Studiare l'inizio della morte cellulare utilizzando un microscopio digitale

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per studiare il tasso di inizio della morte cellulare programmata mediante imaging continuo delle foglie inoculate dopo l'induzione della morte cellulare.

Abstract

La resistenza conferita dalla risposta ipersensibile (HR) è un'efficace risposta di difesa che può essere determinata dai geni di resistenza N . L'HR si manifesta con la formazione di zone di morte cellulare sulle foglie inoculate. Qui, viene presentato un protocollo per studiare il tasso di inizio della morte cellulare mediante imaging delle foglie inoculate nel tempo tra l'inizio della morte cellulare e la comparsa della morte cellulare utilizzando un microscopio digitale. Il microscopio digitale consente un processo di imaging continuo negli intervalli desiderati, che consente una determinazione accurata del tasso di inizio della morte cellulare fino a minuti esatti, rispetto alle ore dei metodi tradizionali. Anche l'imaging con il microscopio digitale è indipendente dalla luce e può quindi essere utilizzato sia di giorno che di notte senza disturbare il ritmo circadiano della pianta. Diversi patosistemi che portano allo sviluppo programmato della morte cellulare potrebbero essere studiati utilizzando questo protocollo con piccole modifiche. Nel complesso, il protocollo consente quindi un'identificazione semplice, accurata ed economica del tasso di inizio della morte cellulare.

Introduzione

La patata è una delle colture alimentari più coltivate al mondo, al quarto posto dopo riso, grano e mais. Tuttavia, la produzione di patate può essere gravemente influenzata dal virus Y della patata (PVY), che è attualmente considerato il suo più importante patogeno virale ^1,2. Nelle piante di patata cv. Rywal, diversi ceppi di PVY (tra cui il ceppo PVY N-Wilga) innescano una resistenza conferita dalla risposta ipersensibile (HR), in cui la restrizione del patogeno al sito di infezione si manifesta come lesioni necrotiche sulle foglie inoculate³. In questo patosistema, l'HR è mediata dal gene di resistenza Ny-1, che è dipendente dalla temperatura, in quanto le piante cresciute a temperature più basse sviluppano in modo efficiente lesioni necrotiche, mentre nelle piante cresciute costitutivamente a temperature elevate (28 °C), l'aborto della resistenza è dimostrato come mancanza di formazione di lesioni e diffusione sistemica del virus ^3,4. Quando le piante vengono trasferite a una temperatura più bassa (22 °C), si innesca la morte cellulare, che può essere sfruttata per seguire il tasso di inizio della morte cellulare mediante imaging delle foglie inoculate nel tempo che intercorre tra l'inizio della morte cellulare e la comparsa della morte cellulare.

Questo protocollo dimostra un metodo semplice per la determinazione del tasso di inizio della morte cellulare utilizzando un microscopio digitale. Analizzando le foglie inoculate dopo aver trasferito la pianta da 28 °C a 22 °C, un microscopio digitale consente l'osservazione continua della foglia negli intervalli desiderati. A differenza dell'uso di altri metodi (ad esempio, la microscopia confocale o l'osservazione della formazione della lesione ad occhio nudo), questo consente di determinare il momento esatto di formazione della lesione e, quindi, il tasso di inizio della morte cellulare fino a minuti esatti, rispetto alle ore dei metodi^sopra menzionati ^5,6. Anche l'uso del microscopio digitale è indipendente dalla luce e può quindi essere utilizzato sia di giorno che di notte. Questo protocollo può essere utilizzato anche per identificare i componenti coinvolti nell'inizio della morte cellulare o per determinare gli effetti di diversi componenti sul tasso di inizio della morte cellulare se le piante utilizzate sono transgeniche e hanno livelli alterati di componenti di interesse.

Protocollo

NOTA: Le sezioni 1 e 2 descrivono un protocollo modificato per la preparazione del materiale vegetale basato sui metodi delineati da Lukan et ^al.7. In particolare, sono state apportate alcune modifiche alle condizioni ambientali controllate e alla preparazione dell'inoculo.

1. Coltivare piante di patate

1. Coltiva una patata sana cv. Piante di Rywal in coltura di tessuto del nodo del gambo⁸.
2. Dopo 6-8 settimane, tagliare dieci espianti lunghi 1 cm contenenti nodi di piante di patata su carta sterile in condizioni sterili utilizzando una pinzetta sterile e un bisturi.
3. Trasferiscili in scatole di plastica con terreno Murashige e Skoog (MS30) (Figura 1A) e coltivali in condizioni ambientali controllate (22 °C alla luce e 19 °C al buio con radiazioni di 250 μE o μmol/m²/s e un fotoperiodo di 16 ore, con un'umidità relativa del 55% ± 5%).
4. Trasferiscili al terreno 2 settimane dopo la micropropagazione.
   1. Riempi i vasi (r = 10 cm) con terriccio. Usa un dito per creare un buco profondo 3-4 cm nel terreno al centro di un vaso, riempi il buco con acqua e attendi che si assorba.
   2. Metti una pianta per vaso nella buca, lasciando le foglie sopra la superficie. Coprite delicatamente le radici con il terriccio (Figura 1B).
      NOTA: Alcune piante potrebbero non sviluppare radici. Escludere tali piante dall'analisi.
5. Coltivare le piante in terra in camera di crescita in condizioni ambientali controllate (22 °C alla luce e 19 °C al buio, con un'umidità relativa del 55% ± 5%, con una radiazione di 250 μmol/m²/s e un fotoperiodo di 16 ore).
6. Dopo 3-4 settimane, le piante sono pronte. Usa queste piante per essere inoculato.
   NOTA: Le piante dovrebbero avere almeno 3-4 foglie completamente sviluppate con foglioline visibili (Figura 1C). Dovrebbero avere un aspetto sano, senza sintomi visibili (foglie gialle o marroni), che potrebbero essere scambiate per lesioni causate da PVY. Per ottenere risultati comparabili, le piante dovrebbero essere inoculate contemporaneamente (ad esempio, alle 9 del mattino) in tutti gli esperimenti per evitare possibili effetti del ritmo circadiano sulla risposta immunitaria della pianta e sulla formazione di lesioni 9,10,11.

2. Preparazione dell'inoculo e inoculo della patata

1. Inoculare la pianta con PVY ceppo N-Wilga (PVY^N-Wi; accession n. EF558545) inoculo come indicato di seguito.
   NOTA: È possibile inoculare più piante in parallelo se è disponibile più di un microscopio digitale. Le piante dovrebbero avere almeno tre foglie completamente sviluppate prima dell'inoculazione (Figura 1C). PVY^N-Wi è moltiplicato e mantenuto in patata cv. Pentland.
   1. Preparare il tampone fosfato, integrato con dietilditiocarbammato di sodio (DIECA), per l'inoculazione: mescolare 1,3 mL di 0,2 M NaH 2 PO 4,8,7 mL di 0,2 M Na₂HPO₄ e 0,225 g di DIECA. Portare il volume a 100 mL con ddH₂0. Regolare il pH a 7,6 aggiungendo 1 M di NaOH o 1 M di soluzione di HCl.
   2. Raccogli 6-8 settimane di vita PVY^N-Wi patata infetta cv. Piante di Pentland da coltura tissutale in sacchi di estrazione con rete filtrante (0,5 g per 6 piante) e aggiungere tampone fosfato integrato con DIECA (4x massa di materiale vegetale, rapporto massa/volume). Utilizzare un omogeneizzatore manuale per 1-2 minuti per ottenere una soluzione omogenea.
   3. Spolverare leggermente le prime tre foglie inferiori completamente sviluppate delle piante di patate di 3-4 settimane (dal punto 1.6) con polvere di carborundum.
      NOTA: Regolare la quantità di polvere di carborundum. Una quantità eccessiva può causare danni, mentre una quantità insufficiente potrebbe causare un'infezione inefficace. In modo ottimale, vengono utilizzati 0,1 mg/cm di polvere di carborundum, ovvero circa 1,5 mg di polvere per foglia di dimensioni medie (circa 15 cm²).
   4. Strofinare delicatamente le foglie con l'inoculo (~100 μL per foglia). Dopo 10 minuti, lavare accuratamente le foglie con acqua di rubinetto.
      1. Fai attenzione a non danneggiare le foglie. Non superare il tempo di incubazione. Regolare la quantità dell'inoculo in base alla dimensione della foglia - 6,5 μL/cm, che è di circa 100 μL per foglia di dimensione media (circa 15 cm²).
   5. Trasferire le piante in una camera di crescita e farle crescere in condizioni ambientali controllate (28 °C alla luce e 28 °C al buio ad un'umidità relativa del 55% ± 5%, con una radiazione di 250 μmol/m²/s e un fotoperiodo di 16 h) per 3 giorni.

3. Preparazione delle piante e utilizzo del microscopio digitale per la registrazione dello sviluppo delle lesioni

1. Trasferire le piante inoculate dalla camera di crescita mantenuta a 28 °C a una camera di crescita a 22 °C 3 giorni dopo l'inoculazione, con le altre condizioni descritte al punto 1.5.
2. Seleziona una pianta per l'osservazione. Immobilizzare la seconda foglia inoculata con del nastro adesivo (Figura 1D). Assicurarsi che la foglia desiderata sia completamente immobilizzata prima di iniziare con l'imaging (Figura 1D).
3. Installare un'applicazione software per l'acquisizione di immagini sul computer portatile. Collegare il microscopio digitale al computer. Aprire il software.
   NOTA: Assicurarsi che l'impianto, il microscopio digitale e il laptop siano posizionati sul ripiano vicino alla presa per collegare il computer. La decisione sulla selezione delle foglie da monitorare potrebbe dipendere dalla questione biologica studiata, ad esempio il tipo di processo che porta alla formazione di una limitata morte cellulare programmata.
4. Regolare il microscopio sopra la foglia immobilizzata. Mettere a fuoco utilizzando la manopola del microscopio digitale (mostrato nella Figura 1E).
   1. Assicurarsi che la linea di vista sia la più ampia possibile per aumentare le possibilità di catturare la formazione della lesione, ma comunque sufficientemente ingrandita per individuare l'aspetto della lesione (in genere, viene utilizzato un ingrandimento 25x).
5. Impostare le impostazioni della fotocamera. Fare clic sul pulsante Impostazioni nell'angolo in alto a destra dell'immagine (Figura 2A, parte 1 cerchiata) e regolare le impostazioni della fotocamera: Luminosità (60-70), Contrasto (10-15), Tonalità (0), Bilanciamento del bianco, Saturazione (45-50), Nitidezza (0), Gamma (5) (Figura 2B). Le impostazioni utilizzate in questo studio sono state le seguenti: Luminosità (64), Contrasto (14), Tonalità (0), Saturazione (47), Nitidezza (0), Gamma (5).
   NOTA: Le impostazioni della fotocamera devono essere regolate in base alla luce esterna per garantire la migliore qualità dell'immagine. Le impostazioni possono essere adattate in base alle condizioni dell'utente nella camera di crescita.
6. Impostare le impostazioni di acquisizione dell'immagine facendo clic sull'icona per Acquisizione immagine (Figura 2C, parte 2 cerchiata). Fare clic sul pulsante Time-Lapsed Video e impostare Image Capture ogni 15 minuti per 24 ore (Figura 2C).
   NOTA: L'intervallo tra le immagini scattate e la durata dell'imaging è completamente flessibile e può essere adattato in base alle esigenze dell'esperimento. Nel tempo che intercorre tra l'acquisizione dell'immagine, la luce LED si spegne. La luce LED si accende automaticamente durante l'acquisizione dell'immagine.
7. Avviare l'acquisizione dell'immagine facendo clic sul pulsante START (Figura 2C).
   NOTA: Dopo essere state trasferite da 28 °C a 22 °C, le piante dovrebbero iniziare a sviluppare lesioni entro 24 ore. In caso contrario, questo potrebbe essere un segno di inoculazione inefficace. Regolare la quantità di polvere di carborundum, assicurarsi che il tempo di incubazione dell'inoculo sulle foglie fosse corretto e determinare l'abbondanza del virus nell'inoculo mediante qPCR.
8. Per salvare le immagini, selezionare tutte le immagini e fare clic sull'icona Salva (Figura 2B, parte 3 cerchiata). Impostare le opzioni di esportazione. Impostare DPI al massimo (300) (Figura 2D). Dopo il salvataggio, eliminare tutte le immagini nel programma.
9. Per l'analisi delle immagini, è sufficiente qualsiasi programma per la visualizzazione/modifica delle immagini. L'uso del software gratuito per l'editing delle immagini, ImageJ, è spiegato di seguito.
   1. Importare la sequenza temporale di immagini da un singolo campo visivo (nell'angolo in alto a sinistra, fare clic su File, selezionare Importa, quindi Sequenza di immagini). Incollare il percorso della directory delle immagini salvate e premere il pulsante OK per avviare la conversione.
   2. Dopo la conversione, il software apre automaticamente un lettore video interno che mostra il video finale. Esporta il file video facendo clic su File >opzione Salva con nome e selezionando Formato AVI. Si apre una piccola finestra. Impostare la frequenza dei fotogrammi su 0,3 fps e premere OK per salvare il video come file video AVI.
      NOTA: Il tempo di sviluppo della lesione può anche essere determinato controllando manualmente tutte le immagini e trovando un'immagine in cui appare la lesione.

Discussione

Il protocollo dimostrato consente all'utente di determinare con precisione il tasso di inizio della morte cellulare mediante imaging continuo delle foglie inoculate nel tempo tra l'inizio della morte cellulare e la comparsa della morte cellulare utilizzando un microscopio digitale. Anche se esistono numerosi modi per monitorare l'insorgenza di lesioni e malattie delle piante^12,13,14,15, questo protocollo presenta il vantaggio di una misurazione indipendente dalla luce senza disturbare il ritmo circadiano della pianta^, poiché la luce viene spenta tra una misurazione e l'altra.

Dopo l'inoculazione, le piante dovrebbero crescere a 28 °C per 3 giorni. Il gene di resistenza Ny-1 , che induce una risposta ipersensibile, è dipendente dalla temperatura e, nelle piante coltivate a temperature più elevate, porta all'aborto della resistenza, che si manifesta come mancanza di formazione di lesioni e diffusione sistemica del virus³. Dopo che le piante sono state trasferite a 22 °C, inizia la morte cellulare, quindi per risultati accurati, l'osservazione con un microscopio digitale dovrebbe iniziare il prima possibile dopo questo trasferimento. Un altro passaggio cruciale nella preparazione della pianta per l'imaging è l'immobilizzazione della foglia (Figura 1D), poiché la pianta continuerà a crescere durante l'imaging, il che potrebbe spostare la foglia osservata fuori fuoco, o tale configurazione non darà i risultati desiderati.

Se il protocollo descritto viene utilizzato su piante transgeniche con componenti alterate di interesse, che si ipotizza siano coinvolte nell'inizio della morte cellulare, il protocollo consente all'utente di determinare se il livello diminuito di un componente studiato influisce sul tasso di inizio della morte cellulare. In questo modo, i componenti coinvolti nell'inizio della morte cellulare possono essere identificati nei patosistemi, dove si verifica la morte cellulare programmata, utilizzando questo protocollo. Altri metodi per identificare questi componenti sono, ad esempio, l'analisi trascrittomica come l'RNA-seq o varie forme di microscopia, che possono essere costose e richiedere molto tempo¹⁶. Il metodo descritto in questo protocollo consente un'identificazione facile ed economica dei componenti coinvolti nell'inizio della morte cellulare, osservando le differenze nei tassi di inizio della morte cellulare tra piante transgeniche e di controllo. Idealmente, in una tale configurazione, devono essere utilizzate due fotocamere digitali, poiché una pianta transgenica dovrebbe essere analizzata in parallelo con una pianta di controllo all'interno dello stesso esperimento.

In questo protocollo è stato utilizzato il ceppo PVY N-Wilga; tuttavia, potrebbero essere utilizzati anche altri ceppi di questo virus, ad esempio il PVY marcato con GFP (PVY-N605(123)-GFP)⁷. Inoltre, altri patosistemi, che provocano lo sviluppo programmato della morte cellulare, potrebbero essere studiati utilizzando questo protocollo con piccole modifiche.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol burner	Mikro+Polo	SH-234002455	For tweezers and scalpel sterilization
Autoclave A-21 CAV	Kambi	N/A
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010
Carborundum powder	VWR Chemicals	22505297
DinoCapture 2.0	Dino-Lite	Version 2.0	software for digital microscope
Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope	AnMo Electronics Corporation	AM7915MZTL
Ethanol, 70%	Stella Tech	P94000	For tweezers and scalpel sterilization
Extraction bags	Bioreba	420100
Growth chamber FS-WI	Photon Systems Insturments	N/A
Hand homogenizer	Bioreba	400010
Hawita Special Substrate	HAWITA Gruppe	2000000071701	Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8)
Hydrochloric acid (HCl)	Merck	109057
Label tape	Sigma	L8144-5EA
Laptop computer with installed DinoCapture 2.0	HP	Z2V77EA#BED	Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber
Murashige and Skoog medium	Duchefa Biochemie	M02220100
Na2HPO4	Emsure	1065860500
NaH2PO4	Emsure	1064700250
Pasteur pipette  0.5 mL	Brand	21500209
pH-meter	Mettler Toledo	ML1601
Plastic boxes	Cvetlice Dornig	VCG10.5	Radius = 10.5 cm
Plastic pots	Lab Associates	DIS40003	Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom)
Saccharose	Kemika d.d.	1800408
Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA)	Sigma-Aldeich	228680	Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent
Sodium hydroxide (NaOH)	Merck	106462
Sterile surgical blades	Braun	4511733633
Tweezers	Braun	BD033R