Elektronik von Frey, Trypanosoma evansi ile Enfekte Farelerde Allodini ve Ağrıyı Değerlendirmek için Fare Yüz Buruşturma Ölçeği ile ilişkili

Özet

Burada, Trypanosoma evansi ile enfekte olmuş farelerde nosisepsiyonu değerlendirmek için, elektronik von Frey aparatını bir araç olarak kullanarak, arka pençe ve iç organların mekanik eşiklerini ölçen bir protokol sunuyoruz.

Özet

Enfeksiyöz hastalık patogenezi hala araştırılması gereken karmaşık bir alandır. Allodini ve ağrı gibi çeşitli klinik belirtilerin seyri evcil hayvanlarda gözlenebilir. Bununla birlikte, yollarının bilgisi ve doğru tedavi, birçoğu laboratuvar hayvanları kullanan kontrollü deneylere ihtiyaç duyar. Arka pençe ve iç organların mekanik eşiklerindeki değişikliklerin ölçülmesi, kemirgenlerde ağrı algısındaki değişiklikleri gözlemlemek için yararlı bir tekniktir. Geri çekilme tepkisi ilk olarak temel testlerde ölçülebilir, bu da deney gruplarının daha iyi kontrol edilmesini sağlar. Enfeksiyon indüklendikten ve protokole ilaç eklendikten sonra sonraki testler yapılabilir. Ağrı benzeri değişiklikleri gözlemlemek için bir yüz ölçeğinin kullanılmasıyla ilişkili bir elektronik von Frey cihazının kullanılması, farelerde allodini ve ağrıyı değerlendirmek için basit, kesin ve tutarlı bir değerlendirmeye izin verir. Bu nedenle, Trypanosoma evansi enfeksiyonu için mevcut metodolojiyi kullanan deneyler, laboratuvarda enfekte olmuş hayvanlarda allodini ve ağrıyı değerlendirmek için yararlı bir yöntemdir ve bu, çiftlik hayvanları için geleneksel tedaviye uygulanabilir.

Giriş

Trypanosoma evansi, Güney Amerika'da "surra" veya "mal-das-cadeiras" olarak adlandırılan hastalığın etiyolojik ajanıdır ^1,2. Genellikle atları ve sığırları etkiler, aynı zamanda hematofag yarasalar, tabanidler ve stomoklar sinek ısırıkları tarafından bulaşan vahşi faunayı da etkiler ^1,3. Surra, evcil hayvanlarda, doğru tedavi yapılmadığında ölümcül olabilen, anemi, iştah ve kilo kaybı, kas güçsüzlüğü ve kürtaj gibi spesifik olmayan klinik belirtiler gösteren, konakçıya ve coğrafi bölgeye göre değişebilen önemli bir hastalıktır 2,4,5,6.

Hastalığın seyri sırasında enfekte hayvanlarda allodini ve ağrının ifadesi hala yeni bir konudur ^2,7. Bu belirtilerin arkasındaki patogenezi anlama dürtüsü, klasik tripanosidal protokole^etkili analjezik ilaçlar ekleyerek şu anda kullanılan tedaviyi iyileştirmek ve rafine etmek için önemli bir adımdır ^5,6. Bu senaryoda, fareler laboratuvarda kontrollü ortamlarda kolayca tutulabildiğinden ve bu nedenle çiftlik hayvanlarının kullanıldığı saha deneylerinden daha tutarlı sonuçlar verdiğinden, hastalığın bir fare modeli kullanılarak tekrarlanması olasılığı bir avantajı temsil eder.

Çok sayıda deneyde allodinin değerlendirilmesi için elektronik bir von Frey (EvF) cihazı kullanılarak yaygın olarak mekanik bir eşik elde edilir ^2,8,9. Bu cihaz, mekanik stimülasyona karşı doku duyarlılığını değerlendirmek için kullanılır: aparat, cihaza bağlı 20-200 μL'lik bir uç aracılığıyla hayvanın pençesine dokunduğunda, hayvanın pençeyi geri çekme kuvveti kaydedilir.

Kemirgenler genellikle bu deneylerde standart hayvanlar olarak kullanılır ve çoğu sonuç, araştırılan hastalıkların çoğu, kontrollü bir çalışma yürütmenin zor olacağı diğer türlerden geldiğinden, diğer türlere tahmin edilir. Ayrıca, allodini ve ağrı yakından ilişkilidir. Enfekte farelerde ağrıyı değerlendirmek için spesifik bir yüz ölçeğinin kullanılması, T. evansi enfeksiyonu ^2,10 sırasında ağrının varlığını doğrulamak için doğrulayıcı bir adjuvan olarak önemli bir rol oynar.

Bu protokolde, deneysel olarak T. evansi ile enfekte olmuş farelerde allodini ve ağrıyı değerlendirmek için yeni bir model gösteriyoruz, değişkenler arasında yüksek bir korelasyon gösteriyoruz ve böylece güçlü bir model olduğunu kanıtlıyoruz. Ayrıca, tüm prosedürü gerçekleştirmek için az sayıda araştırmacı gerektirir ve bu da deney sırasında insan müdahalesi olasılığını azaltır. Ayrıca, araştırmacının akut bir seyir sırasında hedef hastalığı tekrarlamasını ve deneysel tasarıma birkaç farklı tedavi ilacı eklemesini ve böylece kısa sürede tutarlı sonuçlar elde etmesini sağlar.

Protokol

Tüm deneyler 10 haftalık yetişkin dişi İsviçre fareleri (35-55 g) kullanılarak gerçekleştirildi. Hayvanlar, kontrollü sıcaklık (21 ± 1 °C), 12 saat aydınlık / 12 saat karanlık döngü ve standart laboratuvar yemeği ve su ad libitum olan bir odada polisülfon kafeslerde (kafes başına 3-5 hayvan) barındırıldı. İlaç tedavilerinin tutarlı etkilerini göstermek için her testte her gruba on hayvan atandı. Deney tasarımı, Santa Catarina Eyalet Üniversitesi (CEUA) Etik Kurulu tarafından sunulmuş ve onaylanmıştır (protokol numarası: 6019201123). Tüm hayvan deneyleri ARRIVE yönergelerine (Hayvan Araştırmaları: İn vivo Deneylerin Raporlanması) uygundur ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Araştırma Konseyi Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Trypanosoma evansi hazırlanması ve aşılanması

DİKKAT: Enfekte kan örneklerini, reaktifleri ve diğer kimyasal bileşikleri tutarken tek kullanımlık laboratuvar önlüğü, eldiven, maske ve göz koruması kullanın.

1. Su banyosu ekipmanını açın ve 37 °C'lik sabit bir sıcaklıkta ayarlayın.
2. Korunmuş kan örneğini içeren bir mikrosantrifüj tüpünü ultra dondurucudan (-80 °C) çıkarın. Kan çözülene kadar su banyosuna koyun.
   NOT: Eşit sayıda kan geçişini sürdürmek için her farklı deney grubundaki tüm fareleri enfekte etmek için aynı izolat kullanılmalıdır.
3. 0.1 mL'de 1 × 10⁴ tripanozom elde edilene kadar seri seyreltme (10:1 v v) gerçekleştirmek için% 60 D- (+) - glikoz (pH 7.4) içeren fosfat tamponlu salin (PBS, 0.1 M) kullanın. 100x objektif lensli bir mikroskopta bir Neubauer odası kullanarak manuel hücre sayımı ile parazit hücrelerinin sayısını belirleyin².
4. 0.1 mL seyreltilmiş kan solüsyonunu (enfekte grup) veya% 0.9 tuzlu su aracında (kontrol grubu) aynı hacmi, bir insülin şırıngayına bağlı 26 G 1/2 "iğne kullanarak intraperitoneal olarak aşılayın.

2. Elektronik von Frey aparatı kurulumu ve çalıştırılması

NOT: Elde edilen verilerin nasıl kaydedildiğine dikkat edin. Bazı EVF ekipmanları, cihazdan elde edilen verileri bilgisayarlar, tabletler veya akıllı telefonlar gibi diğer elektronik cihazlara aktarmak için özel programlara sahiptir.

1. EvF cihazını açın. Deneye başlamadan önce ekipmanın iyi şarj edildiğinden emin olun, ekipman ekranında görüntülenen pil seviyesini gözlemleyin ve gerekirse şarj edin.
2. Elde edilen verileri aktarmak ve kaydetmek için EvF cihazını Wi-Fi aracılığıyla seçilen elektronik cihaza bağlayın.
3. EvF aparat konisine 10 μL'lik bir polipropilen uç yerleştirin ve pençe sembolü olan düğmeye basarak okumayı sıfıra (0.00 g) ayarlayın.
4. Değerlendirilen doku incelendikten sonra; uygulanan maksimum basınç EvF aparatı ekranında gösterilir. Bundan sonra, güvenli kayıt için anten sembolü olan düğmeye basarak seçilen elektronik cihaza aktarın.
5. Okumayı sıfıra sıfırlayın ve pençe sembolü olan düğmeye tekrar basarak yeni bir ölçüm yapmaya hazırlanın.

3. Mekanik eşik değerlendirmeleri için genel hususlar

1. Tüm deneyleri, 21 °C'de kontrollü sıcaklıkta ve 12 saat aydınlık/12 saat karanlık döngüde sessiz bir odada gerçekleştirin ve tüm değerlendirmeleri günün aynı saatinde yaparak fare sirkadiyen döngüsüne uyduğunuzdan emin olun².
2. Yanlılığı azaltmak ve ölçüm tutarlılığını sağlamak için aynı kişinin hem temel hem de deneysel mekanik eşik değerlendirmeleri yapmasını sağlayın; Deneylerin kör olduğundan emin olun.
3. Her fareyi, 5 mm² gözenekli bir zemin standı ^2,8 üzerine yerleştirilmiş delikli bir üst kısmı olan polimetil metakrilattan (PMMA) yapılmış ayrı bir hazneye nazikçe yerleştirin.
4. Hem temel hem de deneysel mekanik eşikleri değerlendirmeden önce farelerin PMMA odalarında 30 dakika boyunca alışmalarına izin^{verin 2}.
5. File zemin standını rahat bir yüksekliğe (sabit bir yüzey üzerine) yerleştirin, böylece hayvanlara her taraftan erişilebilir. Farelerin karnına ve dört pençesine de ağ zemin açıklıklarından kolayca erişilebildiğinden emin olun.
6. İşeme ve dışkılamayı emmek veya toplamak için odaları tahsis etmek için kullanılan sabit yüzeyi emici malzeme ile örtün. EVF cihazını çalıştırırken araştırmacının kollarının odaların altında serbestçe hareket edebildiğinden emin olun.

4. Temel mekanik eşik değerlendirmesi ve uyaranlara fare tepkisi

1. Karın ölçümleri için karnı üç sanal parçaya bölün (kraniyal, orta ve kaudal alanlar). Viseral allodini mekanik eşik değerlendirmesi için standart hedef doku olarak kraniyal alanı (anatomik olarak karaciğeri içeren) seçin. Pençe ölçümleri için, standardizasyon için doğru arka pençeyi seçin.
2. Enfeksiyondan 48 saat önce her fareden bir temel ölçüm yapın. Bunu yapmak için, fareleri içeren odalara yerleştirin, EVF aparatını hazırlayın ve hedeflenen dokuyu uyarmak için probu yavaşça kaldırmak için iki elinizi kullanın.
3. Fare nosiseptif bir davranış ifade edene kadar doku üzerindeki baskıyı kademeli olarak artırın. Sağ arka pençe değerlendirmesi için, pençe geri çekme, pençe yalama veya dört pençe zıplama 2,8,9'u arayın. İçgüdüsel değerlendirme için, karnın keskin bir şekilde geri çekilmesi, sondalanan bölgenin hemen yalanması veya çizilmesi veya dört pençe atlama ^2,11 olup olmadığına bakın.
4. Verileri belirli bir EVF programını içeren seçilen elektronik cihaza aktararak veya bir not defterine yazarak elde edilen değeri kaydedin. Ekranı sıfırlayın ve beş ölçüm elde etmek için işlemi dört kez tekrarlayın⁸.
   NOT: Ortalama değer^2'yi tahmin etmek için yalnızca üç benzer ölçümü göz önünde bulundurun
5. Her fare beş kez problanana ve her hayvan için ortalama bir değer elde edilene kadar bitişik odada bulunan farenin mekanik eşiğini ölçün.
6. Temel ölçümleri 24 saat sonra tekrarlayın ve ortalama değerleri 3.00 g'ın altında olan veya bazal ölçümler arasındaki farklar 2.00 g'dan yüksek olan^fareleri hariç tutun ^2,8.
   NOT: Her deneyde her fare için yalnızca bir hedef doku seçilmelidir, böylece hayvanlar sondalanmaya alışmazlar, çünkü değerlendirme sayısı kısa bir süre içinde önemli ölçüde daha yüksek olacaktır.

5. Deneysel sağ arka pençe ve visseral allodini mekanik eşik değerlendirmesi

1. 0. gün değerlendirmesi için enfeksiyondan 1 saat sonra sağ arka pençe veya viseral allodini mekanik eşiğini değerlendirin.
2. Enfeksiyondan sonraki 5 gün boyunca her 24 saatte bir prosedürü tekrarlayın.
   NOT: Uygulanacak bir tedavi varsa, deney tasarımı içinde uygun bir zaman noktası seçin.
3. Ölçümler tamamlandıktan sonra standart laboratuvar yemeğine ve su ad libitum'a erişim ile hayvanların birbirleriyle savaşmasını önlemek için fareleri orijinal kafeslerine geri koyun.
4. Verilerin normal dağılımını kontrol etmek ve toplanan verilerin daha uygun istatistiksel analizini yapmak için bir normallik testi yapın.

6. Fare yüz buruşturma ölçeği değerlendirmesi

1. Her farenin muhafaza odasının içindeyken kolayca görüldüğünden emin olun ve uzuvlarda, karında veya yüzünde lezyon olmadığından ve kürk değişikliği olmadığından emin olmak için deneyden önce her fareyi inceleyin.
2. Farenin yörünge alanını gözlemleyin. Açık gözleri ağrı yokluğu (skor 0) olarak sınıflandırırken, fare gözlerini kapattığında bariz bir ağrı temsil edilebilir (skor 2).
3. Farenin burnunu gözlemleyin. Normal bir burnu ağrının olmaması olarak sınıflandırın, burun köprüsünde bir çıkıntının varlığı ise belirgin ağrıyı temsil eder.
4. Farenin yanaklarını gözlemleyin. Normal yanakları ağrının olmaması olarak sınıflandırın, her iki yanakta ise şişkinlik olması belirgin ağrıyı temsil eder.
5. Farenin kulaklarının konumunu gözlemleyin. Yuvarlak kulakları ağrının olmaması olarak sınıflandırırken, kulaklar dışa veya arkaya, yüzden uzağa, sivri bir şekilde dönerken belirgin ağrıyı temsil eder. Ağrı skoru ile kulaklar arasındaki boşluk artar.
6. Farenin bıyıklarını gözlemleyin. Bıyıkları doğal aşağı doğru eğrileriyle ağrı olmaması olarak sınıflandırın, yanağa doğru geri çekilen veya öne doğru çekilen bıyıklar ise bariz ağrıyı temsil eder.
7. Kendini tımar etme gibi doğuştan gelen davranışlar yüz ifadesini etkileyebileceğinden, bunları ağrı ile ilgili davranışlar olarak düşünmeyin⁸. Her eylem birimi değerlendirmesinden önce farenin bu davranışı durdurmasını bekleyin.
8. Verilerin normal dağılımını kontrol etmek ve toplanan verilerin daha uygun istatistiksel analizini yapmak için bir normallik testi yapın.
   NOT: Tüm deneylerin sonunda, farelere ketamin (90 mg / kg) ve ksilazin (7.5 mg / kg) kullanılarak insancıl olarak ötenazi yapıldı ve intraperitoneal olarak enjekte edildi. Onaylanmış derin anestezi planına ulaştıktan sonra servikal çıkığa tabi tutuldular.

Sonuçlar

Elektronik von Frey cihazı ile hem sağ arka pençe hem de viseral dokularda değerlendirilen T. evansi enfeksiyonuna bağlı mekanik eşikte azalma
Deney, mevcut T. evansi numunesi² ile ilgili önceki verilere göre 5 gün boyunca gerçekleştirildi. Enfekte fareler, enfeksiyondan sonraki 3. günde sağ arka pençede mekanik eşikte önemli bir fark göstermeye başladı ve enfeksiyondan sonraki 2 gün boyunca enfekte olmayan farelere kıyasla kontrol grubun...

Tartışmalar

Enfekte hayvanları içeren deneylerde kritik bir adım, parazitemi seviyelerinin kontrolüdür. Farklı T. evansi suşları, farelerde farklı şekillerde davranabilir ve akut enfeksiyonlardan kronik enfeksiyonlara^{yol açabilir 2,4,5,6}. Ayrıca, enfeksiyon dozundaki değişiklikler farelerin hayatta kalma süresini azaltabilir veya uzatabilir. Bu nedenle, deneyin doğru periyodunu bel...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G 1/2" needle coupled to insulin syringe	TKL	80288090100	Used to infund solutions on laboratory animals
Accessories for von Frey analgesimeter	INSIGHT	EFF 303	Containment box with support for digital analgesimeter assessment
D-(+)-Glucose	SIGMA-ALDRICH	G7021	A monosaccharide which is the main source of energy in the form of ATP for living organisms
Digital analgesimeter	INSIGHT	von Frey Wi-Fi	The von Frey Wi-Fi is a portable device used to assess tissue sensitivity to mechanical stimuli
Gilson type 10 µL polypropylene tip	CRALPLAST	18261	Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for hind paw allodynia assessment
Laboratory water bath	BEING INSTRUMENT	BW-22P	Used to heat liquid and semi-solid substances contained in appropriate recipients to specific temperature
Phosphate buffered saline	SIGMA-ALDRICH	806552	A balanced salt solution buffer used for a variety of cell culture applications
Swiss mice (Mus musculus) from both gender	UFSC	Swiss Webster	Laboratory animals used for controlled experiments
Trypanosoma evansi cryiopreserved sample	UDESC	-	Sample used to infect all mice, ceded by the Hemoparasites and Vectors Biochemistry Laboratory
Universal type 10 µL polypropylene tip	CRALPLAST	18171	Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for visceral allodynia assessment