבות אנושית במהלך הניסוי. היא גם מאפשרת לחוקר לשכפל את מחלת המטרה במהלך מהלך אקוטי ולהוסיף מספר תרופות טיפוליות שונות בתכנון הניסוי, ובכך לקבל תוצאות עקביות בתקופה קצרה.

Protocol

כל הניסויים בוצעו באמצעות נקבות עכברים שוויצריות בוגרות בנות 10 שבועות (35-55 גרם). בעלי החיים שוכנו בכלובי פוליסולפון (3-5 בעלי חיים בכל כלוב) בחדר עם טמפרטורה מבוקרת (21 ± 1 מעלות צלזיוס), מחזור אור של 12 שעות / 12 שעות חושך, וצ'או מעבדה סטנדרטי ומים אד ליביטום. עשרה בעלי חיים הוקצו לכל קבוצה בכל ניסוי כדי להדגים את ההשפעות העקביות של טיפולים תרופתיים. תכנון הניסוי הוגש ואושר על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת סנטה קטרינה סטייט (CEUA) (מספר פרוטוקול: 6019201123). כל הניסויים בבעלי חיים עמדו בהנחיות ARRIVE (מחקר בבעלי חיים: דיווח על ניסויים in vivo ) ובוצעו בהתאם למדריך המועצה הלאומית למחקר לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. הכנת טריפנוזומה אוונסי וחיסון

אזהרה: יש ללבוש מעיל מעבדה חד-פעמי, כפפות, מסכה והגנה על העיניים בעת טיפול בדגימות דם נגועות, ריאגנטים ותרכובות כימיות אחרות.

1. הפעל את ציוד אמבט המים והתאם אותו בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס.
2. קח צינור מיקרוצנטריפוגה המכיל את דגימת הדם המשומרת מתוך אולטרה מקפיא (-80 ° C). מניחים אותו באמבט המים עד שהדם מפשיר.
   הערה: יש להשתמש באותו מבודד כדי להדביק את כל העכברים בכל קבוצה של ניסויים שונים כדי לשמור על מספר שווה של מעברי דם.
3. השתמש במי מלח חוצצי פוספט (PBS, 0.1 M) המכיל 60% D-(+)-גלוקוז (pH 7.4) כדי לבצע דילול סדרתי (10:1 v v) עד 1 × 10⁴ טריפנוזומים לכל 0.1 מ"ל מושגים. לקבוע את מספר תאי הטפיל על ידי ספירת תאים ידנית באמצעות תא נויבאואר על מיקרוסקופ עם עדשה אובייקטיבית 100x².
4. יש לחסן 0.1 מ"ל של תמיסת הדם המדוללת (קבוצה נגועה), או את אותו נפח ברכב 0.9% מלוחים (קבוצת ביקורת), תוך צפקית, באמצעות מחט 26 גרם 1/2 אינץ' המוצמדת למזרק אינסולין.

2. הקמה ותפעול של מנגנון פון פריי אלקטרוני

הערה: היזהר לגבי האופן שבו הנתונים המתקבלים נרשמים. לחלק מציוד EvF יש תוכניות ספציפיות להעברת הנתונים המתקבלים מהמנגנון למכשירים אלקטרוניים אחרים, כגון מחשבים, טאבלטים או סמארטפונים.

1. הפעל את מנגנון EvF. ודא שהציוד טעון היטב לפני תחילת הניסוי, התבונן ברמת הסוללה המוצגת על מסך הציוד וטען אותה במידת הצורך.
2. חבר את מנגנון EvF למכשיר האלקטרוני שנבחר באמצעות Wi-Fi כדי להעביר ולשמור את הנתונים המתקבלים.
3. הכנס קצה פוליפרופילן של 10 μL לתוך חרוט מכשיר EvF והגדר את הקריאה לאפס (0.00 גרם) על ידי לחיצה על הלחצן עם סמל כפה.
4. שימו לב כי לאחר בדיקת הרקמה המוערכת; הלחץ המרבי המופעל מוצג בתצוגת מנגנון EvF. לאחר מכן, העבר אותו למכשיר האלקטרוני שנבחר על ידי לחיצה על הלחצן עם סמל אנטנה להקלטה בטוחה.
5. אפס את הקריאה לאפס והתכונן לבצע מדידה חדשה פשוט על ידי לחיצה נוספת על הכפתור עם סמל הכפה.

3. שיקולים כלליים להערכות סף מכניות

1. בצע את כל הניסויים בחדר שקט עם טמפרטורה מבוקרת של 21 ° C ומחזור אור / 12 שעות חושך, והקפד לכבד את המחזור הביולוגי של העכבר על ידי ביצוע כל ההערכות באותו זמן של היום².
2. בקש מאותו אדם לבצע הן הערכות סף מכניות בסיסיות והן הערכות סף מכניות ניסיוניות כדי להפחית את ההטיה ולהבטיח עקביות מדידה; ודא שהניסויים מסונוורים.
3. הניחו כל עכבר בעדינות בתוך תא נפרד עשוי פולימתיל מתקרילט (PMMA) עם חלק עליון מחורר הממוקם על מעמד רשת^{בגודל 5} מ"מ מ"ר ^2,8.
4. אפשרו לעכברים להתאקלם במשך 30 דקות בתאי PMMA לפני הערכת ערכי הסף המכניים הבסיסיים והניסיוניים².
5. מקמו את מעמד רצפת הרשת בגובה נוח (על משטח יציב) כך שבעלי החיים יהיו נגישים מכל הצדדים. ודאו שהבטן וכל ארבע כפות הרגליים של העכברים נגישים בקלות דרך פתחי רצפת הרשת.
6. כסו את המשטח היציב המשמש להקצאת התאים בחומר סופג לספיגה או איסוף של מיקטוריציה ועשיית צרכים. ודא כי זרועותיו של החוקר יכולות לנוע בחופשיות מתחת לתאים בעת הפעלת מנגנון EvF.

4. הערכת סף מכנית בסיסית ותגובת עכבר לגירויים

1. למדידות בטן, חלקו את הבטן לשלושה חלקים וירטואליים (אזורי גולגולת, בינוניים וקאודליים). בחר את אזור הגולגולת (המכיל אנטומית את הכבד) כרקמת המטרה הסטנדרטית להערכת סף מכני של אלודיניה ויסצרלית. עבור מדידות כפות, בחר את הכף האחורית הימנית עבור סטנדרטיזציה.
2. בצע מדידה בסיסית מכל עכבר 48 שעות לפני ההדבקה. כדי לעשות זאת, הניחו את העכברים בתאים המכילים, הכינו את מנגנון ה-EvF והשתמשו בשתי הידיים כדי להרים את הגשושית לאט כדי לגרות את רקמת המטרה.
3. בהדרגה להגדיל את הלחץ על הרקמה עד העכבר מבטא התנהגות nociceptive . להערכת כף אחורית ימנית, חפשו נסיגת כפות, ליקוק כפות או קפיצת ארבע כפות ^2,8,9. להערכת הקרביים, חפשו נסיגה חדה של הבטן, ליקוק או גירוד מיידי של אתר הבדיקה, או קפיצה של ארבע כפות ^2,11.
4. שמור את הערך המתקבל על ידי העברת הנתונים למכשיר האלקטרוני שנבחר המכיל את תוכנית EvF הספציפית או כתיבתו בספר כיתה. אפס את התצוגה לאפס וחזור על התהליך ארבע פעמים כדי לקבל חמש מדידות⁸.
   הערה: שקול רק שלוש מדידות דומות כדי להעריך את הערך הממוצע²
5. מדדו את הסף המכני של העכבר הקיים בתא הסמוך עד שכל עכבר נבדק חמש פעמים ומתקבל ערך ממוצע עבור כל חיה.
6. חזור על מדידות קו הבסיס 24 שעות מאוחר יותר ולא כולל עכברים עם ערכים ממוצעים מתחת ל- 3.00 גרם או עם הבדלים בין מדידות בסיסיות גבוהות מ- 2.00 גרם ^2,8.
   הערה: בכל ניסוי יש לבחור רקמת מטרה אחת בלבד עבור כל עכבר כדי שהחיות לא יתרגלו להיבדק, מכיוון שמספר ההערכות יהיה גבוה משמעותית בתקופה קצרה.

5. הערכת סף מכנית ניסיונית של כף ימין אחורית ואלודיניה קרבית

1. הערך את הכף האחורית הימנית או את הסף המכני של אלודיניה ויסצרלית 1 שעות לאחר ההדבקה להערכה ביום 0.
2. חזור על ההליך כל 24 שעות במשך 5 ימים לאחר ההדבקה.
   הערה: אם יש טיפול שיש לתת, בחר נקודת זמן מתאימה בתוך תכנון הניסוי.
3. החזירו את העכברים לכלובים המקוריים שלהם כדי למנוע מבעלי החיים להילחם זה בזה, עם גישה לצ'או מעבדה סטנדרטי ומים לאחר השלמת המדידות.
4. לבצע בדיקת תקינות כדי לבדוק את ההתפלגות הנורמלית של הנתונים וניתוח סטטיסטי מתאים נוסף של הנתונים שנאספו.

6. הערכת סולם עווית עכבר

1. ודא שכל עכבר נראה בקלות כשהוא בתוך התא המכיל ובדוק כל עכבר לפני הניסוי כדי לוודא שאין נגעים בגפיים, בבטן או בפנים ואין שינויים בפרווה.
2. התבונן באזור המסלול של העכבר. סווג עיניים פקוחות כהיעדר כאב (ציון 0) בעוד שכאב ברור עשוי להיות מיוצג כאשר העכבר עוצם את עיניו (ציון 2).
3. התבוננו באפו של העכבר. לסווג אף נורמלי כמו היעדר כאב בעוד נוכחות של בליטה על גשר האף מייצג כאב ברור.
4. התבוננו בלחיי העכבר. לסווג לחיים נורמליות כמו היעדר כאב בעוד נוכחות של בליטה על שתי הלחיים מייצג כאב ברור.
5. שימו לב למיקום אוזני העכבר. לסווג אוזניים מעוגלות כהיעדר כאב בעוד אוזניים מסתובבות החוצה או אחורה, הרחק מהפנים, בצורה מחודדת, מייצגות כאב ברור. הרווח בין האוזניים גדל עם ציון הכאב.
6. התבוננו בשפם של העכבר. סווגו שפמים עם העקומה הטבעית שלהם כלפי מטה כהיעדר כאב, בעוד שפם שנמשך לאחור כנגד הלחי או נמשך קדימה מייצג כאב ברור.
7. מכיוון שהתנהגויות מולדות, כגון טיפוח עצמי, עלולות להפריע להבעת הפנים, אל תתייחס אליהן כאל התנהגויות הקשורות לכאב⁸. המתן עד שהעכבר יפסיק אופן פעולה זה לפני כל הערכה של יחידת פעולה.
8. לבצע בדיקת תקינות כדי לבדוק את ההתפלגות הנורמלית של הנתונים וניתוח סטטיסטי מתאים נוסף של הנתונים שנאספו.
   הערה: בסוף כל הניסויים, עכברים עברו המתת חסד אנושית באמצעות קטמין (90 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (7.5 מ"ג/ק"ג), שהוזרקו תוך צפקית. לאחר שהגיעו לתוכנית מאושרת להרדמה עמוקה, הם הוגשו לפריקת צוואר הרחם.

תוצאות

ירידה בסף המכני עקב זיהום T. evansi כפי שהוערך על ידי מכשיר פון פריי אלקטרוני הן בכפה האחורית הימנית והן ברקמות הקרביות
הניסוי נערך במשך 5 ימים, על פי נתונים קודמים הקשורים למדגם T. evansi ^{הזמין 2}. עכברים נגועים החלו להראות הבדל משמעותי בסף המכני בכפה האחורית הימני?...

Discussion

שלב קריטי בניסויים בבעלי חיים נגועים הוא שליטה ברמות הטפילות. זנים שונים של T. evansi עשויים להתנהג בדרכים שונות בעכברים, מה שמוביל מזיהומים חריפים לכרוניים 2,4,5,6. יתר על כן, שינויים במינון הזיהום עשויים להפחית או להארי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G 1/2" needle coupled to insulin syringe	TKL	80288090100	Used to infund solutions on laboratory animals
Accessories for von Frey analgesimeter	INSIGHT	EFF 303	Containment box with support for digital analgesimeter assessment
D-(+)-Glucose	SIGMA-ALDRICH	G7021	A monosaccharide which is the main source of energy in the form of ATP for living organisms
Digital analgesimeter	INSIGHT	von Frey Wi-Fi	The von Frey Wi-Fi is a portable device used to assess tissue sensitivity to mechanical stimuli
Gilson type 10 µL polypropylene tip	CRALPLAST	18261	Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for hind paw allodynia assessment
Laboratory water bath	BEING INSTRUMENT	BW-22P	Used to heat liquid and semi-solid substances contained in appropriate recipients to specific temperature
Phosphate buffered saline	SIGMA-ALDRICH	806552	A balanced salt solution buffer used for a variety of cell culture applications
Swiss mice (Mus musculus) from both gender	UFSC	Swiss Webster	Laboratory animals used for controlled experiments
Trypanosoma evansi cryiopreserved sample	UDESC	-	Sample used to infect all mice, ceded by the Hemoparasites and Vectors Biochemistry Laboratory
Universal type 10 µL polypropylene tip	CRALPLAST	18171	Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for visceral allodynia assessment