إكس فيفو ثقافة تدفق زرع المشيمة - محاكاة الظروف الديناميكية في الرحم

Summary

فيما يلي بروتوكول لزراعة نباتات المشيمة في ظل ظروف التدفق المستمر. يعزز هذا النهج أنظمة الاستزراع الزغبي الثابتة التقليدية من خلال تمكين تكرار البيئات الفسيولوجية الديناميكية.

Abstract

ترتكز نماذج زراعة المشيمة خارج الجسم الحي بشكل أساسي على أنظمة الاستزراع الساكن باستخدام ألواح الآبار. ومع ذلك ، فإن هذه النماذج لا تعكس بشكل كاف الديناميكية في وضع الرحم ، حيث تواجه المشيمة إجهاد قص طفيف ثابت بسبب البلازما أو تدفق الدم. لمعالجة هذا القيد ، تم تصميم نظام زراعة التدفق لتقريب زراعة زراعة المشيمة خارج الجسم الحي من ظروف التدفق في الرحم التي تحدث داخل جسم الأم. ضمن هذا النهج ، تزرع نباتات المشيمة في سلسلة من خمس غرف تدفق مترابطة. يحافظ هذا الإعداد على تركيزات الأكسجين الفسيولوجي ومعدل تدفق ثابت. تكشف البيانات التي تم جمعها أنه في ظل ظروف التدفق ، يظهر الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة تحسنا ملحوظا مقارنة بالطرق الثابتة التقليدية. تقدم هذه التقنية المبتكرة وسيلة مباشرة لثقافة زرع المشيمة خارج الجسم الحي ، مما يوفر تمثيلا أكثر إخلاصا للديناميكية في بيئة الجسم الحي . علاوة على ذلك ، تقدم هذه الدراسة إمكانيات جديدة للتحقيق في الديناميات الوظيفية لواجهة الجنين والأم. من خلال تبني منهجيات ديناميكية مجدية ، يتم تسهيل فهم أعمق لبيولوجيا المشيمة ، مما يؤكد أهميتها لصحة الأم والجنين.

Introduction

منذ ستينيات القرن العشرين ، تم استخدام زراعة المشيمة في الجزء السفلي من صفيحة البئر لدراسة واجهة الجنين والأم^1،2،3. هذه الطريقة راسخة ومباشرة ، مما يتيح استخدام الأنسجة البشرية لدراسات مختلفة ، بالإضافة إلى مزارع الخلايا المفردة ^2,3. بمرور الوقت ، تم تعديل التصاميم التجريبية لمزارع زرع المشيمة فيما يتعلق بتركيز الأكسجين⁴ ولمنع الأنسجة من الاستقرار في قاع صفيحة البئر^2،5،6. ومع ذلك ، لم يتم تكييف هذه الطريقة مع الظروف في الجسم الحي داخل الرحم ، وتحديدا وجود تدفق مستمر³.

يتوقف نجاح الحمل على التروية الكافية والمتسقة للفضاء بين الزغابات بدم الأم ، مما يؤدي إلى إنشاء دائرة ديناميكية مع تدفق مستمر للدم والمواد المنقولة بالدم⁷،^8،9،^10،11،12. تتميز المشيمة بنظامين متميزين لإمداد الدم ، أحدهما لدم الأم والآخر لدم الجنين ، مما يؤدي إلى نضح مزدوج من قبل كل من جهازي الجنين والأم¹³. يبدأ دم الأم في اختراق الفضاء بين الزغابات في المشيمة في نهاية الأشهر الثلاثة الأولى ، ويتدفق ببطء عبر الشرايين الحلزونية الرحمية الموسعة^10،11،14. وبالتالي ، فإن الأشجار الزغبية المشيمة تغمر في دم الأم ، مما يوفر العناصر الغذائية والأكسجين للجنين. يتدفق دم الأم هذا عبر الفضاء بين الزغابات قبل أن يعود إلى الدورة الدموية للأم عبر الأوردة الرحمية. أثناء مروره عبر الفضاء بين الزغابات ، يؤدي الانتشار والامتصاص النشط للأكسجين والمواد المغذية في دم الجنين إلى انخفاض مستويات الأكسجين والمغذيات في دم الأم^12,15. ومع ذلك ، يتم استبدال دم الفضاء بين الزغابات بالكامل بدم جديد غني بالأكسجين حوالي مرتين إلى ثلاث مرات في الدقيقة ، مما يضمن إمدادا مستمرا بالمغذيات والغازات¹³. والجدير بالذكر أن الأرومة المخلوية ، وهي الجزء الخارجي من حاجز المشيمة ، هي المكون الوحيد لشجرة الزغابات المشيمة المعرضة مباشرة لدم الأم¹⁵،^16،17. وبالتالي ، فإن الأرومة المخلوية الغاذية تعاني من إجهاد قص خفيف ثابت من دم الأم^{المتدفق 3,14}.

تسمح المعرفة العلمية الحالية المتعلقة ببيئة تدفق المشيمة والتطورات التقنية الحديثة الآن بزراعة نباتات المشيمة المكيفة والتقريبية من الناحية الفسيولوجية في ظل ظروف التدفق. علاوة على ذلك ، تشير الأدلة إلى أن قوى القص تؤثر على الوظائف البيولوجية للأرومة المخلوية¹⁸،¹⁹،^20،21. النهج المعروف الذي يفسر تدفق الدم هو نظام نضح المشيمة المزدوج^{الفص 22}. ومع ذلك ، تتطلب هذه التجارب خبرة كبيرة ، وهي مقيدة بالوقت (يتم إجراؤها لبضع ساعات فقط) ، وهي ممكنة فقط مع عينات المشيمة في الثلث الثالث من الحمل^3،23. في المقابل ، قمنا بتطوير تقنية مباشرة وغير تدخلية لزراعة الزغابات المشيمية خارج الجسم الحي تحت إعدادات التدفق المستمر ، لاستيعاب كل من أنسجة المشيمة في الثلث الأول والثالث^{من الحمل 3}. في هذا الإعداد ، تزرع نباتات المشيمة في خمس غرف تدفق متصلة بالسلسلة. يتم تثبيت النباتات الزغبية في قاع الغرفة باستخدام ارتفاعات على شكل إبرة على ألواح معدنية رقيقة. يتم نقل دائرة التدفق المبنية لاحقا إلى مفاعل حيوي ، حيث يتم تنظيم كل من تركيز الأكسجين ومعدل التدفق³. تظهر نتائج زراعة التدفق أنه يتم الحفاظ على سلامة الأنسجة بشكل أفضل مقارنة بالطريقة الثابتة^{المستخدمة عادة 3}. علاوة على ذلك ، يتيح هذا النهج الديناميكي تصميمات تجريبية جديدة ومكيفة لزراعة الأنسجة ، مما يسمح بإجراء تجارب في المختبر تحاكي البيئة الطبيعية بشكل أوثق³.

Protocol

وافقت لجنة الأخلاقيات في جامعة غراتس الطبية على هذه الدراسة (31-019 ex 18/19 الإصدار 1.2 و 29-319 ex 16/17). تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع الأشخاص المشاركين في الدراسة.

1. التحضير لتجربة التدفق

ملاحظة: تجرى التجارب في مفاعل حيوي مزود بمضخات تمعجية متكاملة (انظر جدول المواد). يمكن تعديل الرطوبة ودرجة الحرارة ومستوى الغاز داخل المفاعل الحيوي.

1. قم بتشغيل المفاعل الحيوي وقم بإجراء جميع الترتيبات المسبقة (على سبيل المثال ، معايرة المضخات ، والاحترار المسبق ، وظروف الغاز والرطوبة) للتجربة وفقا لدليل المفاعل الحيوي. قبل البدء في التجربة ، يجب تثبيت الإعدادات المطلوبة (درجة الحرارة ومحتوى الغاز والرطوبة) لبضع ساعات أو طوال الليل. للقيام بذلك ، ابدأ تشغيل المفاعل الحيوي والبرنامج ، ثم انقر فوق تغيير SetPoints ضمن عنصر القائمة "حاضنة".
2. برنامج تلفزيوني قبل التسخين والوسط المطلوب (وسط نمو الخلايا البطانية المكمل بالمكملات المقدمة hEGF-5 و HC-500 بالإضافة إلى 5٪ مصل بقري جنيني مستنفد للإكسوسوم ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين) (انظر جدول المواد) إلى 37 درجة مئوية.
   ​

2. تشريح عينة المشيمة

1. بعد الولادة مباشرة ، قم بقطع ثلاث مرات 2 سم 3 عينات مشيمية من منطقة منتصف المشيمة كما هو موضح في Kupper et^al.3 باختصار ، احتفظ بالعينات في برنامج تلفزيوني. تجاهل لوحة المشيمية ، decidua الأم ومناطق الاحتشاءات المرئية من العينة.
2. تشريح عينة الأنسجة المتبقية إلى نباتات زغبية بقطر مقطع عرضي يبلغ حوالي 0.5 سم (الوزن الرطب حوالي 7.5 ملغ). نقلها إلى طبق بتري مع برنامج تلفزيوني طازج.
3. اغسل النباتات في برنامج تلفزيوني عن طريق هزها برفق في السائل باستخدام ملاقط لإزالة بقايا الدم.
   ملاحظة: تشريح العينات في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني لغسلها مسبقا ومنعها من الجفاف واستخدام أدوات معقمة / معقمة لمعالجة الأنسجة.

3. تجربة التدفق

1. تحت غطاء معقم ، قم بتوصيل خمس غرف في سلسلة بزجاجة الخزان باستخدام أقفال luer وفقا لدليل المستخدم لغرف التدفق (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: تعقيم و / أو الأوتوكلاف جميع المواد قبل الاستخدام ، وفقا للدليل المعني. استخدم مرشح هواء على زجاجة الخزان لتبادل الغازات المعقمة. لفتح وإغلاق الغرف ، اضغط برفق في عروات الغرف. الخطوه 3.1. قد تكون مستعدة أيضا في وقت سابق.
2. اقلب الغرف رأسا على عقب وافتحها عن طريق إزالة القاع. استخدم الملقط لنقل الألواح المعدنية مركزيا في الجزء العلوي من الغرف مع توجيه المسامير لأعلى.
3. املأ الغرف ب 1 مل من الوسط المسخن مسبقا (37 درجة مئوية). ثم املأ الخزان ب 20 مل إضافية. تتطلب الدائرة إجمالي 25 مل ، بما في ذلك الحجم في كل غرفة تدفق ، في الأنابيب ، وزجاجة الخزان. تحت التدفق ، الحجم النهائي للوسط في غرفة مملوءة هو 2 مل.
4. استخدم الملقط وانقل نباتا زغبيا تلو الآخر بين إبر الصفيحة المعدنية في الغرفة. دع الإبر تنزلق بين الزغابات المشيمة لتجنب ثقب الأنسجة. نقل أربعة explants في غرفة واحدة. أغلق الغرف عن طريق إعادة تركيب الجزء السفلي بعناية. تحتوي الدائرة الكاملة على إجمالي 20 نباتا. يجب أن تظل الغرف في وضع مقلوب.
   ملاحظة: أمسك النباتات برفق بالملقط. حاول ألا تضغط عليهم. تأكد من إغلاق الغرف والدائرة تماما لمنع التسرب. تستخدم الغرف دائما رأسا على عقب. عدد النباتات لكل غرفة وعدد الغرف نفسها متغير. يشبه الإجراء الخاص بأنسجة الأثلوث الأول إجراء الأنسجة في الثلث الثالث من الحمل مع إضافة صغيرة: لإصلاح الزغابات ، ثني الإبر قليلا فوق النباتات بعد نقل الأنسجة إلى اللوحة المعدنية (التواصل الشخصي Brugger et al.). هذا يصلح الأنسجة الهشة على اللوحة المعدنية ويمنع العينات من الانزلاق.
5. نقل مجموعة التدفق إلى المفاعل الحيوي.
6. قم بتوصيل دائرة التدفق بالمضخة التمعجية داخل المفاعل الحيوي عن طريق توصيل أنبوب المضخة بالمضخة. إصلاحه^{في المرحلة 4} (سوف يسمع المرء نقرة أربع مرات).
7. إذا كانت هناك حاجة إلى تحكم ثابت ، فضع أيضا لوحة البئر في المفاعل الحيوي.
   ملاحظة: بالنسبة للاستزراع الساكن ، تمتلئ خمسة آبار من صفيحة من ستة آبار ب 4 مل من الوسط لكل بئر و 4 نباتات زغبية لكل بئر. كما يتم وضع صفيحة البئر المملوءة في المفاعل الحيوي وزراعتها في نفس الغلاف الجوي مثل زراعة ثقافة التدفق. ويرد وصف لمزيد من التفاصيل في Kupper et ^al.3
8. اضبط وضع المضخة على يدوي ضمن عنصر القائمة "المضخات". ثم اضبط سرعة المضخة على 1 مل / دقيقة وابدأ في ضخ الوسط في الأنبوب بالنقر فوق تشغيل. أثناء ملء الدائرة بوسط ، أمسك الغرف بزاوية بحيث تمتلئ بالكامل بالوسط.
   ملاحظة: انظر الجدول التكميلي 1 للاطلاع على الإعدادات التجريبية لتدفق الزغابات المشيمية والثقافة الساكنة. وترد مواصفات نظام التدفق والنظام الثابت في الجدول التكميلي 2.
   تنبيه: قم بإمالة الحجرة بعناية أثناء التعبئة لمنع العينات من الانزلاق عن الإبر.
9. بعد اكتمال التعبئة ، تظل الغرف في وضعها المقلوب. تأكد من أن الغرف تقف بشكل آمن ومستقيم ، وأغلق كلا جفني المفاعل الحيوي.
   ملاحظة: الحجم النهائي للوسط في غرفة التدفق المملوءة هو 2 مل. تم وصف الإعدادات التجريبية ومواصفات غرف التدفق وألواح الآبار المستخدمة في التجارب في Kupper et ^al.3
10. احتضان الأنسجة للوقت المطلوب.
    ملاحظة: يمكن مراقبة درجة الحرارة ومستوى الغاز ومعدل التدفق على الكمبيوتر دون فتح غطاء المفاعل الحيوي مرة أخرى.
11. أوقف المضخة بعد حضانة الأنسجة للوقت المطلوب بالنقر فوق إجهاض تحت عنصر القائمة "المضخات". افتح غطاءي المفاعل الحيوي ثم غرفة تدفق واحدة في كل مرة. قم بإزالة النباتات بعناية من اللوحة المعدنية باستخدام ملقط.
12. معالجة الأنسجة والمادة الطافية وفقا لتحليل المصب المحدد. في هذه الحالة ، تم إجراء تلطيخ كيميائي مناعي ومجهر إلكتروني³. انظر الجدول التكميلي 3 للحصول على تفاصيل الأجسام المضادة المستخدمة في الكيمياء المناعية والتألق المناعي.
    ملاحظة: بعد إزالة الأنسجة ، قم بتصريف الوسط من الدائرة عن طريق دوران المضخة عكس اتجاه عقارب الساعة.
13. قم بتفكيك وتنظيف دائرة التدفق وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لغرف التدفق والأنابيب.

النتائج

وقد نشرت بالفعل أجزاء من هذا المنشور ونتائجه (انظر المراجع 3 و 23).

الإعداد التجريبي
يوضح الشكل 1 إعدادا تجريبيا. تتكون دورة التدفق المركبة من خمس غرف تدفق مترابطة في سلسلة (الشكل 1 أ). داخل كل غرفة تدفق ، يتم زراعة أربعة نباتات ، يبلغ قطر كل منها حوالي 0.5 سم (الشكل 1 أ ، ج). بالنسبة لتجربة التحكم الساكن ، تزرع النباتات في آبار فردية من صفيحة من ستة آبار (الشكل 1 ب). لمنع طرد النباتات ، يتم لصقها على ألواح معدنية تتميز بنتوءات ضيقة على شكل إبرة (الشكل 1 د ، ه). من أجل إخضاع النباتات للتدفق المباشر للوسط ، يتم عكس الغرف ، مع وضع المداخل والمنافذ في قسم الرأس (الشكل 1 F ، G). داخل المفاعل الحيوي ، ترتبط دورة التدفق بمضخة تمعجية. لغرض مقارنة سلامة الأنسجة بين الأنسجة المستزرعة بالتدفق والأنسجة المستزرعة بشكل تقليدي ، يتم وضع النباتات في صفيحة من ستة آبار مجاورة لدورة التدفق. وهذا يضمن التحقق من ظروف الاستزراع المتسقة من حيث الأكسجين ودرجة الحرارة والرطوبة (الشكل 1 أ)³.

التحليل المورفولوجي

β أكتين
تم إجراء العديد من إجراءات التلوين المناعي الكيميائي لفحص الفروق النسيجية في سلامة الأنسجة المرتبطة بظروف الزراعة المتنوعة (الشكل 2). كانت النباتات التي تم تضمينها على الفور بعد التشريح بمثابة مرجع خط الأساس. لتحليل الهيكل الخلوي للأكتين داخل النباتات الزغبية ، تم تنفيذ تلطيخ β-أكتين (الشكل 2A-E). كشف التحليل الوصفي النقاب عن عرض مرئي جيد التنظيم ومنظم للهيكل الخلوي في الأنسجة التي تم الحصول عليها حديثا (الشكل 2 أ). بمرور الوقت ، مع تقدم الزراعة ، كان هناك تجمع ملحوظ من الخيوط الدقيقة ، مما يدل على تدهور البنية الهيكلية الخلوية. لوحظت هذه الظاهرة باستمرار في النباتات الزغبية التي خضعت لزراعة ثابتة³ (الشكل 2C ، E ، المشار إليه بالعلامات النجمية).

تلطيخ H& E
قدم تلطيخ H& E تعزيزا إضافيا للملاحظة القائلة بأن سلامة الأنسجة تتضاءل على مدار الثقافة الثابتة ، وهو اتجاه يتم تحسينه في سياق ثقافة التدفق (الشكل 2F-J). أظهرت الأنسجة الطازجة عرضا نسيجيا منظما ومميزا للنباتات الزغبية ، التي تتميز بسدى كثيفة ومعبأة بإحكام (الشكل 2F). بالإضافة إلى ذلك ، تم التصاق الأرومة المخلوية بقوة بالسدى الأساسي (الشكل 2F). لوحظ مظهر مماثل في النباتات الزغبية المستزرعة في بيئة تدفق لمدة 24 ساعة (الشكل 2G). ومع ذلك ، بعد 48 ساعة من الزراعة تحت التدفق ، لوحظ أن أجزاء من الأرومة المخلوية تنفصل جزئيا (الشكل 2I ، المشار إليه بالسهم) ، مصحوبة بثغرات صغيرة متفرقة داخل السدى. أشار الفحص النسيجي للأنسجة إلى أن سلامة الأنسجة بعد 24 ساعة في حالة ثقافة ثابتة لم يتم الحفاظ عليها بشكل كاف (الشكل 2H). علاوة على ذلك ، تدهورت هذه السلامة بشكل ملحوظ بعد 48 ساعة في الثقافة الثابتة (الشكل 2J). أظهرت السدى مظهرا مساميا ومحفورا ، وكان الانفصال الكبير للأرومة المخلوية عن السدى واضحا في مناطق أكبر (الشكل 2J ، الأسهم)³.

CD34II
تم استخدام تلطيخ CD34II لتصور الخلايا البطانية ، وبالتالي الأوعية الدموية الجنينية المشيمية داخل النباتات الزغبية (الشكل 2K-O). أظهرت الأنسجة التي تم تضمينها مباشرة بعد التشريح مباشرة ترتيبا منظما بشكل مميز للخلايا البطانية (الشكل 2K). ظلت السلامة المورفولوجية للأوعية الدموية الجنينية المشيمية محفوظة بشكل جيد بعد 24 ساعة من ثقافة التدفق وفي كثير من الأحيان حتى بعد 48 ساعة ، على الرغم من ملاحظة حالات عرضية من الأوعية الدموية المنهارة في ظل ظروف التدفق (الشكل 2 L ، N). ومع ذلك ، بعد 24 ساعة من الثقافة الثابتة ، أظهرت الأوعية الدموية انهيارا جزئيا ، كما يتضح من مظهرها البصري المعطل (الشكل 2M ، المشار إليه برؤوس الأسهم). يبدو أن هذا التدهور في الأوعية الدموية داخل بيئة الاستزراع الثابت يتفاقم مع وقت الزراعة المطول. باختصار ، أشار التقييم المورفولوجي الوصفي للنباتات الزغبية اللاحقة لكل من التدفق والثقافة الساكنة إلى أن سلامة الأنسجة يبدو أنها محفوظة بشكل أكثر فعالية داخل نظام التدفق عند مقارنتها بنمط الاستزراع^{الثابت 3}.

التحليل البنيوي للأنسجة المزروعة

المجهر الإلكتروني النافذ
لإجراء فحص أكثر تفصيلا لمورفولوجيا النباتات الزغبية ، تم إجراء تحليلات إضافية للبنية التحتية باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) (الشكل 3A-E). أكدت هذه النتائج نتائج التحقيقات النسيجية. في الأنسجة التي تم تضمينها مباشرة بعد التحضير مباشرة ، تم الحفاظ على التشكل بشكل جيد للغاية (الشكل 3 أ). كانت الزغابات الدقيقة واضحة المعالم على سطح الأرومة المخلوية. قدمت الأرومة المخلوية الغاذية طبقتها المستمرة المميزة بدون حدود الخلايا الجانبية ، مما أدى إلى إقامة اتصال مباشر مع الغشاء القاعدي. أظهرت سدى الأنسجة الطازجة تعبئة كثيفة دون ثقوب أو تمزق كبير. علاوة على ذلك ، أظهر المظهر الفائق للأوعية الدموية وكريات الدم الحمراء داخل الأوعية الدموية الفردية أيضا حفظا ممتازا (الشكل 3 أ).

حتى بعد 24 ساعة من ثقافة التدفق ، ظل التشكل العام لعينات الأنسجة جيدا نسبيا (الشكل 3 د). في حين كان هناك عدد أقل قليلا من الزغابات الدقيقة على سطح الأرومة المخلوية الغاذية مقارنة بالأنسجة الطازجة ، ظلت الأرومة الغاذية المخلوية مرتبطة بشكل أساسي بالغشاء القاعدي. كانت النوى والفجوات الصغيرة العرضية ملحوظة داخل الجزء الداخلي من الأرومة الغاذية المخلوية. بدت السدى داخل الزغابات المشيمة محفوظة جيدا وتشبه إلى حد كبير الأنسجة الطازجة (الشكل 3D). حتى بعد 48 ساعة من ثقافة التدفق ، أظهرت الخلايا اللحمية حفظا جيدا نسبيا ، وإن كان ذلك مع وجود بعض الثقوب (الشكل 3E). ومن المثير للاهتمام ، تم اكتشاف قطرات الدهون داخل الأنسجة. بينما أظهرت الأرومة المخلوية الغاذية فجوات وانخفاضا في عدد الزغابات الدقيقة ، ظلت مرتبطة بالغشاء القاعدي في العديد من المناطق ، وكانت النوى المخلوية والخلوية مرئية بوضوح (الشكل 3E).

في تناقض صارخ مع الأنسجة من ثقافة التدفق ، أظهر مورفولوجيا الأنسجة الزغبية المعرضة للثقافة الثابتة تدهورا في وقت مبكر من 24 ساعة (الشكل 3 ب). انفصلت الأرومة الغاذية المخلوية عن الغشاء القاعدي في مواقع متعددة وأظهرت ثقوبا كبيرة نسبيا. بالإضافة إلى ذلك ، كانت قطرات الدهون واضحة بشكل متكرر في كل من الأرومة المخلوية والورم (الشكل 3B). بعد 48 ساعة من الثقافة الساكنة ، كان الانخفاض التدريجي في البنية التحتية واضحة (الشكل 3C). قدمت الأرومة المخلوية العديد من الثقوب والانفصال عن الغشاء القاعدي إلى حد كبير. أصبح تحديد الخلايا داخل السدى ، وكذلك الخلايا البطانية التي تشكل الأوعية الدموية ، أمرا صعبا. علاوة على ذلك ، كان هناك تراكم ملحوظ لقطرات الدهون داخل النباتات الزغبية بعد 48 ساعة من الاستزراع الساكن (الشكل 3C). باختصار ، أظهرت البنية التحتية للأنسجة في الاستزراع الثابت تدهورا متتاليا على مدار فترة الزراعة ، وهو اتجاه تم تخفيفه عن طريق الزراعة في ظل ظروف التدفق³.

المجهر الإلكتروني الماسح
باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) ، تم تسهيل فحص مفصل لسطح النباتات الزغبية (الشكل 4A-J). أظهرت الأنسجة التي تم دمجها حديثا مجموعة مكتظة بالسكان من الزغابات الدقيقة عبر سطحها (الشكل 4 أ ، ب). أظهرت بعض المناطق هياكل تشبه الحويصلة. في المقابل ، أظهرت الأنسجة من المزرعة الثابتة انخفاضا كبيرا في الزغابات الدقيقة بعد 24 ساعة (الشكل 4C ، D) ، وهو انخفاض استمر بعد 48 ساعة (الشكل 4E ، F). بينما أظهرت بعض المناطق تجمعا للهياكل الشبيهة بالحويصلة التي لم يتم إطلاقها ، بدت مناطق أخرى عارية ومتآكلة (الشكل 4D ، F). في الأنسجة الخاضعة لثقافة التدفق ، كانت الزغابات الدقيقة لا تزال موجودة على السطح بعد 24 ساعة (الشكل 4G ، H) ، وكذلك بعد 48 ساعة (الشكل 4I ، J) ، وإن كان بدرجة أقل من الأنسجة الطازجة. بالمقارنة مع الثقافة الثابتة ، تضاءل انتشار الهياكل الشبيهة بالحويصلة على السطح. ومن المثير للاهتمام أن هذه الهياكل الشبيهة بالحويصلة تركزت بشكل ملحوظ في فترات راحة محددة حيث يمكن تقليل التدفق أو غيابه (الشكل 4H ، J) ، مما يشير إلى أنه ربما تم إزاحتها من سطح الأنسجة المعرضة للتدفق بسبب تدفق الوسط³.

الشكل 1: إعداد نظام التدفق . (أ) نظام التدفق المجمع ، الذي يتكون من الخزان وخمس غرف تدفق ، متصل بإحدى المضخات التمعجية. على الجانب الأيمن توجد صفيحة من ستة آبار يتم فيها استزراع النباتات بشكل ثابت. (ب، ج) بالنسبة لكلتا طريقتي الزراعة ، يتم تشريح عينات المشيمة إلى نباتات زغبية تبلغ حوالي 0.5 سم² ، ثم يتم استخدام أربعة نباتات لكل بئر أو غرفة. في النهج التجريبي ، يتم استخدام خمس غرف أو آبار. (د، ه) لثقافة التدفق ، يتم استخدام صفيحة معدنية ذات ارتفاعات ضيقة على شكل إبرة لتأمين النباتات. (و ، ز) توجد فتحات الأنابيب على رأس الغرف ، وبالتالي يتم استخدامها رأسا على عقب لضمان تعرض الأنسجة للتدفق المباشر. وهذا الرقم مستنسخ من Kupper et ^al.3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التحليل المورفولوجي للنباتات الزغبية المشيمة عند التدفق والثقافة الساكنة. (أ-ه) تلطيخ التألق المناعي ل β-actin لتصور الهيكل الخلوي للنباتات على الثقافة. بالنسبة للتحليل ، تم استخدام ست نقاط تم اختيارها عشوائيا لكل شريحة. يتم عرض الصور التمثيلية. أ: تصوير الهيكل الخلوي للأنسجة المضمنة مباشرة بعد التحضير. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. (B-E) تصوير تمثيلي لكل من التنكس المعتمد على الوقت والمعتمد على نمط الزراعة للهيكل الخلوي للأكتين في النباتات المستزرعة للتدفق والثقافة الساكنة. (جيم - ه) تشير العلامات النجمية إلى زيادة تراكم الشعيرات الدقيقة للأكتين ، وهو مؤشر على تدهور الهيكل الخلوي للأكتين. (ف-ج) تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين من النباتات الزغبية. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. (F ، G) تظهر الأنسجة المدمجة حديثا (F) ونباتات ثقافة التدفق لمدة 24 ساعة (G) مورفولوجيا محفوظة جيدا لنبات زغبي. (I) تظهر النباتات المستزرعة بالتدفق لمدة 48 ساعة مناطق منفصلة بشكل متقطع من الأرومة المخلوية (السهم). (ح، ي) التدهور المعتمد على الوقت للسلامة الهيكلية بعد ثقافة الزرع الثابتة ، المشار إليها بإزاحة الأرومة المخلوية (السهم) والسدى المثقوب. (ك-أو) تم استخدام CD34 II لتلطيخ الخلايا البطانية الزغبية. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. (K ، L) تظهر الأنسجة الطازجة (K) والنباتات المستزرعة لمدة 24 ساعة في ظل ظروف التدفق (L) نمطا مميزا للخلايا البطانية محاذاة هيكليا. (N) بعد 48 ساعة في ثقافة التدفق ، تنخفض سلامة الأوعية الدموية إلى حد ما. (م، س) في الثقافة الساكنة ، تكون الأوعية الدموية المنهارة مرئية بالفعل بعد 24 ساعة (M) ، والتي لوحظ أنها تزداد مع وقت زراعة ثابت أطول (O). وهذا الرقم مستنسخ من Kupper et ^al.3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: فحص البنية الفائقة قبل وبعد الزراعة للنباتات الزغبية باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ. تم استخدام الأنسجة من ثلاث تجارب مستقلة لتحليل الصور. (أ) تظهر صورة تمثيلية للأنسجة المدمجة حديثا كمية كبيرة من الزغابات الدقيقة (MV) على سطح الأرومة الغاذية المخلوية (ST). تظهر الشعيرات الدموية السليمة هيكليا (Ca) في السدى المحفوظة جيدا (S). (ب) في النسيج الذي تمت زراعته بشكل ثابت لمدة 24 ساعة، يحدث تدهور في السلامة التركيبية للأرومة الغاذية المخلوية، التي يبدو أنها منفصلة عن الغشاء القاعدي في بعض المناطق. هناك أيضا تراكم ملحوظ لقطرات الدهون (LD). (ج) بعد 48 ساعة في الاستزراع الساكن، لوحظ تدهور شديد في البنية الفائقة. السدى وكذلك الأرومة المخلوية مثقوبة وتراكم هائل لقطرات الدهون واضح. بالكاد يمكن تتبع الأوعية الدموية. (د، ه) تم الحفاظ على البنية التحتية للأنسجة من ثقافة التدفق بشكل جيد نسبيا بعد 24 ساعة (D) وكذلك بعد 48 ساعة (E). شريط المقياس: 2 ميكرومتر. MV: الزغابات الدقيقة ، ST: الأرومة المخلوية ، S: سدى ، كاليفورنيا: شعري ، LD: قطرات الدهون. وهذا الرقم مستنسخ من Kupper et ^al.3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: فحص البنية الفائقة قبل وبعد الزراعة للنباتات الزغبية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح. (أ ، ج ، ه ، ز ، ط) صور عامة لسطح الأشجار الزغبية المشيمة مع الصور التفصيلية ذات الصلة (B ، D ، F ، H ، J). (أ، ب) تظهر الأنسجة المدمجة حديثا التماس الكثيف من الزغابات الدقيقة. (ب) يمكن ملاحظة تراكيب تشبه الحويصلي في بعض المواقع. (سي إف) بعد 24 ساعة و 48 ساعة في الثقافة الثابتة ، يكون هناك انخفاض في الزغابات الدقيقة على سطح الأرومة المخلوية. اللافت للنظر هو التراكم الواسع للجزيئات الشبيهة بالحويصلية على سطح الزرع. (F) يبدو أن الجسيمات تذبل بعد 48 ساعة في الثقافة الساكنة. (ز-ي) يبدو أن سطح الأنسجة من ثقافة التدفق يتم الحفاظ عليه بشكل أفضل بعد 24 ساعة (G ، H) وكذلك بعد 48 ساعة (I ، J) مقارنة بالثقافة الساكنة. تظهر الزغابات الدقيقة على السطح (H ، J) ، على الرغم من أنها ليست بنفس الكثافة العالية كما في الأنسجة الطازجة. (ب) يمكن رؤية جسيمات حويصلية متناثرة في المنافذ ذات التدفق المنخفض. وهذا الرقم مستنسخ من Kupper et ^al.3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي 1: الإعدادات التجريبية لتدفق الزغابات المشيمية والاستزراع الساكن. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: مواصفات التدفق والنظام الثابت. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 3: الأجسام المضادة للكيمياء المناعية والتألق المناعي المستخدمة في هذه الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

تقدم هذه الدراسة منظورا فريدا حول تقنية زراعة التدفق لنباتات المشيمة المصممة لتكرار الديناميكية في بيئة الرحم ^3،23. تكشف النتائج أن مورفولوجيا الأنسجة المزروعة في ظل ظروف التدفق يتم الحفاظ عليها بشكل أفضل مقارنة بطريقة الزراعة الثابتة التقليدية³. والجدير بالذكر أنه على الرغم من أن ظروف الاستزراع الساكن أو التدفق لا تسهل تروية الأوعية المشيمية ، فقد لوحظ في الغالب تدمير الأوعية الدموية الجنينية المشيمية داخل السدى الزغبي في الثقافة الساكنة ، في حين بدا أن سلامة الأوعية الدموية يتم الحفاظ عليها بشكل أفضل على مدى فترة أطول في ثقافة التدفق³.

يمكن ربط أحد التفسيرات المحتملة لهذه الملاحظة بالدور الوقائي الحاسم والغدد الصماء للأرومة المخلوية ، وهي وظيفة موثقة جيدا في الأدبيات¹²،²⁴،^25،26. بالنظر إلى ذلك ، من المتصور أن السلامة العامة للطبقة الخارجية من الزغابات تساهم بشكل كبير في الحفاظ على السدى الأساسي ، بما في ذلك الأوعية الدموية. وبالتالي ، يمكن أن تعزى السلامة الخلوية المستمرة للأوعية الدموية في ظل ظروف التدفق إلى التدفق المستمر للوسط. تساعد هذه الحركة في الحركة السلبية للنباتات ، مما يسهل تبادل الغازات والمغذيات والجسيمات النانوية (مثل الحويصلات خارج الخلية) عبر حاجز المشيمة. وهذا بدوره يمكن أن يؤثر بشكل إيجابي على الحفاظ على مورفولوجيا الأوعية الدموية. علاوة على ذلك ، تلعب ظاهرة الإحساس الميكانيكي دورا في تكوين الأنسجة عبر الأنسجة^{المختلفة 27,28}. أظهرت الدراسات أن الحساسية الميكانيكية تؤثر على العمليات الخلوية على مستويات متعددة ، مما يؤدي إلى مجموعة من الاستجابات الكيميائية الحيوية التي تؤثر في النهاية على وظائف الأنسجة^{والأعضاء 29}. والجدير بالذكر أن البروتينات الحساسة للميكانيكا يتم التعبير عنها بواسطة الأرومة المخلوية طوال فترة الحمل²⁸. علاوة على ذلك ، تشير الدراسة إلى أن الزغابات الدقيقة على سطح الأنسجة قد تكون متورطة في هذا السياق²⁸.

هناك منظور إضافي يستحق النظر وهو الدور المحتمل للميتوكوندريا في الاستجابة الخلوية للتدفق. على سبيل المثال ، في الخلايا البطانية ، تعمل الميتوكوندريا كمحولات إشارة للاستجابات الخلوية للمنبهات البيئية³⁰. ارتبطت زيادة تراكم قطرات الدهون ، التي لوحظت في الأنسجة المستزرعة الثابتة من خلال TEM³ ، بتحريض موت الخلايا المبرمج بسبب خلل الميتوكوندريا³¹. ومن الضروري إجراء مزيد من التحقيقات للكشف عن الآليات الأساسية والعوامل الرئيسية، وربطها بمسارات الإشارات النهائية. يمكن أن يعزز هذا الاستكشاف فهمنا لكيفية إدراك الأنسجة لإجهاد القص وتفاعله معه ، مما يترجم إلى تحسين صلاحية وسلامة النباتات الزغبية في الثقافة²³.

يجب تكرار العديد من خطوات البروتوكول الحاسمة وتنفيذها بعناية. بعد ولادة المشيمة ، يجب زراعة الأنسجة في أسرع وقت ممكن. أثناء تحضير الزرع ، يعد تجنب المناطق ذات الاحتشاء المرئي أمرا بالغ الأهمية. من المهم التعامل بلطف مع النباتات باستخدام الملقط لمنع الضغط. يوصى بإبقاء الأنسجة مغطاة بالسائل طوال العملية وإجرائها بسرعة.

من المهم الاعتراف بأن هذه الدراسة غير قادرة على تحديد إجهاد القص الدقيق داخل نظام التدفق المقدم ، والذي يجب اعتباره قيدا في التحقيقات المستقبلية ^3,23. ومع ذلك ، من المهم إدراك أن سرعة التدفق الدقيقة وإجهاد القص لزغابات مشيمية معينة في الجسم الحي تتأثر بالعديد من المعلمات ، مثل الخصائص الهندسية للفضاء بين الزغابات ، وموقع الزغابات داخل هذا الفضاء ، وقربها وزاويتها من الشرايين الحلزونية الأم والأوردة الرحمية³،¹⁹،^23،32. يجب أن يؤخذ تعقيد البنية الهندسية للمشيمة ، والتي تختلف بين الأفراد ، في الاعتبار أيضا^23,32. توجد بالفعل نماذج رياضية تقدر تدفق الدم داخل الفضاء بين الزغابات³² والحسابات على إجهاد قص الجدار على الأرومة المخلوية^19,28. ومن المثير للاهتمام ، أن إحدى الدراسات تنبأت بأن إجهاد القص على الأرومة المخلوية يكون أقل في الثلث الثالث من الحمل مقارنة بالثلث الأول من الحمل²⁸ ، بينما أظهرت دراسة أخرى إجهاد قص الجدار غير المتجانس مكانيا على الأرومة المخلوية¹⁹. لا يزال تحديد سرعة التدفق الدقيقة وإجهاد القص لزغابات مشيمية معينة يمثل تحديا³،¹⁹،^23،32. تقدم هذه الحسابات تقديرا تقريبيا لنطاق إجهاد القص للتحقيقات المستقبلية ، ولكنها قد تتطلب تعديلات تشريحية مستمرة وتحسينا²³. علاوة على ذلك ، قد تطور الدراسات المستقبلية تقنيات جديدة ومحسنة لثقافة التدفق التي تأخذ في الاعتبار الهندسة المعقدة للفضاء بين الزغابات واستراتيجيات لزيادة عدد العينات لكل تجربة³. من المتوقع حدوث تقدم وتطوير مستمرين لنظام التدفق ، مما قد يؤدي إلى استخدام غرف تدفق بديلة (Brugger et al. ، بيانات غير منشورة ، 2023).

في الختام ، تضع هذه الدراسة أساسا قويا من خلال إظهار تقنية استزراع التدفق خارج الجسم الحي القابلة للتنفيذ بسهولة والتي تدعم السلامة الهيكلية للنباتات الزغبية المستزرعة. إنه يؤكد على أهمية التقنيات الديناميكية في دراسات البيولوجيا الوظيفية للمشيمة ، مما يمهد الطريق لمزيد من التقدم في أنظمة ثقافة التدفق وتوليد أفكار وفرضيات جديدة^3،23.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plates	NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	140675
Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	A21422	Diluted in PBS, 1:200
antibody diluent	Dako, Santa Clara, CA, USA	S3022
anti-β-actin (AC-15)	Abcam, Cambridge, UK	ab6276	Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000
Bioreactor TEB500	TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain		Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117
CD34 Class II (QBEnd-10)	Dako, Santa Clara, CA, USA	M7165	Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500
CPD 030 critically point dryer	Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein)		Critically point dryer
DAPI	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	D21490	Diluted in PBS, 1:1000
Ebers TEB505 Series Software	TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain		Series Software 1.4
Endothelial Cell Growth Medium MV	PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany;	C-22120	Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used
Excelsior AS Tissue Processor	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA
Exosome-depleted fetal bovine serum	Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	A2720803
Histolab Clear	Histolab, Askim, Sweden	14250-TY
Hydrogen Peroxide Block	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	TA125H202Q
Kaiser’s Glycerin Gelatine	Merck, Darmstadt, Germany	1092420100
Leica DM 6000 B microscope	Leica, Wetzlar, Germany		Equipped with an Olympus DP 72 Camera
Leica UC7 ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienna, Austria)
Metal plate with needles	In-house construction
Microtome	Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA
Microwave oven	Miele, Guetersloh, Germany
Olympus microscope  (BX63)	Olympus, Hamburg, Germany		Serial Number: 1A52421
PBS	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	10010015
Penicillin/Streptomycin	Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	2585627
Primary antibody enhancer	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	TL-125-PB
ProLong Gold Antifade Reagent	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	P36934
Pumping tube	Tygon, Bartelt, Graz, Austria	6.078 175	1.02 mm diameter
QV500 Flow chambers	Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK	QV500	Other chambers would work as well
SCD 500, sputter coater	Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein		Sputter coater
Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit	Abcam, Cambridge, UK	ab64252
Superfrost Plus slides	Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany	J1800AMNZ
Syringe Filter	Corning Incorporated, NY, USA	431219	0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle
TAAB epoxy resin	Agar Scientific, Stansted, Essex, UK	T001
UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	TL-125-HL
UltraVision Protein Block	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	TA125BPQ
Zeiss EM 900 transmission electron microscope	Zeiss, Oberkochen, Germany
Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope	Zeiss, Cambridge, UK		Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage