توليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية عن طريق الإفراط في التعبير عن التصلب المشترك والتوتر أحادي المحور 2D

Summary

توضح هذه المقالة إجراء لإنتاج iTenocytes عن طريق توليد خلايا انسجة اللحمة المتوسطة المشتقة من iPSC مع الإفراط في التعبير المشترك عن Scleraxis باستخدام ناقل عدسي فيروسي وتمدد أحادي المحور عبر مفاعل حيوي 2D.

Abstract

تتطلب تحديات اليوم في إصلاح الأوتار والأربطة تحديد مرشح مناسب وفعال للعلاج القائم على الخلايا لتعزيز تجديد الأوتار. تم استكشاف خلايا اللحمة المتوسطة (MSCs) كاستراتيجية محتملة لهندسة الأنسجة لإصلاح الأوتار. في حين أنها متعددة القدرات ولديها إمكانات التجدد في الجسم الحي ، إلا أنها محدودة في قدرتها على التجديد الذاتي وتظهر عدم تجانس النمط الظاهري. يمكن للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) التحايل على هذه القيود بسبب قدرتها العالية على التجديد الذاتي واللدونة التنموية التي لا مثيل لها. في تطور tenocyte ، Scleraxis (Scx) هو منظم جزيئي مباشر حاسم لتمايز الأوتار. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن التنظيم الميكانيكي عنصر مركزي يوجه تطور الأوتار الجنينية والشفاء. على هذا النحو ، قمنا بتطوير بروتوكول لتغليف التأثير التآزري للتحفيز البيولوجي والميكانيكي الذي قد يكون ضروريا لتوليد الخلايا الوترية. تم حث iPSCs لتصبح خلايا انسجة اللحمة المتوسطة (iMSCs) وتم تمييزها بعلامات الخلايا اللحمية المتوسطة الكلاسيكية عبر قياس التدفق الخلوي. بعد ذلك ، باستخدام ناقل عدسي فيروسي ، تم تحويل iMSCs إلى SCX بشكل ثابت (iMSC^{SCX +).} يمكن أن تنضج خلايا^{iMSC SCX +} هذه إلى خلايا iTenocytes عبر تحميل الشد أحادي المحور باستخدام مفاعل حيوي 2D. تميزت الخلايا الناتجة بمراقبة تنظيم علامات الأوتار المبكرة والمتأخرة ، وكذلك ترسب الكولاجين. يمكن استخدام هذه الطريقة لتوليد الخلايا iTenocytes لمساعدة الباحثين في تطوير مصدر غير محدود للخلايا الخيفية الجاهزة لتطبيقات العلاج بخلايا الأوتار.

Introduction

لمعالجة المشكلات المعاصرة في إصلاح الأوتار والأربطة ، هناك حاجة إلى مرشح خلية ذي صلة مناسب للعلاجات القائمة على الخلايا. تتضمن إحدى طرق التحقيق في هندسة الأنسجة لإصلاح الأوتار استكشاف خلايا اللحمة المتوسطة المشتقة من نخاع العظم (BM-MSCs) والخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ASCs) كاستراتيجيات محتملة. تتمتع هذه الخلايا بقدرة متعددة القدرات ووفرة كبيرة وإمكانات متجددة في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، فقد أظهروا قدرة شفاء محسنة ونتائج وظيفية محسنة في النماذج الحيوانية¹. ومع ذلك ، فإن هذه الخلايا تظهر قدرات محدودة على التجديد الذاتي ، وتنوع النمط الظاهري ، وعلى وجه الخصوص ، قدرة محدودة على تكوين الأوتار. توفر تقنية الخلايا الجذعية....

Protocol

يمكن إجراء هذا البروتوكول لإنتاج iTenocytes في ثلاث خطوات رئيسية: iPSCs إلى iMSCs (10 أيام) ، iMSC إلى iMSC^{SCX +} (2 أسابيع) ، iMSC^{SCX +} إلى iTenocytes (4 أيام على الأقل). يمكن إيقاف كل خطوة رئيسية في البروتوكول مؤقتا وإعادة تشغيلها لاحقا ، اعتمادا على الجدول الزمني التجريبي. بالنسبة للطرق التي تنطوي على زراعة الخلايا ، يجب استخدام تقنيات معقمة. يجب أن تنمو جميع الخلايا في هذا البروتوكول عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ و 95٪ رطوبة.

1. تحريض iPSC البشري في الخلايا اللحمية المتوسطة المستحثة (iMSCs)

1. إعداد التجربة
   1. قم بإعداد وسائط الأجسام المتوسطة - الجنينية المعدلة من Iscove (IMDM-EB)....

النتائج

تمايز iPSCs البشرية إلى iMSCs
كما هو موضح سابقا ، فإن البروتوكول الحالي للتمييز بين iPSCs إلى iMSCs ينطوي على تكوين أجسام جنينية². تستغرق هذه العملية حوالي عشرة أيام للحث على iMSCs من iPSCs (الشكل 1A). ومع ذلك ، يوصى بشدة بتمرير iMSCs التي تم إنشاؤها حديثا مرتين على الأق?.......

Discussion

في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء iTenocytes من خلال ثلاث خطوات رئيسية: (1) تحريض iPSCs إلى iMSCs ، (2) الإفراط في التعبير عن SCX باستخدام ناقل عدسي فيروسي ، و (3) نضوج الخلايا من خلال التوتر أحادي المحور ثنائي الأبعاد.

تم وصف البروتوكول المقدم للتمييز بين iPSCs إلى iMSCs مسبقا من قبل مجموعتنا

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Accutase	StemCell Technologies	7920	cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solution	Thermofisher	15240096
Anti-CD105	Ancell	326-050
APC mouse anti-human CD44	BD Biosciences	559942
APC mouse IgG2 K isotype control	BD Biosciences	555745
BenchMark fetal bovine serum	GeminiBio	100-106
Biglycan	Thermofisher	Hs00959143_m1
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00943809_m1
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	D8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Thermofisher	11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM)	ATCC	30-2003
Fibronectin bovine plasma	Sigma Aldrich	F1141
FITC mouse anti-human CD90	BD Biosciences	555595
Gelatin from porcine skin	Sigma Aldrich	G1890
Goat anti Mouse IgG1-PE	Bio-Rad	STAR117
HEK 293T/17	ATCC	CRL-11268
IMDM, no phenol red	Thermofisher	21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1	Cedars-Sinai iPSC Core Facility	N/A	https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC	Miltenyi Biotec	130-113-271
KnockOut serum replacement	Thermofisher	10828010
L-ascorbic acid	Sigma Aldrich	A4544
L-Glutamine	Thermofisher	2503081
Matrigel	Corning	354230	basement membrane matrix
MechanoCulture FX	CellScale	N/A	stretching apparatus
MEM non-essential amino acids solution	Thermofisher	11140050
Mohawk human Taqman primer	Thermofisher	Hs00543190_m1
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276
PBS	Thermofisher	10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer	Thermofisher	Hs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)	Sigma Aldrich	192066
Polybrene infection/transfection reagents	Millipore Sigma	TR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primer	RnD Systems	240-B
Scleraxis human Taqman primer	Thermofisher	Hs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone	OriGene	RC224305L4
Silicone plates	CellScale	N/A
Sodium azide	Millipore Sigma	S2002
Tenascin C human Taqman primer	Thermofisher	Hs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primer	Thermofisher	Hs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primer	Thermofisher	Hs00170261_m1
Transfection reagent, BioT	Bioland Scientific LLC	B01-01
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermofisher	25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3	Thermofisher	Hs03043892_m1
Y-27632 dihydrochloride	Biogems	1293823