Kombine skleraksi aşırı ekspresyonu ve 2D tek eksenli gerilim yoluyla indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı iTenositlerin üretilmesi

Özet

Bu makale, bir lentiviral vektör ve bir 2D biyoreaktör aracılığıyla tek eksenli germe kullanarak Skleraxis'in kombine aşırı ekspresyonu ile iPSC'den türetilmiş mezenkimal stromal hücreler üreterek iTenositler üretme prosedürünü açıklamaktadır.

Özet

Günümüzün tendon ve bağ onarımındaki zorlukları, tendon rejenerasyonunu desteklemek için hücre bazlı tedavi için uygun ve etkili bir adayın belirlenmesini gerektirmektedir. Mezenkimal stromal hücreler (MSC'ler), tendon onarımı için potansiyel bir doku mühendisliği stratejisi olarak araştırılmıştır. Multipotent olmalarına ve in vivo rejeneratif potansiyele sahip olmalarına rağmen, kendi kendini yenileme kapasiteleri sınırlıdır ve fenotipik heterojenlik sergilerler. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler), yüksek kendini yenileme kapasiteleri ve benzersiz gelişimsel plastisiteleri nedeniyle bu sınırlamaları aşabilir. Tenosit gelişiminde, Skleraksi (Scx), tendon farklılaşmasının çok önemli bir doğrudan moleküler düzenleyicisidir. Ek olarak, mekanoregülasyonun embriyonik tendon gelişimini ve iyileşmesini yönlendiren merkezi bir unsur olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, tenosit üretmek için gerekli olabilecek biyolojik ve mekanik stimülasyonun sinerjik etkisini kapsüllemek için bir protokol geliştirdik. iPSC'ler mezenkimal stromal hücreler (iMSC'ler) haline geldi ve akış sitometrisi yoluyla klasik mezenkimal stromal hücre belirteçleri ile karakterize edildi. Daha sonra, bir lentiviral vektör kullanılarak, iMSC'ler SCX'i (iMSC^SCX+) stabil bir şekilde aşırı eksprese etmek için dönüştürüldü.Bu iMSC^SCX+ hücreleri, bir 2D biyoreaktör kullanılarak tek eksenli çekme yüklemesi yoluyla iTenositlere daha da olgunlaştırılabilir. Elde edilen hücreler, erken ve geç tendon belirteçlerinin yukarı regülasyonunun yanı sıra kollajen birikiminin gözlemlenmesiyle karakterize edildi. Bu iTenosit üretme yöntemi, araştırmacılara tendon hücre tedavisi uygulamaları için potansiyel olarak sınırsız bir kullanıma hazır allojenik hücre kaynağı geliştirmede yardımcı olmak için kullanılabilir.

Giriş

Tendon ve bağ onarımındaki çağdaş sorunların üstesinden gelmek için, hücre bazlı tedavilere uygun uygun bir hücre adayına ihtiyaç vardır. Tendon onarımı için doku mühendisliğinde bir araştırma yolu, potansiyel stratejiler olarak kemik iliği kaynaklı mezenkimal stromal hücrelerin (BM-MSC'ler) ve adipoz doku kaynaklı stromal hücrelerin (ASC'ler) araştırılmasını içerir. Bu hücreler multipotent yeteneğe, büyük bolluğa ve in vivo rejeneratif potansiyele sahiptir. Ek olarak, hayvan modellerinde gelişmiş iyileşme kapasitesi ve gelişmiş fonksiyonel sonuçlar göstermişlerdir¹. Bununla birlikte, bu hücreler sınırlı kendini yenileme yetenekleri, f....

Protokol

iTenosit üretmek için bu protokol üç ana adımda gerçekleştirilebilir: iPSC'lerden iMSC'lere (10 gün), iMSC'den iMSC^SCX+ 'a (2 hafta), iMSC^SCX+ 'dan iTenositlere (en az 4 gün). Protokoldeki her önemli adım, deneysel zaman çizelgesine bağlı olarak daha sonra duraklatılabilir ve yeniden başlatılabilir. Hücrelerin kültürlenmesi ile ilgili yöntemler için steril teknikler kullanılmalıdır. Bu protokoldeki tüm hücreler 37 °C, %5_CO2 ve %95 nemde büyütülmelidir.

1. İndüklenmiş Mezenkimal Stromal Hücrelere (iMSC'ler) insan iPSC indüksiyonu

1. Deney hazırlığı
   1. Iscove'un Modifiye Dulbecco'nu....

Tartışmalar

Bu protokolde, iTenositler üç ana adımla üretilir: (1) iPSC'lerin iMSC'lere indüksiyonu, (2) bir lentiviral vektör kullanılarak SCX'in aşırı ekspresyonu ve (3) hücrelerin 2D tek eksenli gerilim yoluyla olgunlaşması.

iPSC'leri iMSC'lere ayırmak için sunulan protokol daha önce^{grubumuz 2} tarafından tanımlanmıştır. Bu yayından bu yana, iMSC'lerin klinik araştırmalarda ^21,22,23 kull.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Accutase	StemCell Technologies	7920	cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solution	Thermofisher	15240096
Anti-CD105	Ancell	326-050
APC mouse anti-human CD44	BD Biosciences	559942
APC mouse IgG2 K isotype control	BD Biosciences	555745
BenchMark fetal bovine serum	GeminiBio	100-106
Biglycan	Thermofisher	Hs00959143_m1
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00943809_m1
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	D8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Thermofisher	11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM)	ATCC	30-2003
Fibronectin bovine plasma	Sigma Aldrich	F1141
FITC mouse anti-human CD90	BD Biosciences	555595
Gelatin from porcine skin	Sigma Aldrich	G1890
Goat anti Mouse IgG1-PE	Bio-Rad	STAR117
HEK 293T/17	ATCC	CRL-11268
IMDM, no phenol red	Thermofisher	21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1	Cedars-Sinai iPSC Core Facility	N/A	https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC	Miltenyi Biotec	130-113-271
KnockOut serum replacement	Thermofisher	10828010
L-ascorbic acid	Sigma Aldrich	A4544
L-Glutamine	Thermofisher	2503081
Matrigel	Corning	354230	basement membrane matrix
MechanoCulture FX	CellScale	N/A	stretching apparatus
MEM non-essential amino acids solution	Thermofisher	11140050
Mohawk human Taqman primer	Thermofisher	Hs00543190_m1
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276
PBS	Thermofisher	10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer	Thermofisher	Hs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)	Sigma Aldrich	192066
Polybrene infection/transfection reagents	Millipore Sigma	TR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primer	RnD Systems	240-B
Scleraxis human Taqman primer	Thermofisher	Hs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone	OriGene	RC224305L4
Silicone plates	CellScale	N/A
Sodium azide	Millipore Sigma	S2002
Tenascin C human Taqman primer	Thermofisher	Hs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primer	Thermofisher	Hs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primer	Thermofisher	Hs00170261_m1
Transfection reagent, BioT	Bioland Scientific LLC	B01-01
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermofisher	25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3	Thermofisher	Hs03043892_m1
Y-27632 dihydrochloride	Biogems	1293823