离体胎盘外植体流动培养 - 模拟子宫内的动态条件

摘要

这是在恒定流动条件下培养胎盘外植体的方案。这种方法通过复制动态生理环境来增强传统的静态绒毛培养系统。

摘要

现有的离体胎盘外植 体 培养模型主要基于使用孔板的静态培养系统。然而，这些模型不能充分反映 子宫内 的动态，胎盘由于血浆或血流而遇到持续的轻微剪切应力。为了解决这一限制，设计了一种流动培养系统，使离体胎盘外植 体 培养更接近母体内经历的 子宫内 流动条件。在这种方法中，胎盘外植体在五个相互连接的流动室中培养。此设置可保持生理氧浓度和一致的流速。收集的数据表明，在流动条件下，与传统的静态方法相比，组织形态的保存表现出显着的增强。这项创新技术引入了一种直接的离体胎盘外植 体 培养方法，提供了更忠实的 体内 动态环境。此外，本研究为研究胎儿-母体界面的功能动力学提供了新的可能性。通过采用可行的动态方法，有助于更深入地理解胎盘生物学，强调其与母胎健康的相关性。

引言

自 1960 年代以来，在孔板底部培养胎盘外植体已被用于研究胎儿-母体界面 ^1,2,3。这种方法是成熟且直接的，除了单细胞培养外，还可以将人体组织用于各种研究 ^2,3。随着时间的流逝，胎盘外植体培养物的实验设计在氧浓度方面进行了修改⁴ 并防止组织沉降在孔板的底部 2,5,6。然而，这种方法尚未适应子宫内的体内条件，特别是恒定流量^的存在3。

怀孕的成功取决于用母体血液充分和一致地灌注绒毛间隙，建立血液和血源性物质连续流入和流出的动态回路7,8,9,10,11,12。胎盘具有两种不同的血液供应系统，一种用于母体血液，一种用于胎儿血液，导致胎儿和母体系统双重灌注¹³。母体血液在孕早期结束时开始灌注胎盘的绒毛间隙，缓慢流过扩大的子宫螺旋动脉^10,11,14。因此，胎盘绒毛树沐浴在母体血液中，为胎儿输送营养和氧气。这种母体血液流经绒毛间隙，然后通过子宫胎盘静脉返回母体循环。在通过绒毛间隙的过程中，氧气和营养物质扩散和主动吸收到胎儿血液中会导致母体血液中的氧气和营养水平降低^12,15。然而，绒毛间隙的血液完全被新鲜的、富氧的血液所取代，大约每分钟两到三次，确保营养物质和气体的持续供应¹³。值得注意的是，胎盘屏障的最外层合体滋养层是直接暴露于母体血液的胎盘绒毛树的唯一成分15,16,17。因此，合体滋养层会受到来自流动的母体血液的持续温和剪切应力 ^3,14。

目前关于胎盘流动环境的科学知识和现代技术进步现在允许在流动条件下对胎盘外植体进行适应和生理近似的培养。此外，有证据表明剪切力会影响合体滋养层^18,19,20,21 的生物学功能。解释血流的一种众所周知的方法是胎盘双叶灌注系统²²。然而，这些实验需要大量的专业知识，有时间限制（仅进行几个小时），并且仅适用于妊娠晚期胎盘样本^3,23。相比之下，我们开发了一种简单且非侵入性的技术，用于在恒定流量设置下进行离体胎盘绒毛外植体培养，以适应孕早期和孕晚期胎盘组织³。在这种设置中，胎盘外植体在五个串联的流动室中培养。绒毛状外植体使用薄金属板上的针状立面固定在腔室的底部。随后将构建的流路转移到生物反应器中，在生物反应器中调节氧气浓度和流速³.流式培养结果表明，与通常使用的静态方法³ 相比，组织完整性得到更好的保留。此外，这种动态方法为组织外植体培养提供了新颖和适应性的实验设计，允许更密切地模拟自然环境的体外实验³.

研究方案

格拉茨医科大学伦理委员会批准了这项研究（31-019 ex 18/19 版本 1.2 和 29-319 ex 16/17）。已获得参与研究的所有受试者的知情同意。

1. 流动实验的准备工作

注意：实验在带有集成蠕动泵的生物反应器中进行（参见 材料表）。生物反应器内的湿度、温度和气体水平可以调节。

1. 打开生物反应器并根据生物反应器的手册为实验进行所有预先安排（例如，泵的校准、预热、气体条件和湿度）。在开始实验之前，所需的设置（温度、气体含量、湿度）应稳定几个小时或过夜。为此，请启动生物反应器和软件，然后单击菜单项“培养箱”下的 “更改设定点 ”。
2. 将PBS和所需培养基（补充有提供的补充剂hEGF-5，HC-500以及5%外泌体耗尽的胎牛血清，1%青霉素/链霉素）预热至37°C（见 材料表）。
   ​

2.胎盘样本夹层

1. 分娩后立即从胎盘中部区域切下 3 次 2 cm 3 胎盘样品，如 Kupper 等人 ³ 所述，简而言之，将样品保存在 PBS 中。丢弃绒毛膜板，母体蜕膜和标本上可见的梗死区域。
2. 将剩余的组织标本解剖成横截直径约为0.5厘米（湿重约7.5mg）的绒毛状外植体。将它们转移到装有新鲜PBS的培养皿中。
3. 用镊子在液体中轻轻摇晃外植体，在PBS中清洗外植体，以去除血液残留物。
   注意：用PBS在培养皿中解剖样品以预洗并防止它们变干，并使用灭菌/高压灭菌工具处理组织。

3.流动实验

1. 在无菌罩下，根据流动室的用户手册（参见 材料表），使用鲁尔锁将五个室串联到储液瓶上。
   注意： 使用前根据相应的手册对所有材料进行消毒和/或高压灭菌。使用储液瓶上的空气过滤器进行无菌气体交换。要打开和关闭腔室，请轻轻挤压腔室的凸耳。步骤 3.1.也可以更早地准备。
2. 将腔室倒置并通过取下底部打开它们。使用镊子将金属板转移到腔室顶部的中央，销钉朝上。
3. 用1mL预热培养基（37°C）填充腔室。然后再向储液器中加注 20 mL。该回路总共需要 25 mL，包括每个流室、试管和储液瓶中的体积。在流动下，填充室中培养基的最终体积为 2 mL。
4. 使用镊子，在腔室中金属板的针头之间转移一个接一个的绒毛外植体。让针头在胎盘绒毛之间滑动，以避免刺穿组织。将四个外植体转移到一个腔室中。小心地重新安装底部，关闭腔室。一个完整的回路总共包含 20 个外植体。腔室需要保持倒置位置。
   注意：用镊子轻轻抓住外植体;尽量不要挤压它们。确保腔室和电路完全密封，以防止泄漏。腔室总是倒置使用。每个腔室的外植体数量和腔室本身的数量是可变的。孕早期组织的程序与孕晚期组织的程序相似，但增加了少量：为了固定绒毛，在组织转移到金属板后，将针头稍微弯曲到外植体上（个人交流 Brugger 等人）。这样可以将脆弱的组织固定在金属板上，并防止样品滑落。
5. 将流动组件转移到生物反应器中。
6. 通过将泵管连接到泵，将流动回路连接到生物反应器内的蠕动泵。将其固定在第^{4 级（} 人们会听到它咔嗒四次）。
7. 如果需要静电控制，则还将孔板放入生物反应器中。
   注：对于静态培养，六孔板的五个孔每孔填充 4 mL 培养基，每孔填充 4 个绒毛外植体。填充的孔板也被放置在生物反应器中，并在与流动培养外植体相同的气氛中培养。Kupper等人³中描述了更多细节
8. 在菜单项“泵”下将泵模式设置为 手动 。然后将泵速设置为 1 mL/min，然后单击 “运行”开始将培养基泵入管道。当电路充满介质时，将腔室保持一定角度，使它们完全充满介质。
   注：有关胎盘绒毛流动和静态培养的实验设置，请参见 补充表 1 。流量和静态系统的规格见 附表2。
   注意： 在填充过程中小心倾斜腔室，以防止试样从针头上滑落。
9. 填充完成后，腔室保持倒置位置。确保腔室牢固直立，并关闭生物反应器的两个盖子。
   注：填充流槽中培养基的最终体积为 2 mL。实验设置以及实验中使用的流动室和孔板的规格在Kupper等人³中进行了描述
10. 将组织孵育所需时间。
    注意： 无需再次打开生物反应器盖即可在计算机上监控温度、气体水平和流速。
11. 在组织孵育所需时间后，通过单击菜单项“泵”下的 “中止 ”停止泵。打开生物反应器的两个盖子，然后一次打开一个流动室。使用镊子小心地从金属板上取出外植体。
12. 根据选定的下游分析处理组织和上清液。在这种情况下，进行了免疫组织化学染色和电子显微镜检查³.有关用于免疫组化和免疫荧光的抗体的详细信息，请参见 补充表3 。
    注意： 取出组织后，通过逆时针旋转泵将介质从回路中排出。
13. 根据制造商对流室和管道的说明拆卸和清洁流动回路。

讨论

本研究为胎盘外植体的流动培养技术引入了独特的视角，该技术旨在复制子宫^内环境的动态^3,23。研究结果表明，与传统的静态培养方法相比，在流动条件下培养的组织形态保存得更好³.值得注意的是，尽管静态和流动培养条件都不利于胎盘血管的灌注，但在静态培养中主要观察到绒毛基质内胎盘血管的破坏，而在^{流动培养中}，血管的完整性似乎在较长时间内得到更好的维持3。

对这一观察结果的一种可能的解释可能与合体滋养层的关键保护和内分泌作用有关，这一功能在文献 12,24,25,26 中得到了充分的记录。鉴于此，可以想象绒毛外层的整体完整性对维持下面的基质（包括血管）有显着贡献。因此，血管在流动条件下的持续细胞完整性可能归因于介质的连续流动。这种运动有助于外植体的被动运动，促进气体、营养物质和纳米颗粒（如细胞外囊泡）穿过胎盘屏障的交换。反过来，这可能会对血管形态的保存产生积极影响。此外，机械感觉现象在各种组织的组织形态发生中起作用^27,28。研究表明，机械敏感性在多个层面上影响细胞过程，触发一系列最终影响组织和器官功能的生化反应²⁹。值得注意的是，机械敏感蛋白在整个妊娠过程中由合体滋养层表达²⁸。此外，该研究表明，组织表面的微绒毛可能与这种情况有关²⁸。

另一个值得考虑的观点是线粒体在细胞对流动的反应中的潜在作用。例如，在内皮细胞中，线粒体作为细胞对环境刺激的反应的信号转导器³⁰。通过 TEM³ 在静态培养组织中观察到脂滴积累增加，与线粒体功能障碍引起的细胞凋亡诱导有关³¹。有必要进一步研究以揭示潜在的机制和关键因素，将它们与下游信号通路联系起来。这种探索可以增强我们对组织如何感知和反应剪切应力的理解，从而转化为培养中绒毛外植体的活力和完整性的提高²³。

必须重申并谨慎执行几个关键的协议步骤。胎盘娩出后，应尽快培养组织。在外植体准备过程中，避开有可见梗死的区域至关重要。用镊子轻轻处理外植体以防止挤压很重要。建议在整个手术过程中保持组织被液体覆盖并快速进行。

重要的是要承认，本研究无法指定所呈现的流动系统内的确切剪切应力，这应该被视为未来研究的局限性 ^3,23。然而，重要的是要认识到，体内特定胎盘绒毛的精确流速和剪切应力受到许多参数的影响，例如绒毛间空间的几何特征、绒毛在该空间中的位置以及它与母体螺旋动脉和子宫静脉的接近度和角度 3,19,23,32 .胎盘几何结构的复杂性因人而异，也必须考虑在内^23,32。估计绒毛间隙内血流的数学模型³²和合体滋养层^19,28的壁剪切应力计算已经存在。有趣的是，一项研究预测，与妊娠早期相比，妊娠晚期合体滋养层的剪切应力较低²⁸，而另一项研究则表明合胞滋养层¹⁹ 在空间上存在异质壁剪切应力。确定特定胎盘绒毛的精确流速和剪切应力仍然是一个挑战 3,19,23,32。这种计算为未来的研究提供了剪切应力范围的近似值，但它们可能需要持续的解剖调整和优化²³。此外，未来的研究可能会开发新的和改进的流通培养技术，以解释绒毛间空间的复杂几何形状和增加每个实验标本数量的策略³。预计流动系统将持续取得进展和发展，可能会采用替代流动室（Brugger 等人，未发表的数据，2023 年）。

总之，本研究通过展示一种易于实施的离体流培养技术奠定了坚实的基础，该技术维护了培养绒毛外植体的结构完整性。它强调了动态技术在胎盘功能生物学研究中的重要性，为流动培养系统的进一步发展以及新想法和假设的产生铺平了道路^3,23。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plates	NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	140675
Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	A21422	Diluted in PBS, 1:200
antibody diluent	Dako, Santa Clara, CA, USA	S3022
anti-β-actin (AC-15)	Abcam, Cambridge, UK	ab6276	Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000
Bioreactor TEB500	TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain		Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117
CD34 Class II (QBEnd-10)	Dako, Santa Clara, CA, USA	M7165	Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500
CPD 030 critically point dryer	Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein)		Critically point dryer
DAPI	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	D21490	Diluted in PBS, 1:1000
Ebers TEB505 Series Software	TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain		Series Software 1.4
Endothelial Cell Growth Medium MV	PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany;	C-22120	Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used
Excelsior AS Tissue Processor	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA
Exosome-depleted fetal bovine serum	Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	A2720803
Histolab Clear	Histolab, Askim, Sweden	14250-TY
Hydrogen Peroxide Block	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	TA125H202Q
Kaiser’s Glycerin Gelatine	Merck, Darmstadt, Germany	1092420100
Leica DM 6000 B microscope	Leica, Wetzlar, Germany		Equipped with an Olympus DP 72 Camera
Leica UC7 ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienna, Austria)
Metal plate with needles	In-house construction
Microtome	Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA
Microwave oven	Miele, Guetersloh, Germany
Olympus microscope  (BX63)	Olympus, Hamburg, Germany		Serial Number: 1A52421
PBS	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	10010015
Penicillin/Streptomycin	Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	2585627
Primary antibody enhancer	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	TL-125-PB
ProLong Gold Antifade Reagent	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	P36934
Pumping tube	Tygon, Bartelt, Graz, Austria	6.078 175	1.02 mm diameter
QV500 Flow chambers	Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK	QV500	Other chambers would work as well
SCD 500, sputter coater	Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein		Sputter coater
Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit	Abcam, Cambridge, UK	ab64252
Superfrost Plus slides	Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany	J1800AMNZ
Syringe Filter	Corning Incorporated, NY, USA	431219	0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle
TAAB epoxy resin	Agar Scientific, Stansted, Essex, UK	T001
UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	TL-125-HL
UltraVision Protein Block	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	TA125BPQ
Zeiss EM 900 transmission electron microscope	Zeiss, Oberkochen, Germany
Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope	Zeiss, Cambridge, UK		Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage