دراسة بدء موت الخلايا باستخدام المجهر الرقمي

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لدراسة معدل بدء موت الخلايا المبرمج عن طريق التصوير المستمر للأوراق الملقحة بعد تحريض موت الخلية.

Abstract

المقاومة الممنوحة للاستجابة شديدة الحساسية (HR) هي استجابة دفاعية فعالة يمكن تحديدها بواسطة جينات المقاومة N . يتجلى HR على أنه تشكيل مناطق موت الخلايا على الأوراق الملقحة. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لدراسة معدل بدء موت الخلية عن طريق تصوير الأوراق الملقحة في الوقت بين بدء موت الخلية وظهور موت الخلية باستخدام المجهر الرقمي. يتيح المجهر الرقمي عملية تصوير مستمرة في الفترات المرغوبة ، مما يسمح بتحديد دقيق لمعدل بدء موت الخلايا حتى دقائق بالضبط ، بدلا من الساعات في الطرق التقليدية. التصوير باستخدام المجهر الرقمي مستقل أيضا عن الضوء وبالتالي يمكن استخدامه أثناء النهار والليل دون الإخلال بإيقاع الساعة البيولوجية للنبات. يمكن دراسة الأنظمة المرضية المختلفة التي تؤدي إلى تطور موت الخلايا المبرمج باستخدام هذا البروتوكول مع تعديلات طفيفة. بشكل عام ، يسمح البروتوكول بتحديد بسيط ودقيق وغير مكلف لمعدل بدء موت الخلايا.

Introduction

البطاطا هي واحدة من المحاصيل الغذائية الأكثر زراعة على نطاق واسع في العالم، وتحتل المرتبة الرابعة بعد الأرز والقمح والذرة. ومع ذلك، يمكن أن يتأثر إنتاج البطاطا بشدة بفيروس البطاطا Y (PVY)، الذي يعتبر حاليا أهم مسببات الأمراض الفيروسية ^1,2. في نباتات البطاطس السيرة الذاتية. Rywal ، عدة سلالات من PVY (بما في ذلك سلالة PVY N-Wilga) تؤدي إلى استجابة شديدة الحساسية (HR) - مقاومة ، حيث يظهر تقييد العامل الممرض لموقع العدوى على شكل آفات نخرية على الأوراق الملقحة³. في هذا النظام المرضي ، يتم التوسط في HR بواسطة جين مقاومة Ny-1 ، والذي يعتمد على درجة الحرارة ، حيث أن النباتات التي تنمو في درجات حرارة منخفضة تتطور بكفاءة إلى آفات نخرية ، بينما في النباتات التي تنمو بشكل أساسي عند درجة حرارة مرتفعة (28 درجة مئوية) ، يظهر إجهاض المقاومة على أنه نقص في تكوين الآفة وانتشار الفيروس الجهازي ^3,4. عندما يتم نقل النباتات إلى درجة حرارة منخفضة (22 درجة مئوية) ، يبدأ موت الخلايا ، والذي يمكن استغلاله لمتابعة معدل بدء موت الخلية عن طريق تصوير الأوراق الملقحة في الوقت بين بدء موت الخلية وظهور موت الخلية.

يوضح هذا البروتوكول طريقة بسيطة لتحديد معدل بدء موت الخلايا باستخدام المجهر الرقمي. من خلال تصوير الأوراق الملقحة بعد نقل النبات من 28 درجة مئوية إلى 22 درجة مئوية ، يتيح المجهر الرقمي المراقبة المستمرة للورقة في الفترات المرغوبة. على عكس استخدام الطرق الأخرى (على سبيل المثال ، الفحص المجهري متحد البؤر أو مراقبة تكوين الآفة بالعين المجردة) ، فإن هذا يسمح بتحديد الوقت الدقيق لتشكيل الآفة وبالتالي معدل بدء موت الخلية حتى دقائق بالضبط ، بدلا من ساعات في الطرق المذكورة أعلاه ^5,6. استخدام المجهر الرقمي مستقل أيضا عن الضوء وبالتالي يمكن استخدامه أثناء النهار والليل. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لتحديد المكونات المشاركة في بدء موت الخلايا أو لتحديد تأثيرات المكونات المختلفة على معدل بدء موت الخلايا إذا كانت النباتات المستخدمة محورة وراثيا ولديها مستويات متغيرة من المكونات ذات الأهمية.

Protocol

ملاحظة: يصف القسمان 1 و2 بروتوكولا معدلا لإعداد المواد النباتية استنادا إلى الأساليب التي حددها Lukan et ^al.7. على وجه التحديد ، تم إجراء بعض التعديلات على الظروف البيئية الخاضعة للرقابة وإعداد اللقاح.

1. زراعة نباتات البطاطس

1. تنمو السيرة الذاتية البطاطا صحية. نباتات ريوال في زراعة أنسجة العقدة الجذعية⁸.
2. بعد 6-8 أسابيع ، قم بقطع عشرة نباتات بطول 1 سم تحتوي على عقد من نباتات البطاطس على ورق معقم في ظروف معقمة باستخدام ملاقط معقمة وسكين مشرط.
3. قم بنقلها إلى صناديق بلاستيكية بوسط Murashige و Skoog (MS30) (الشكل 1 أ) وقم بزراعتها في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة (22 درجة مئوية في الضوء و 19 درجة مئوية في الظلام مع إشعاع 250 μE أو μmol / m² / s وفترة ضوئية 16 ساعة ، عند رطوبة نسبية تبلغ 55٪ ± 5٪).
4. نقلها إلى التربة 2 أسابيع بعد التكاثر الدقيق.
   1. املأ الأواني (r = 10 سم) بالتربة. استخدم إصبعا لإنشاء ثقب بعمق 3-4 سم في التربة في منتصف الإناء ، واملأ الحفرة بالماء ، وانتظر حتى تمتص.
   2. ضع نباتا واحدا لكل وعاء في الحفرة ، واترك الأوراق فوق السطح. قم بتغطية الجذور برفق بالتربة (الشكل 1 ب).
      ملاحظة: قد لا تتطور جذور بعض النباتات. استبعاد تلك النباتات من التحليل.
5. قم بزراعة النباتات في التربة في غرفة نمو في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة (22 درجة مئوية في الضوء و 19 درجة مئوية في الظلام ، عند رطوبة نسبية تبلغ 55٪ ± 5٪ ، مع إشعاع 250 ميكرومول / م² / ثانية وفترة ضوئية 16 ساعة).
6. بعد 3-4 أسابيع ، النباتات جاهزة. استخدم هذه النباتات ليتم تلقيحها.
   ملاحظة: يجب أن تحتوي النباتات على 3-4 أوراق مكتملة النمو على الأقل مع منشورات مرئية (الشكل 1 ج). يجب أن تبدو صحية ، مع عدم وجود أعراض واضحة (أوراق صفراء أو بنية) ، والتي يمكن أن تكون مخطئة للآفات التي تسببها PVY. لتحقيق نتائج قابلة للمقارنة ، يجب تلقيح النباتات في نفس الوقت (على سبيل المثال ، في الساعة 9 صباحا) في جميع التجارب لتجنب الآثار المحتملة لإيقاع الساعة البيولوجية على الاستجابة المناعية للنبات وتكوين الآفات⁹،^10،11.

2. إعداد اللقاح وتلقيح البطاطس

1. تلقيح النبات بسلالة PVY N-Wilga (PVY^N-Wi ؛ رقم الانضمام. EF558545) اللقاح كما هو مذكور أدناه.
   ملاحظة: يمكن تلقيح المزيد من النباتات بالتوازي في حالة توفر أكثر من مجهر رقمي واحد. يجب أن تحتوي النباتات على ثلاث أوراق مكتملة النمو على الأقل قبل التلقيح (الشكل 1 ج). يتم ضرب PVY^N-Wi والحفاظ عليها في السيرة الذاتية للبطاطس. بنتلاند.
   1. تحضير العازلة للفوسفات ، مع استكمال ثنائي إيثيل ديثيوكربامات الصوديوم (DIECA) ، للتلقيح: مزيج 1.3 مل من 0.2 M NaH 2 PO 4 ، 8.7 مل من 0.2 M Na₂HPO₄ ، و 0.225 جم من DIECA. اجعل الحجم إلى 100 مل باستخدام ddH₂0. اضبط الأس الهيدروجيني على 7.6 بإضافة 1 M NaOH أو 1 M HCl محلول.
   2. حصاد 6-8 أسابيع من العمر PVY^N-Wi السيرة الذاتية للبطاطس المصابة. نباتات بنتلاند من زراعة الأنسجة في أكياس استخراج مع شبكة مرشح (0.5 جم لكل 6 نباتات) وإضافة محلول فوسفات مكمل ب DIECA (كتلة 4x من المواد النباتية ، الكتلة: نسبة الحجم). استخدم الخالط اليدوي لمدة 1-2 دقيقة للحصول على محلول متجانس.
   3. قم بغبار الأوراق الثلاثة الأولى المطورة بالكامل من نباتات البطاطس التي يبلغ عمرها 3-4 أسابيع (من الخطوة 1.6) بمسحوق الكربوروندوم.
      ملاحظة: اضبط كمية مسحوق الكاربوروندوم. الكثير قد يسبب الضرر ، في حين أن القليل جدا قد يؤدي إلى عدوى غير فعالة. على النحو الأمثل ، يتم استخدام 0.1 مجم / سم من مسحوق الكربوروندوم ، وهو ما يقرب من 1.5 مجم من المسحوق لكل ورقة متوسطة الحجم (حوالي 15 سم²).
   4. فرك الأوراق بلطف مع اللقاح (~ 100 ميكرولتر لكل ورقة). بعد 10 دقائق ، اغسل الأوراق جيدا بماء الصنبور.
      1. احرص على عدم الإضرار بالأوراق. لا تتجاوز وقت الحضانة. اضبط كمية اللقاح وفقا لحجم الورقة - 6.5 ميكرولتر / سم ، أي ما يقرب من 100 ميكرولتر لكل ورقة متوسطة الحجم (حوالي 15 سم²).
   5. نقل النباتات إلى غرفة النمو وزراعتها في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة (28 درجة مئوية في الضوء و 28 درجة مئوية في الظلام عند رطوبة نسبية تبلغ 55٪ ± 5٪ ، مع إشعاع 250 ميكرومول / م² / ثانية وفترة ضوئية 16 ساعة) لمدة 3 أيام.

3. تحضير النبات واستخدام المجهر الرقمي لتسجيل تطور الآفة

1. نقل النباتات الملقحة من غرفة النمو التي يتم الحفاظ عليها عند 28 درجة مئوية إلى غرفة النمو عند 22 درجة مئوية بعد 3 أيام من التلقيح ، مع شروط أخرى كما هو موضح في الخطوة 1.5.
2. حدد مصنعا للمراقبة. شل حركة الورقة الملقحة الثانية باستخدام شريط (الشكل 1 د). تأكد من تثبيت الورقة المرغوبة تماما قبل البدء في التصوير (الشكل 1 د).
3. قم بتثبيت تطبيق برمجي لالتقاط الصور على الكمبيوتر المحمول. قم بتوصيل المجهر الرقمي بالكمبيوتر. افتح البرنامج.
   ملاحظة: تأكد من وضع المصنع والمجهر الرقمي والكمبيوتر المحمول على الرف بالقرب من المقبس لتوصيل الكمبيوتر. قد يعتمد القرار بشأن اختيار الأوراق المراد رصدها على المسألة البيولوجية المدروسة ، على سبيل المثال ، نوع العملية التي تؤدي إلى تكوين موت محدود للخلايا المبرمجة.
4. اضبط المجهر فوق الورقة الثابتة. ركز باستخدام القرص على المجهر الرقمي (كما هو موضح في الشكل 1E).
   1. تأكد من أن خط الرؤية واسع قدر الإمكان لزيادة فرص التقاط تكوين الآفة ولكن لا يزال مكبرا بدرجة كافية لتحديد مظهر الآفة (عادة ، يتم استخدام تكبير 25x).
5. اضبط إعدادات الكاميرا. انقر فوق الزر "إعدادات" في الزاوية اليمنى العليا من الصورة (الشكل 2 أ ، الجزء المحاط بدائرة 1) واضبط إعدادات الكاميرا: السطوع (60-70) ، التباين (10-15) ، تدرج اللون (0) ، توازن اللون الأبيض ، التشبع (45-50) ، الحدة (0) ، جاما (5) ( الشكل 2 ب). كانت الإعدادات المستخدمة في هذه الدراسة على النحو التالي: السطوع (64) ، التباين (14) ، الصبغة (0) ، التشبع (47) ، الحدة (0) ، جاما (5).
   ملاحظة: يجب ضبط إعدادات الكاميرا على الإضاءة الخارجية لضمان أفضل جودة للصورة. يمكن تكييف الإعدادات وفقا لظروف المستخدم في غرفة النمو.
6. اضبط إعدادات التقاط الصور بالنقر فوق رمز التقاط الصور (الشكل 2C ، الجزء المحاط بدائرة 2). انقر فوق الزر فيديو منقضي وقتي واضبط التقاط الصور كل 15 دقيقة لمدة 24 ساعة (الشكل 2 ج).
   ملاحظة: الفاصل الزمني بين الصور الملتقطة ومدة التصوير مرن تماما ويمكن تكييفه وفقا لاحتياجات التجربة. في الوقت بين التقاط الصورة ، يتم إيقاف تشغيل ضوء LED. يتم تشغيل ضوء LED تلقائيا أثناء التقاط الصورة.
7. ابدأ التقاط الصور بالنقر فوق الزر START (الشكل 2C).
   ملاحظة: بعد نقلها من 28 درجة مئوية إلى 22 درجة مئوية ، يجب أن تبدأ النباتات في تطوير الآفات في غضون 24 ساعة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقد يكون هذا علامة على التلقيح غير الفعال. اضبط كمية مسحوق الكربوروندوم ، وتأكد من أن وقت حضانة اللقاح على الأوراق كان صحيحا ، وحدد وفرة الفيروس في اللقاح بواسطة qPCR.
8. لحفظ الصور ، حدد جميع الصور وانقر فوق حفظ رمز (الشكل 2 ب ، الجزء المحاط بدائرة 3). تعيين خيارات التصدير. اضبط DPI بحد أقصى (300) (الشكل 2D). بعد الحفظ ، احذف جميع الصور في البرنامج.
9. لتحليل الصور ، يكفي أي برنامج لعرض / تحرير الصور. استخدام البرمجيات الحرة لتحرير الصور، ImageJ، موضح أدناه.
   1. استيراد التسلسل الزمني للصور من مجال رؤية واحد (في الزاوية العلوية اليمنى، انقر فوق ملف، وحدد استيراد، ثم تسلسل الصور). الصق مسار دليل الصور المحفوظة واضغط على الزر موافق ( OK ) لبدء التحويل.
   2. بعد التحويل ، يفتح البرنامج تلقائيا مشغل فيديو داخلي يعرض الفيديو النهائي. قم بتصدير ملف الفيديو بالنقر فوق ملف > حفظ باسم الخيار وتحديد تنسيق AVI. تفتح نافذة صغيرة. اضبط معدل الإطارات على 0.3 إطارا في الثانية واضغط على OK لحفظ الفيديو كملف فيديو AVI.
      ملاحظة: يمكن أيضا تحديد وقت تطور الآفة عن طريق التحقق يدويا من جميع الصور والعثور على صورة تظهر فيها الآفة.

النتائج

توضح هذه الدراسة بروتوكولا خطوة بخطوة لدراسة بدء موت الخلايا من خلال حدوث الآفة على السيرة الذاتية للبطاطس. ريوال ، مع المجهر الرقمي. وهذا يتيح تحديد الوقت الدقيق لبدء موت الخلية المبرمج.

وضعت النباتات التي وضعت جذورها في التربة 2 أسابيع بعد السيرة الذاتية للبطاطس. الانتشار الدقيق ريوال (الشكل 1 أ ، ب). بعد 3-4 أسابيع من النمو في ظل الظروف الموصوفة ، تم استخدام النباتات التي تحتوي على 3-4 أوراق مكتملة النمو على الأقل مع منشورات مرئية تبدو صحية ، مع عدم وجود علامات انقطاع ، لمزيد من التحليل (الشكل 1C). باستخدام المجهر الرقمي كما هو موضح في هذا البروتوكول ، لاحظنا نفس المنطقة على الورقة الملقحة كل 15 دقيقة وحددنا حدوث الآفة وتمددها في الوقت المناسب (الشكل 3). حدثت الآفة في 15 ساعة و 30 دقيقة (الشكل 3).

الشكل 1: تحضير النبات للتحليل باستخدام المجهر الرقمي . (أ) صندوق بلاستيكي بوسط MS 30 وسيرة البطاطس. نباتات نبات ريوال تحتوي على العقد. (ب) السيرة الذاتية للبطاطس. نبات ريوال في التربة (2 أسابيع بعد التكاثر الدقيق). (ج) السيرة الذاتية للبطاطس. نبات Rywal ، جاهز للتلقيح (بعد 4 أسابيع من وضعه في التربة) ، يحتوي على ثلاث أوراق مكتملة النمو على الأقل. (د) الورقة الملقحة الثانية (السهم) من السيرة الذاتية للبطاطس. مصنع ريوال وضعت وشل حركتها (السهم) مع الشريط. (ه) وضع النبات تحت المجهر الرقمي مع توجيه السهم إلى القرص المستخدم للتركيز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: إعداد البرامج الرقمية لتسجيل تطور الآفة. ( أ) واجهة البرنامج - محاطة بدائرة باللون الأحمر هي خيارات للزر الخاص ب (1) إعدادات الكاميرا و (2) إعدادات التقاط الصور و (3) حفظ الصور. (B) نافذة مع إعدادات الكاميرا ، والتي تفتح بنقرة واحدة على (1) في اللوحة A. يجب ضبط السطوع والتباين والتشبع والحدة وجاما بشكل صحيح. (C) نافذة مع إعدادات التقاط الصور ، والتي تفتح بنقرة على (2) المشار إليها في اللوحة A. (D) نافذة مع إعدادات حفظ الصورة ، والتي تفتح بنقرة على (3) المشار إليها في اللوحة A. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: تكون الآفة على الورقة الملقحة التي لوحظت تحت المجهر الرقمي. صور للجزء المركزي من أوراق البطاطس الملقحة ب PVY عند تكبير 23.6x كما يظهر تحت المجهر الرقمي ، تم التقاطها على فترات 5 دقائق. تم وضع النباتات الملقحة عند 28 درجة مئوية لمدة 3 أيام ، وفي اليوم الثالث ، بدأت المراقبة باستخدام مجهر رقمي عند 22 درجة مئوية في الساعة 7:00. (أ) في الساعة 21:02 ، لم تكن الآفة مرئية بعد ، (ب) بعد 90 دقيقة ، الساعة 22:32 ، تكون الآفة مرئية. (ج) لوحظ توسع الآفة في الساعة 01:02 و (د) 07:32 في صباح اليوم التالي. تكررت التجربة مرتين ، وحدثت الآفات بعد 8 ساعات و 15 دقيقة ، و 12 ساعة بعد بدء موت الخلية ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يسمح البروتوكول الموضح للمستخدم بتحديد معدل بدء موت الخلية بدقة عن طريق التصوير المستمر للأوراق الملقحة في الوقت بين بدء موت الخلية وظهور موت الخلية باستخدام مجهر رقمي. على الرغم من وجود طرق عديدة لمراقبة حدوث الآفات والأمراض النباتية¹²،¹³،¹⁴،¹⁵ ، فإن هذا البروتوكول يقدم ميزة القياس المستقل عن الضوء دون الإخلال بإيقاع الساعة البيولوجية للنبات ^، حيث يتم إيقاف تشغيل الضوء بين القياسات.

بعد التلقيح ، يجب أن تنمو النباتات عند 28 درجة مئوية لمدة 3 أيام. يعتمد جين مقاومة Ny-1 ، الذي يحفز استجابة شديدة الحساسية ، على درجة الحرارة ، وفي النباتات التي تزرع في درجات حرارة أعلى ، يؤدي إلى إجهاض المقاومة ، والذي يتجلى في نقص تكوين الآفة وانتشار الفيروس الجهازي³. بعد نقل النباتات إلى 22 درجة مئوية ، يبدأ موت الخلايا ، لذلك للحصول على نتائج دقيقة ، يجب أن تبدأ المراقبة باستخدام المجهر الرقمي في أقرب وقت ممكن بعد هذا النقل. خطوة أخرى حاسمة في إعداد النبات للتصوير هي تثبيت الورقة (الشكل 1D) ، حيث سيستمر النبات في النمو أثناء التصوير ، مما قد يؤدي إلى إبعاد الورقة المرصودة عن التركيز ، أو أن هذا الإعداد لن يعطي النتائج المرجوة.

إذا تم استخدام البروتوكول الموصوف على النباتات المحورة وراثيا ذات المكونات المتغيرة ذات الأهمية ، والتي يفترض أنها تشارك في بدء موت الخلايا ، فإن البروتوكول يمكن المستخدم من تحديد ما إذا كان المستوى المنخفض للمكون المدروس يؤثر على معدل بدء موت الخلية. من خلال ذلك ، يمكن تحديد المكونات المشاركة في بدء موت الخلايا في الأنظمة المرضية ، حيث يحدث موت الخلايا المبرمج ، باستخدام هذا البروتوكول. الطرق الأخرى لتحديد هذه المكونات هي ، على سبيل المثال ، التحليل النسخي مثل RNA-seq أو أشكال مختلفة من الفحص المجهري ، والتي يمكن أن تكون مكلفة وتستغرق وقتا^{طويلا 16}. تسمح الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول بتحديد سهل وغير مكلف للمكونات المشاركة في بدء موت الخلايا من خلال ملاحظة الاختلافات في معدلات بدء موت الخلايا بين النباتات المحورة وراثيا ومحطات التحكم. على النحو الأمثل ، في مثل هذا الإعداد ، يجب استخدام كاميرتين رقميتين ، حيث يجب تحليل النبات المعدل وراثيا بالتوازي مع مصنع التحكم في نفس التجربة.

في هذا البروتوكول ، تم استخدام سلالة PVY N-Wilga. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام سلالات أخرى من هذا الفيروس ، على سبيل المثال ، PVY (PVY-N605 (123) -GFP) ⁷ الموسومة ب GFP. علاوة على ذلك ، يمكن دراسة الأنظمة المرضية الأخرى ، والتي تؤدي إلى تطور موت الخلايا المبرمج باستخدام هذا البروتوكول مع تعديل طفيف.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol burner	Mikro+Polo	SH-234002455	For tweezers and scalpel sterilization
Autoclave A-21 CAV	Kambi	N/A
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010
Carborundum powder	VWR Chemicals	22505297
DinoCapture 2.0	Dino-Lite	Version 2.0	software for digital microscope
Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope	AnMo Electronics Corporation	AM7915MZTL
Ethanol, 70%	Stella Tech	P94000	For tweezers and scalpel sterilization
Extraction bags	Bioreba	420100
Growth chamber FS-WI	Photon Systems Insturments	N/A
Hand homogenizer	Bioreba	400010
Hawita Special Substrate	HAWITA Gruppe	2000000071701	Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8)
Hydrochloric acid (HCl)	Merck	109057
Label tape	Sigma	L8144-5EA
Laptop computer with installed DinoCapture 2.0	HP	Z2V77EA#BED	Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber
Murashige and Skoog medium	Duchefa Biochemie	M02220100
Na2HPO4	Emsure	1065860500
NaH2PO4	Emsure	1064700250
Pasteur pipette  0.5 mL	Brand	21500209
pH-meter	Mettler Toledo	ML1601
Plastic boxes	Cvetlice Dornig	VCG10.5	Radius = 10.5 cm
Plastic pots	Lab Associates	DIS40003	Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom)
Saccharose	Kemika d.d.	1800408
Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA)	Sigma-Aldeich	228680	Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent
Sodium hydroxide (NaOH)	Merck	106462
Sterile surgical blades	Braun	4511733633
Tweezers	Braun	BD033R