Здесь мы представляем протокол для изучения скорости инициации запрограммированной клеточной гибели путем непрерывной визуализации инокулированных листьев после индукции клеточной гибели.
Резистентность, вызванная гиперчувствительным ответом (ЧСС), является эффективной защитной реакцией, которая может быть определена генами устойчивости N . ЧСС проявляется в виде образования зон гибели клеток на привитых листьях. Представлен протокол исследования скорости инициации клеточной гибели путем визуализации инокулированных листьев во времени между инициацией клеточной гибели и возникновением клеточной гибели с помощью цифрового микроскопа. Цифровой микроскоп обеспечивает непрерывный процесс визуализации с заданными интервалами, что позволяет точно определять частоту начала клеточной гибели с точностью до нескольких минут, в отличие от часов в традиционных методах. Визуализация с помощью цифрового микроскопа также не зависит от света и поэтому может использоваться в дневное и ночное время, не нарушая циркадный ритм растения. Различные патосистемы, приводящие к запрограммированной гибели клеток, могут быть изучены с помощью этого протокола с незначительными изменениями. Таким образом, протокол позволяет просто, точно и недорого идентифицировать частоту инициации клеточной гибели.
Картофель является одной из наиболее широко выращиваемых продовольственных культур в мире, занимая четвертое место после риса, пшеницы и кукурузы. Тем не менее, производство картофеля может серьезно пострадать от вируса картофеля Y (PVY), который в настоящее время считается самым важным вирусным патогеном 1,2. В растениях картофеля cv. Rywal, несколько штаммов PVY (включая штамм PVY N-Wilga) вызывают резистентность, вызванную гиперчувствительным ответом (HR), при которой ограничение патогена в месте инфекции проявляется в виде некротических поражений на инокулированных листьях3. В этой патосистеме HR опосредована геном резистентности Ny-1, который зависит от температуры, так как у растений, выращенных при более низких температурах, эффективно развиваются некротические поражения, тогда как у растений, выращенных конститутивно при повышенной (28 °C) температуре, аборт резистентности проявляется в отсутствии образования поражения и системном распространении вируса 3,4. Когда растения переводят на более низкую температуру (22 °C), инициируется гибель клеток, что может быть использовано для отслеживания скорости инициации клеточной гибели путем визуализации инокулированных листьев в промежутке между началом клеточной гибели и появлением клеточной гибели.
Данный протокол демонстрирует простой метод определения скорости инициации клеточной гибели с помощью цифрового микроскопа. Визуализируя инокулированные листья после переноса растения с 28 °C на 22 °C, цифровой микроскоп позволяет непрерывно наблюдать за листом через желаемые промежутки времени. В отличие от использования других методов (например, конфокальной микроскопии или наблюдения за образованием очага невооруженным глазом), это позволяет определить точное время образования очага поражения и, следовательно, частоту начала гибели клеток с точностью до минут, в отличие от часов в вышеупомянутых методах 5,6. Использование цифрового микроскопа также не зависит от освещения и поэтому может использоваться как днем, так и ночью. Этот протокол также может быть использован для идентификации компонентов, участвующих в инициации клеточной гибели, или для определения влияния различных компонентов на частоту инициации клеточной гибели, если используемые растения являются трансгенными и имеют измененные уровни интересующих компонентов.
ПРИМЕЧАНИЕ: В разделах 1 и 2 описывается модифицированный протокол подготовки растительного материала, основанный на методах, описанных Lukan et al.7. В частности, были внесены некоторые изменения в контролируемые условия окружающей среды и подготовку инокулята.
1. Выращивание растений картофеля
2. Подготовка инокулята и инокуляция картофеля
3. Подготовка растений и использование цифрового микроскопа для регистрации развития поражения
В данном исследовании демонстрируется пошаговый протокол изучения инициации гибели клеток через возникновение поражения на картофеле CV. Ривал, с цифровым микроскопом. Это позволяет определить точное время начала запрограммированной клеточной гибели.
Растения, у которых развились корни, высаживали в почву через 2 недели после созревания картофеля. Микроразмножение Ривала (рис. 1А,Б). После 3-4 недель роста в описанных условиях для дальнейшего анализа использовали растения с не менее чем 3-4 полностью развитыми листьями с видимыми листочками, которые выглядели здоровыми, без признаков опадения (рис. 1С). Используя цифровой микроскоп, описанный в этом протоколе, мы наблюдали один и тот же участок на инокулированном листе с интервалом в 15 минут и определяли возникновение и распространение поражения во времени (рис. 3). Поражение произошло через 15 ч 30 мин (рис. 3).
Рисунок 1: Подготовка растения к анализу с помощью цифрового микроскопа . (A) Пластиковая коробка со средой MS 30 и картофелем CV. Растения Rywal экспланты, содержащие узлы. (Б) Картофель cv. Высаживают в почву (через 2 недели после микроразмножения). (С) Картофель cv. Растение Ривал, готовое к прививке (через 4 недели после внесения в почву), имеющее не менее трех полностью развитых листьев. (D) Второй привитый лист (стрелка) картофеля cv. Растение Рывала позиционируется и обездвиживается (стрелка) с помощью скотча. (E) Расположите растение под цифровым микроскопом так, чтобы стрелка указывала на циферблат, используемый для фокусировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Настройка цифрового программного обеспечения для регистрации развития поражения. (A) Программный интерфейс - красным обведены параметры кнопки для (1) настроек камеры, (2) настроек захвата изображения и (3) сохранения изображений. (B) Окно с настройками камеры, которое открывается при нажатии на (1) на панели A. Яркость, контрастность, насыщенность, резкость и гамма должны быть правильно отрегулированы. (C) Окно с настройками захвата изображения, которое открывается при нажатии на (2), обозначенное на панели A. (D) Окно с настройками сохранения изображения, которое открывается при нажатии на (3), обозначенное на панели A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Образование очагов поражения на инокулированном листе, наблюдаемое под цифровым микроскопом. Изображения центральной части листа картофеля, инокулированного PVY, при 23,6-кратном увеличении под цифровым микроскопом, сделанные с интервалом 5 мин. Привитые растения ставили при температуре 28 °С на 3 дня, а на третий день в 7:00 началось наблюдение с помощью цифрового микроскопа при 22 °С. (А) В 21:02 поражение еще не видно, (Б) 90 мин спустя, в 22:32, повреждение видно. (C) Расширение поражения наблюдалось в 01:02 и (D) в 07:32 на следующее утро. Эксперимент повторяли два раза, и поражения происходили через 8 ч 15 мин и 12 ч после начала клеточной гибели соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Продемонстрированный протокол позволяет пользователю точно определить частоту инициации клеточной гибели путем непрерывной визуализации инокулированных листьев во время между началом клеточной гибели и появлением клеточной гибели с помощью цифрового микроскопа. Несмотря на то, что существует множество способов мониторинга поражения и возникновения болезней растений12,13,14,15, этот протокол представляет собой преимущество светонезависимого измерения без нарушения циркадного ритма растения, поскольку свет выключается между измерениями.
После прививки растения должны расти при температуре 28 °C в течение 3 дней. Ген резистентности Ny-1 , индуцирующий гиперчувствительную реакцию, зависит от температуры, а у растений, выращенных при более высоких температурах, приводит к прерыванию резистентности, что проявляется отсутствием образования очагов поражения и системнымраспространением вируса. После переноса растений на 22 °С начинается гибель клеток, поэтому для получения точных результатов наблюдение с помощью цифрового микроскопа должно начинаться как можно скорее после этого переноса. Еще одним важным этапом подготовки растения к визуализации является иммобилизация листа (рис. 1D), так как растение будет продолжать расти во время визуализации, что может привести к смещению наблюдаемого листа из фокуса, или такая установка не даст желаемых результатов.
Если описанный протокол используется на трансгенных растениях с измененными компонентами, представляющими интерес, которые, как предполагается, участвуют в инициации клеточной гибели, то протокол позволяет определить, влияет ли пониженный уровень изучаемого компонента на скорость инициации клеточной гибели. Таким образом, компоненты, участвующие в инициации клеточной гибели, могут быть идентифицированы в патосистемах, где происходит запрограммированная клеточная гибель, с помощью этого протокола. Другими методами идентификации этих компонентов являются, например, транскриптомный анализ, такой как РНК-секвенирование, или различные формы микроскопии, которые могут быть дорогостоящими и трудоемкими. Метод, описанный в этом протоколе, позволяет легко и недорого идентифицировать компоненты, участвующие в инициации клеточной гибели, наблюдая различия в частоте инициации клеточной гибели между трансгенными и контрольными растениями. Оптимально, чтобы в такой обстановке использовались две цифровые камеры, так как трансгенное растение должно анализироваться параллельно с контрольным растением в рамках одного эксперимента.
В данном протоколе использовался штамм PVY N-Wilga; однако могут быть использованы и другие штаммы этого вируса, например, помеченный GFP PVY (PVY-N605(123)-GFP)7. Более того, другие патосистемы, приводящие к запрограммированной гибели клеток, могут быть изучены с помощью этого протокола с незначительной модификацией.
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Благодарим Барбару Ялич за техническую помощь. Это исследование было проведено при финансовой поддержке Словенского агентства по исследованиям и инновациям (финансирование основного исследования No P4-0165 и проект Z4-3217: Расшифровка окислительно-восстановительной сигнальной взаимосвязанности в устойчивости картофеля к вирусам).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alcohol burner | Mikro+Polo | SH-234002455 | For tweezers and scalpel sterilization |
Autoclave A-21 CAV | Kambi![]() | N/A | |
Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | |
Carborundum powder | VWR Chemicals | 22505297 | |
DinoCapture 2.0 | Dino-Lite | Version 2.0 | software for digital microscope |
Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope | AnMo Electronics Corporation | AM7915MZTL | |
Ethanol, 70% | Stella Tech | P94000 | For tweezers and scalpel sterilization |
Extraction bags | Bioreba | 420100 | |
Growth chamber FS-WI | Photon Systems Insturments | N/A | |
Hand homogenizer | Bioreba | 400010 | |
Hawita Special Substrate | HAWITA Gruppe | 2000000071701 | Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8) |
Hydrochloric acid (HCl) | Merck | 109057 | |
Label tape | Sigma | L8144-5EA | |
Laptop computer with installed DinoCapture 2.0 | HP | Z2V77EA#BED | Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber |
Murashige and Skoog medium | Duchefa Biochemie | M02220100 | |
Na2HPO4 | Emsure | 1065860500 | |
NaH2PO4 | Emsure | 1064700250 | |
Pasteur pipette 0.5 mL | Brand | 21500209 | |
pH-meter | Mettler Toledo | ML1601 | |
Plastic boxes | Cvetlice Dornig | VCG10.5 | Radius = 10.5 cm |
Plastic pots | Lab Associates | DIS40003 | Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom) |
Saccharose | Kemika d.d. | 1800408 | |
Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA) | Sigma-Aldeich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent |
Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106462 | |
Sterile surgical blades | Braun | 4511733633 | |
Tweezers | Braun | BD033R |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены