Электронный тест фон Фрея, связанный со шкалой гримасы мыши, для оценки аллодинии и боли у мышей, инфицированных Trypanosoma evansi

Резюме

В данной работе мы представляем протокол оценки ноцицепции у мышей, инфицированных Trypanosoma evansi, с использованием электронного аппарата фон Фрея в качестве инструмента, измеряющего механические пороги задней лапы и внутренних органов.

Аннотация

Патогенез инфекционных заболеваний до сих пор остается сложной областью для изучения. У домашних животных может наблюдаться течение нескольких клинических признаков, таких как аллодиния и боль. Тем не менее, знание их путей и правильное лечение требуют контролируемых экспериментов, многие из которых проводятся с использованием лабораторных животных. Измерение изменений механических порогов задней лапы и внутренних органов является полезным методом для наблюдения за изменениями в восприятии боли у грызунов. Реакция отмены может быть измерена сначала в базовых тестах, что обеспечивает лучший контроль экспериментальных групп. Последующие тесты могут быть проведены после индуцирования инфекции и добавления препаратов в протокол. Использование электронного аппарата фон Фрея в сочетании с использованием лицевой шкалы для наблюдения за изменениями, подобными боли, позволяет проводить простую, точную и последовательную оценку аллодинии и боли у мышей. Таким образом, эксперименты с использованием настоящей методики для лечения инфекции Trypanosoma evansi представляют собой полезный метод оценки аллодинии и боли у лабораторно инфицированных животных, который может быть применен к традиционному лечению домашних животных.

Введение

Trypanosoma evansi является этиологическим агентом заболевания, называемого в Южной Америке "surra" или "mal-das-cadeiras" ^1,2. Обычно поражает лошадей и крупный рогатый скот, а также дикую фауну, передаваясь через летучих мышей-гематофагов, табанид и укусы мух ^1,3. Сурра является основным заболеванием домашних животных, которое может привести к летальному исходу при отсутствии правильного лечения, проявляя неспецифические клинические признаки, такие как анемия, потеря аппетита и веса, мышечная слабость и аборты, которые могут варьироваться в зависимости от хозяина и географического региона 2,4,5,6.

Выраженность аллодинии и боли у инфицированных животных в течение болезни все еще является новой темой ^2,7. Стремление понять патогенез, стоящий за этими признаками, является важным шагом для улучшения и уточнения используемого в настоящее время лечения путем добавления эффективных обезболивающих препаратов к классическому трипаноцидному протоколу ^5,6. В этом сценарии возможность репликации болезни с использованием мышиной модели представляет собой преимущество, поскольку мышей можно легко содержать в контролируемых условиях в лаборатории, и, следовательно, результаты более стабильны, чем в полевых экспериментах с использованием домашнего скота.

Механический порог обычно получают с помощью электронного аппарата фон Фрея (EvF) для оценки аллодинии в огромном числе экспериментов ^2,8,9. Этот прибор используется для оценки чувствительности тканей к механической стимуляции: как только аппарат касается лапы животного, через прикрепленный к прибору наконечник объемом 20-200 мкл, фиксируется сила, с которой животное отводит лапу.

Грызуны обычно используются в качестве стандартных животных в этих экспериментах, и большинство результатов экстраполируются на другие виды, поскольку большинство исследованных болезней происходят от других видов, на которых было бы трудно провести контролируемое исследование. Кроме того, аллодиния и боль тесно связаны. Использование специальной шкалы лица для оценки боли у инфицированных мышей играет важную роль в качестве подтверждающего адъюванта для подтверждения наличия боли в течение инфекции T. evansi ^2,10.

В этом протоколе мы демонстрируем новую модель для оценки аллодинии и боли у мышей, экспериментально инфицированных T. evansi, демонстрируя высокую корреляцию между переменными, тем самым оказываясь сильной моделью. Кроме того, для проведения всей процедуры требуется небольшое количество исследователей, что снижает вероятность вмешательства человека во время эксперимента. Это также позволяет исследователю воспроизвести целевое заболевание во время острого течения и добавить несколько различных лечебных препаратов в экспериментальный дизайн, тем самым получая стабильные результаты за короткий период.

протокол

Все эксперименты проводились с использованием 10-недельных взрослых самок швейцарских мышей (35-55 г). Животных размещали в полисульфоновых клетках (3-5 животных в клетке) в помещении с контролируемой температурой (21 ± 1 °C), 12 ч светлым / 12 ч темным циклом, а также стандартным лабораторным кормом и водой ad libitum. Десять животных были распределены в каждую группу в каждом тесте, чтобы продемонстрировать последовательные эффекты медикаментозного лечения. Проект эксперимента был представлен и одобрен Этическим комитетом Государственного университета Санта-Катарины (CEUA) (номер протокола: 6019201123). Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами ARRIVE.

1. Препарат и посев Trypanosoma evansi

ВНИМАНИЕ: Надевайте одноразовый лабораторный халат, перчатки, маску и средства защиты глаз при работе с инфицированными образцами крови, реагентами и другими химическими соединениями.

1. Включите оборудование для водяной бани и отрегулируйте его при постоянной температуре 37 °C.
2. Достаньте микроцентрифужную пробирку с образцом консервированной крови из ультраморозильной камеры (-80 °C). Поместите его на водяную баню до тех пор, пока кровь не оттает.
   Примечание: Один и тот же изолят следует использовать для заражения всех мышей в каждой группе различных экспериментов, чтобы поддерживать равное количество кровеносных проходов.
3. Используйте фосфатно-солевой буфер (PBS, 0,1 М), содержащий 60% D-(+)-глюкозы (pH 7,4), для последовательного разведения (10:1 vv) до достижения 1 × 10⁴ трипаносом на 0,1 мл. Определение количества клеток паразита путем ручного подсчета клеток с помощью камеры Нейбауэра на микроскопе со 100-кратным объективом².
4. Введите 0,1 мл разбавленного раствора крови (инфицированная группа) или тот же объем в 0,9% физиологический раствор (контрольная группа) внутрибрюшинно, используя иглу 26 G 1/2", соединенную с инсулиновым шприцем.

2. Настройка и эксплуатация электронного аппарата фон Фрея

ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте внимательны к тому, как записываются полученные данные. Некоторые EvF-оборудование имеют специальные программы для передачи полученных данных с аппарата на другие электронные устройства, такие как компьютеры, планшеты или смартфоны.

1. Включите прибор EvF. Перед началом эксперимента убедитесь, что оборудование хорошо заряжено, наблюдая за уровнем заряда батареи, отображаемым на экране оборудования, и зарядите его при необходимости.
2. Подключите аппарат EvF к выбранному электронному устройству через Wi-Fi для передачи и сохранения полученных данных.
3. Вставьте полипропиленовый наконечник объемом 10 мкл в конус аппарата EvF и установите индикацию на ноль (0,00 г), нажав кнопку с символом лапы.
4. Обратите внимание на то, что после того, как оцененная ткань будет прощупана; Максимальное приложенное давление отображается на дисплее прибора EvF. После этого перенесите его на выбранное электронное устройство, нажав кнопку с символом антенны для безопасной записи.
5. Сбросьте показания до нуля и приготовьтесь провести новое измерение, просто снова нажав кнопку с символом лапы.

3. Общие соображения по оценке механических пороговых значений

1. Проводите все эксперименты в тихой комнате с контролируемой температурой 21 °C и 12-часовым световым / 12-часовым темным циклом, и обязательно соблюдайте циркадный цикл мыши, выполняя все оценки в одно и то же время дня².
2. Попросите одного и того же человека выполнить как базовую, так и экспериментальную оценку механических пороговых значений для уменьшения систематической ошибки и обеспечения согласованности измерений; Убедитесь, что эксперименты не ослеплены.
3. Аккуратно поместите каждую мышь в отдельную камеру из полиметилметакрилата (ПММА) с перфорированной верхушкой, размещенную на сетчатой подставке ^2,8 мм².
4. Дайте мышам акклиматизироваться в течение 30 минут в камерах из ПММА перед оценкой как исходных, так и экспериментальных механических пороговых значений².
5. Установите сетчатый пол на удобной высоте (на устойчивой поверхности), чтобы животные были доступны со всех сторон. Убедитесь, что брюшко и все четыре лапы мышей легко доступны через сетчатые отверстия в полу.
6. Накройте устойчивую поверхность, используемую для выделения камер, абсорбирующим материалом для поглощения или сбора мочеиспускания и дефекации. Убедитесь, что руки исследователя могут свободно перемещаться под камерами во время работы с аппаратом EvF.

4. Базовая оценка механического порога и реакции мыши на стимулы

1. Для измерения живота разделите брюшную полость на три виртуальные части (черепную, среднюю и каудальную области). Выберите область черепа (анатомически содержащую печень) в качестве стандартной целевой ткани для оценки механического порога висцеральной аллодинии. Для измерения лапы выберите правую заднюю лапу для стандартизации.
2. Проведите исходное измерение у каждой мыши за 48 часов до заражения. Для этого поместите мышей в содержащиеся камеры, подготовьте аппарат EvF и обеими руками медленно поднимайте зонд, чтобы стимулировать целевую ткань.
3. Постепенно увеличивайте давление на ткани до тех пор, пока мышь не проявит ноцицептивное поведение. Для оценки правой задней лапы обратите внимание на втягивание лапы, облизывание лапы или прыжки с четырьмя лапами ^2,8,9. Для висцеральной оценки обратите внимание на резкое втягивание живота, немедленное облизывание или расчесывание зондируемого участка или прыжки с четырьмя лапами ^2,11.
4. Сохраните полученное значение, перенеся данные на выбранное электронное устройство, содержащее конкретную программу EvF, или запиши их в зачетную книжку. Сбросьте дисплей на ноль и повторите процесс четыре раза, чтобы получить пять измерений⁸.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрим только три похожих измерения для оценки среднего значения²
5. Измеряйте механический порог присутствия мыши в соседней камере до тех пор, пока каждую мышь не прощупают пять раз и не получат среднее значение для каждого животного.
6. Повторите исходные измерения через 24 ч и исключите мышей со средними значениями ниже 3,00 г или с разницей между базальными измерениями выше ^{2,00 г 2,8}.
   Примечание: Для каждой мыши в каждом эксперименте должна быть выбрана только одна целевая ткань, чтобы животные не привыкли к зондированию, так как количество оценок будет значительно выше за короткий период.

5. Экспериментальная оценка механического порога правой задней лапы и висцеральной аллодинии

1. Оцените механический порог правой задней лапы или висцеральной аллодинии через 1 ч после инфекции для оценки на 0-й день.
2. Повторяйте процедуру каждые 24 часа в течение 5 дней после заражения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: если необходимо провести лечение, выберите подходящий момент времени в рамках плана эксперимента.
3. Верните мышей в исходные клетки, чтобы животные не дрались друг с другом, с доступом к стандартному лабораторному корму и воде в неограниченном количестве после завершения измерений.
4. Проведите тест на нормальность для проверки нормального распределения данных и дальнейшего соответствующего статистического анализа собранных данных.

6. Оценка шкалы мышиной гримасы

1. Убедитесь, что каждая мышь хорошо видна, находясь в содержащей камере, и осмотрите каждую мышь перед экспериментом, чтобы убедиться в отсутствии повреждений на конечностях, животе или лице, а также в отсутствии изменений шерсти.
2. Наблюдайте за областью орбиты мыши. Классифицируйте открытые глаза как отсутствие боли (0 баллов), в то время как очевидная боль может быть представлена, когда мышь закрывает глаза (2 балла).
3. Понаблюдайте за носом мыши. Классифицируют нормальный нос как отсутствие боли, в то время как наличие выпуклости на переносице представляет собой очевидную боль.
4. Понаблюдайте за щеками мыши. Классифицируйте нормальные щеки как отсутствие боли, в то время как наличие выпуклости на обеих щеках представляет собой явную боль.
5. Понаблюдайте за положением ушей мыши. Классифицируют округлые уши как отсутствие боли, при этом уши поворачиваются наружу или назад, в сторону от лица, в заостренной форме, представляют явную боль. Пространство между ушами увеличивается с оценкой боли.
6. Понаблюдайте за усами мыши. Классифицируйте усы с их естественным изгибом вниз как отсутствие боли, в то время как усы, которые либо оттянуты назад к щеке, либо вытянуты вперед, представляют собой явную боль.
7. Поскольку врожденное поведение, такое как уход за собой, может мешать выражению лица, не рассматривайте их как поведение, связанное с болью^. Подождите, пока мышь остановит это поведение перед каждой оценкой единицы действия.
8. Проведите тест на нормальность для проверки нормального распределения данных и дальнейшего соответствующего статистического анализа собранных данных.
   Примечание: В конце всех экспериментов мышей гуманно усыпляли с использованием кетамина (90 мг/кг) и ксилазина (7,5 мг/кг), вводимых внутрибрюшинно. После достижения подтвержденного плана глубокой анестезии им был подвергнут вывих шейки матки.

Результаты

Снижение механического порога вследствие инфекции T. evansi по данным электронного аппарата фон Фрея как на правой задней лапе, так и на висцеральных тканях
Эксперимент проводился в течение 5 дней, согласно предыдущим данным, относящимся к имеющемуся образцу T. evansi

Обсуждение

Важнейшим этапом в экспериментах с участием инфицированных животных является контроль уровня паразитемии. Различные штаммы T. evansi могут вести себя у мышей по-разному, что приводит к переходу от острых к хроническим инфекциям 2,4,5,6.<...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G 1/2" needle coupled to insulin syringe	TKL	80288090100	Used to infund solutions on laboratory animals
Accessories for von Frey analgesimeter	INSIGHT	EFF 303	Containment box with support for digital analgesimeter assessment
D-(+)-Glucose	SIGMA-ALDRICH	G7021	A monosaccharide which is the main source of energy in the form of ATP for living organisms
Digital analgesimeter	INSIGHT	von Frey Wi-Fi	The von Frey Wi-Fi is a portable device used to assess tissue sensitivity to mechanical stimuli
Gilson type 10 µL polypropylene tip	CRALPLAST	18261	Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for hind paw allodynia assessment
Laboratory water bath	BEING INSTRUMENT	BW-22P	Used to heat liquid and semi-solid substances contained in appropriate recipients to specific temperature
Phosphate buffered saline	SIGMA-ALDRICH	806552	A balanced salt solution buffer used for a variety of cell culture applications
Swiss mice (Mus musculus) from both gender	UFSC	Swiss Webster	Laboratory animals used for controlled experiments
Trypanosoma evansi cryiopreserved sample	UDESC	-	Sample used to infect all mice, ceded by the Hemoparasites and Vectors Biochemistry Laboratory
Universal type 10 µL polypropylene tip	CRALPLAST	18171	Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for visceral allodynia assessment