JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يعد نموذج زرع القصبة الهوائية داخل الرئة (IPTT) ذا قيمة لدراسة مرض مجرى الهواء المسد (OAD) بعد زرع الرئة. يقدم نظرة ثاقبة على السلوك المناعي والوعائي الخاص بالرئة في طمس مجرى الهواء بعد الخيفي مع قابلية عالية للاستنساخ. هنا ، نصف إجراء IPTT ونتائجه المتوقعة.

Abstract

يستخدم زرع القصبة الهوائية داخل الرئة (IPTT) كنموذج لمرض مجرى الهواء المسد (OAD) بعد زرع الرئة. تم الإبلاغ عن هذا النموذج في البداية من قبل فريقنا ، وقد اكتسب استخداما في دراسة OAD نظرا لقابليته العالية للتكاثر التقني وملاءمته للتحقيق في السلوكيات المناعية والتدخلات العلاجية.

في نموذج IPTT ، يتم إدخال طعم القصبة الهوائية للقوارض مباشرة في رئة المتلقي من خلال غشاء الجنب. يختلف هذا النموذج عن نموذج زرع القصبة الهوائية غير المتجانسة (HTT) ، حيث يتم زرع الطعوم في مواقع تحت الجلد أو تحت الجلد ، وعن نموذج زرع القصبة الهوائية التقويمية (OTT) حيث تحل القصبة الهوائية للمتبرع محل القصبة الهوائية للمتلقي.

يتطلب التنفيذ الناجح لنموذج IPTT مهارات تخدير وجراحة متقدمة. تشمل مهارات التخدير التنبيب الرغامي للمتلقي ، وتحديد معايير التهوية المناسبة ، ونزع الأنبوب في الوقت المناسب بعد الشفاء من التخدير. المهارات الجراحية ضرورية لوضع الكسب غير المشروع بدقة داخل الرئة ولضمان الإغلاق الفعال لغشاء الجنب الحشوي لمنع تسرب الهواء والنزيف. بشكل عام ، تستغرق عملية التعلم حوالي 2 أشهر.

على عكس نماذج HTT و OTT ، في نموذج IPTT ، يطور مجرى الهواء الخيفي طمس مجرى الهواء في البيئة المكروية للرئة ذات الصلة. يسمح هذا للباحثين بدراسة العمليات المناعية والأوعية الدموية الخاصة بالرئة التي تنطوي على طمس مجرى الهواء بعد زرع الرئة. علاوة على ذلك ، يعد هذا النموذج فريدا أيضا من حيث أنه يعرض الأعضاء اللمفاوية الثالثية (TLOs) ، والتي تظهر أيضا في الطعم الخيفي للرئة البشرية. تتكون TLOs من مجموعات الخلايا التائية والبائية وتتميز بوجود الأوردة البطانية العالية التي توجه تجنيد الخلايا المناعية. لذلك ، من المحتمل أن يلعبوا دورا حاسما في قبول الكسب غير المشروع ورفضه. نستنتج أن نموذج IPTT هو أداة مفيدة لدراسة المسارات المناعية داخل الرئة والبروليفية المشاركة في تطوير طمس مجرى الهواء في الطعم الخيفي لزراعة الرئة.

Introduction

تم تأسيس زراعة الرئة كعلاج فعال للمرضى الذين يعانون من أمراض الجهاز التنفسي في المرحلة النهائية. ومع ذلك ، فإن متوسط معدل البقاء على قيد الحياة لمتلقي زراعة الرئة البشرية هو حوالي 6 سنوات فقط ، مع تطور التهاب القصيبات المسد (OB) ، وهو نوع من مرض انسداد مجرى الهواء (OAD) ، كونه سببا رئيسيا للوفاة بعد السنة الأولى بعد الزرع1.

تم استخدام العديد من النماذج الحيوانية للتحقيق في الآلية الكامنة وراء OAD. أحد هذه النماذج هو نموذج زرع القصبة الهوائية غير المتجانسة (HTT)2. في هذا النموذج ، يتم زرع ترقيع القصبة الهوائية في الأنسجة تحت الجلد أو الثرب للمتلقي. يحدث فقدان الخلايا الظهارية الطعم الرغامي الناجم عن نقص التروية ، يليه تسلل الخلايا الليمفاوية التفاعلية وموت الخلايا المبرمج للخلايا الظهارية المانحة. تهاجر الخلايا الليفية والخلايا الليفية العضلية حول القصبة الهوائية ، مما ينتج عنه مصفوفة خارج الخلية. أخيرا ، يحدث طمس ليفي كامل لتجويف مجرى الهواء. نموذج HTT بسيط تقنيا ، ويوفر بيئة في الجسم الحي ، ويوفر قابلية عالية للتكرار.

نموذج آخر لدراسة OAD هو نموذج زرع القصبة الهوائية التقويمية للفئران (OTT) ، حيث يتم إدخال ترقيع القصبة الهوائية في القصبة الهوائية للمتلقي للحفاظ على التهوية الفسيولوجية3. في هذا النموذج ، يؤدي استنفاد الخلايا الظهارية المانحة الناجم عن نقص التروية إلى استبدالها بالخلايا الظهارية المتلقية داخل القصبة الهوائية ، مما يشكل مجرى هوائي غير مسدود مصحوبا بتليف معتدل. على الرغم من أن هذه النماذج قد ساهمت في فهم طمس مجرى الهواء بعد زرع الرئة ، إلا أن لها قيودا من حيث تلخيص البيئة المكروية لحمية الرئة.

قدمت مجموعتنا البحثية نموذج زرع القصبة الهوائية داخل الرئة (IPTT) للفئران ، حيث يتم زرع ترقيع القصبة الهوائية في رئة المتلقي4 (الشكل 1). يظهر نموذج IPTT طمسا ليفيا لتجويف مجرى الهواء يحدث داخل البيئة المكروية للرئة. علاوة على ذلك ، تم تطبيقه بنجاح على الفئران التي تمثل تحديا تقنيا أكثر من الفئران IPTT5،6،7،8،9،10. مكننا هذا التكيف لنموذج IPTT للفئران من التعمق في التفاصيل المعقدة للبيئة المناعية للرئة ل OAD بعد زرع الرئة باستخدام الفئران المعدلة وراثيا.

يمتلك نموذج IPTT بعض الميزات الفريدة. الأول هو تكوين الأوعية الدموية الجديدة ، والذي يتم تسهيله عن طريق الدورة الدموية الرئوية ويلعب دورا حاسما في طمس مجرى الهواء4،10. بالإضافة إلى ذلك ، يعرض نموذج IPTT مجاميع لمفاوية ، بعضها يحتوي على وريدات بطانية عالية تعبر عن عنوان العقدة المحيطية ، مما يشير إلى أنها أعضاء ليمفاوية ثالثية (TLOs)7,8. تشبه TLOs الغدد الليمفاوية وتتكون من الخلايا التائية والخلايا البائية ، وفي كثير من الأحيان ، مركز جرثومي مصحوب بخلايا متغصنة مسامية 11,12. تم الإبلاغ عن TLOs في العديد من الأمراض الالتهابية المزمنة ، بما في ذلك طمس مجرى الهواء ، مما يجعل نموذج IPTT مناسبا للتحقيق في دور TLOs في طمس مجرى الهواء7،8،11،12،13. تقدم هذه الورقة منهجية نموذج IPTT للفأر ، بهدف تعريف الباحثين بهذا النموذج وتسهيل إجراء مزيد من التحقيقات في طمس مجرى الهواء بعد زرع الرئة.

Protocol

تم التعامل مع جميع وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعها المجلس الكندي لرعاية في دليل رعاية واستخدام التجارب. تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل لجنة رعاية التابعة لمعهد أبحاث مستشفى تورنتو العام ، شبكة الصحة الجامعية.

1. جراحة المتبرع

ملاحظة: تستخدم الفئران BALB / c كمثال على المتبرعين للتجربة. يجب تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام تقنية معقمة.

  1. قبل الإجراء ، سجل وزن كل ماوس.
  2. القتل الرحيم للماوس باستخدام غرفة CO2 .
  3. بمجرد تأكيد الوفاة ، ضع الماوس في وضع ضعيف وقم بتأمين الأطراف بشريط.
  4. تحضير المنطقة الجراحية عن طريق تعقيمها بكحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر وعلى النحو الموصى به من قبل لجنة أخلاقيات المحلية ، قم بقص الفراء من موقع الشق.
  5. قم بعمل شق في خط الوسط على الجلد ، بدءا من منتصف البطن ويمتد إلى منطقة عنق الرحم الأمامية.
  6. الوصول إلى القصبة الهوائية عن طريق سحب منصات الدهون بعناية ، وتحريك عضلات الشريط بشكل جانبي ، وفصل القصبة الهوائية عن النسيج الضام المحيط. استخدم الملقط لخلق مسافة بين القصبة الهوائية والمريء.
  7. ارفع الخنجري واقطع الحجاب الحاجز.
  8. رفع القص ، وضمان مسار واضح من القص إلى منطقة الرقبة عن طريق إدخال مرقئ. المشبك القفص الصدري على كلا الجانبين وقطع من خلال القص ، وتمتد من خلال عضلات الرقبة.
  9. قم بإزالة الغدة الصعترية وأي دهون أو عضلات تعيق القصبة الهوائية لكشف تشعب القصبة الهوائية.
  10. قطع كل من الشعب الهوائية الرئيسية وفصل مجرى الهواء بعناية عن المريء.
  11. قطع الحنجرة وإزالته.
  12. رش القصبة الهوائية المقطعة بمحلول ملحي معقم أو محلول حفظ بشاش معقم منقوع في محلول ملحي معقم أو محلول حفظ وضعه على الجليد للحفاظ على صلاحيته.

2. جراحة المتلقي

ملاحظة: تستخدم الفئران C57BL / 6 كمثال على مستلمي التجربة.

  1. يجب تطبيق البوبرينورفين المستمر المفعول تحت الجلد بجرعة 1 ملغ/ كغ في صباح يوم الجراحة.
  2. حث التخدير في غرفة التعريفي باستخدام 5٪ إيزوفلوران.
  3. بمجرد تخدير الفأر برفق ، قم بحقن كوكتيل داخل الصفاق يتكون من (0.1 مجم / جم) زيلازين و (0.01 مجم / جم) كيتامين.
  4. أعد الماوس إلى غرفة الحث مع الحفاظ على 2-3٪ إيزوفلوران.
  5. حلق الفراء في موقع الجراحة. أيضا يجب تطبيق بوبيفاكايين ككتلة خطية تحت الجلد على طول موقع insicion المخطط بجرعة 7 ملغ/ كغ.
  6. تأكد من عدم وجود استجابة منعكسة لقرصة إصبع القدم قبل التنبيب الرغامي. تنبيب الفأر عن طريق الفم والقصبة الهوائية باستخدام قسطرة وريدية 20 جيجا وتوصيله بجهاز التنفس الصناعي بحجم المد والجزر 500 ميكرولتر ، ومعدل تنفس يبلغ 120 نبضة في الدقيقة ، وأكسجين 100٪ و 2٪ إيزوفلوران. استخدم حاملا مع مشبك مطبق على اللسان ، مع إمساك في وضع عمودي مع تمديد الرقبة ، لتسهيل هذا الإجراء.
  7. قم بتنشيط وسادة التدفئة ووضع الماوس في الوضع الجانبي الأيمن أعلى الوسادة ، مع إبعاد الرأس عن الجراح والذيل في مواجهة الجراح (الشكل 2). تأمين الأطراف مع الشريط. ضع مرهما بيطريا على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
  8. فرك المنطقة الجراحية مع 7.5 ٪ بوفيدون اليود ، وتعقيم مع 70 ٪ من الكحول الأيزوبروبيل ، وإعادة فرك مع 10 ٪ بوفيدون اليود. ضع ستائر جراحية معقمة لتغطية المنطقة الجراحية.
  9. قم بتحميل القصبة الهوائية المانحة في قسطرة وريدية 16 G خلال هذا الوقت (الشكل 3C ، D).
  10. استخدم المشرط لعمل شق في جلد المتلقي وكي العضلات والنسيج الضام.
  11. افتح المساحة الوربية الخامسة أو السادسة وأمسك القفص الصدري مفتوحا باستخدام مبصرين.
  12. تشريح الرباط الرئوي السفلي باستخدام مسحات القطن والمقص.
  13. محاكاة إنشاء مسار القصبة الهوائية المانحة (الشكل 3G ، H).
  14. قم بتأمين أنبوب تدفق جهاز التنفس الصناعي عن طريق إغلاقه جزئيا بمحبس ثلاثي الاتجاهات لتسهيل تضخم الرئة اليسرى.
  15. قم بإنشاء مسار عن طريق ثقب الرئة اليسرى بإبرة 20 جرام. التأكد من أن عمق البزل يعادل تقريبا طول الطعم الخيفي للقصبة الهوائية. حدد موقع البزل عند حافة الرئة (كما هو موضح في الشكل 3I) ، مع التأكد من أن المسار يسير بالتوازي مع سطح الطاولة (كما هو موضح بدائرة زرقاء في الشكل 3J).
    ملاحظة: ستؤدي زاوية الإدخال التصاعدية إلى اختراق الطبقة الجنبية ، بينما قد تؤدي الزاوية الأعمق إلى نزيف من الأوعية الرئيسية (كما هو موضح بالصلبان الحمراء في الشكل 3J).
  16. أدخل القسطرة الوريدية 16 G في الرئة اليسرى واخرج القصبة الهوائية المانحة إلى الرئة اليسرى. بعد إدخال الطعم الخيفي للقصبة الهوائية ، حرر المحبس ثلاثي الاتجاهات للسماح بتدفق الزفير دون عائق عبر أنبوب التدفق الخارجي.
  17. أغلق موقع الحقن الجنبي بمشبك (الشكل 3K ، L). ضع المشبك بدقة على موقع البزل ، مع محاذاة حافته لتتناسب مع محيط حافة الرئة (المشار إليها بالدائرة الزرقاء في الشكل 3L).
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي الموقع غير الصحيح لموقع القص إلى إحكام التسرب وتسرب الهواء بشكل غير فعال ، بينما قد يؤدي عمق المشبك غير الكافي إلى فصل المشبك بعد الجراحة (كما هو موضح في الصلبان الحمراء في الشكل 3L).
  18. املأ التجويف الصدري بمحلول ملحي وامتصاص المحلول الملحي بشاش.
  19. أعد نفخ الرئة اليسرى وأغلق الضلوع باستخدام تقنية خياطة الجري.
  20. أغلق العضلات والجلد بالغرز المتقطعة.
  21. تطبيق ميلوكسيكام مسكن تحت الجلد بجرعة 5 ملغ/ كغ في نهاية الجراحة.
  22. راقب الماوس المستلم حتى يستيقظ. ثم قم بإزالة أنبوب القصبة الهوائية ووضع الماوس المستلم في قفص.
    ملاحظة: يجب إيواء الفئران المتلقية بشكل فردي.
  23. يتم تطبيق ميلوكسيكام (5 ملغ/ كغ) مرة واحدة يوميا عن طريق الحقن تحت الجلد، ابتداء من 24 ساعة بعد الجراحة ويستمر لمدة 3 أيام بعد الجراحة.

3. جمع العينات من الفئران المتلقية

  1. حث التخدير في غرفة التعريفي باستخدام 5٪ إيزوفلوران.
  2. تأكد من عدم وجود استجابة منعكسة لقرصة إصبع القدم قبل التنبيب الرغامي. طريقة التنبيب وإعداد جهاز التنفس هي نفسها كما في جراحة المتلقي.
  3. ضع الماوس في وضع ضعيف وتأمين الأطراف.
  4. تحضير المنطقة الجراحية عن طريق تعقيمها بكحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪.
  5. قم بعمل شق في خط الوسط على الجلد ، بدءا من منتصف البطن ويمتد إلى منطقة عنق الرحم الأمامية.
  6. استنزاف الفأر عن طريق الوريد الأجوف السفلي باستخدام حقنة 1 مل متصلة بإبرة 25 جرام ، مما يؤدي إلى القتل الرحيم.
  7. افتح الصدر والوصول إلى القصبة الهوائية بنفس طريقة فأر المتبرع. اربط القصبة الهوائية حول أنبوب التنبيب بالحرير 7-0.
  8. قم بإزالة الغدة الصعترية والدهون والعضلات لكشف القلب.
  9. قطع الأذين الأيسر والأذين الأيمن والوريد الأجوف السفلي. قم بتغذية الرئتين ب 3 مل من المحلول الملحي المعقم عبر البطين الأيمن.
  10. للتحليل النسيجي ، قم بتضخيم الرئتين بنسبة 10٪ فورمالين عبر أنبوب التنبيب.
  11. قم بنزع أنبوب التهوية وربط القصبة الهوائية بالحرير 7-0.
  12. قسم الحنجرة والمريء. اسحبهم في اتجاه أدنى ، ثم استخرج كتلة القلب والرئة ، وضعها في 10٪ من الفورمالين.

النتائج

بناء على خبرتنا ، تتطلب الكفاءة في هذا النموذج عادة ما يقرب من 2 أشهر من التدريب. بمجرد تحقيق الكفاءة ، تتطلب إجراءات المتبرع عادة 15 دقيقة ، بينما تتطلب إجراءات المتلقي حوالي 30 دقيقة. معدل الوفيات المتوقع للمشغل المدرب هو 0٪.

في الشكل 4 أ، يظهر الطعم الخيفي الر?...

Discussion

يتضمن إجراء IPTT للفأر خطوات حاسمة. فيما يتعلق بالتخدير ، فإن الخطوة الأولى الحاسمة هي التنبيب الرغامي. من الضروري حمل الماوس على ارتفاع مناسب مع وضع أرجله على الطاولة لتصور الحبال الصوتية وتسهيل التنبيب الفوري. بالإضافة إلى ذلك ، من الضروري تعديل حجم الجهاز التنفسي الدقيق وضغط الزفير النه?...

Disclosures

ليس لدى مؤلفي هذه المخطوطة أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا جيروم فاليرو على تحرير هذه المخطوطة. تم إنشاء الشكل 1 والشكل 3I و J و L باستخدام BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BALB/cJThe Jackson Laboratory8-10 weeks 25-30 gMale, Donor
BD 1 mL SyringeBecton Dickinson309659
BD PrecisionGlide Needle Aiguile BD
PrecisionGlide		Becton Dickinson305122
Bovie Change-A-Tip Deluxe High-TempertureBovieDEL1
C57BL/6JThe Jackson Laboratory8-10 weeks 25-30 gMale, Recipient
Dumont #5/45 ForcepsF·S·T11251-35
Ethicon Ligaclip Multiple -Clip Appliers-EthiconLX107
Extra Fine Graefe ForcepsF·S·T11150-10
Glover Bulldog ClampIntegra320-127
Halsted-Mosquito HemostatsF·S·T13009-12
Horizon Titanium Ligating ClipsTeleflex001201
Leica M651 Manual surgical microscope for microsurgical proceduresLeica
Magnetix Fixator with spring lockCD+ LABSACD-001
Microsurgical ScissorJarit277-051
Mouse and Perinatal Rat Ventilator Model 687Harvard55-0001
Perfadex PlusXVIVO19850
Retractor Tip Blunt - 2.5 mmCD+ LABSACD-011
small animal tableCD+ LABSACD-003
Surgipro Blue 24" CV-1 Taper, Double ArmedCovidienVP702X
Systane ointmentAlconn1444062
System ElastomerCD+ LABSACD-007
Terumo Surflo IV Catheter, 20 G x 1 inTerumo Medical CorporationSR-OX2025CA
VMT table Topbenson91803300

References

  1. Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-fifth adult lung and heart-lung transplant report-2018; Focus theme: Multiorgan Transplantation. J Heart Lung Transplant. 37 (10), 1169-1183 (2018).
  2. Hertz, M. I., Jessurun, J., King, M. B., Savik, S. K., Murray, J. J. Reproduction of the obliterative bronchiolitis lesion after heterotopic transplantation of mouse airways. American J Pathol. 142 (6), 1945-1951 (1993).
  3. Ikonen, T. S., Brazelton, T. R., Berry, G. J., Shorthouse, R. S., Morris, R. E. Epithelial re-growth is associated with inhibition of obliterative airway disease in orthotopic tracheal allografts in non-immunosuppressed rats. Transplantation. 70 (6), 857 (2000).
  4. Dutly, A. E., et al. A novel model for post-transplant obliterative airway disease reveals angiogenesis from the pulmonary circulation. Am J Transplant. 5 (2), 248-254 (2005).
  5. Wagnetz, D., et al. Rejection of tracheal allograft by intrapulmonary lymphoid neogenesis in the absence of secondary lymphoid organs. Transplantation. 93 (12), 1212-1220 (2012).
  6. Hirayama, S., et al. Local long-term expression of lentivirally delivered IL-10 in the lung attenuates obliteration of intrapulmonary allograft airways. Hum Gene Ther. 22 (11), 1453-1460 (2011).
  7. Watanabe, T., et al. Recipient bone marrow-derived IL-17 receptor A-positive cells drive allograft fibrosis in a mouse intrapulmonary tracheal transplantation model. Transpl Immunol. 69, 101467 (2021).
  8. Matsuda, Y., et al. Spleen tyrosine kinase modulates fibrous airway obliteration and associated lymphoid neogenesis after transplantation. Am J Transplant. 16 (1), 342-352 (2016).
  9. Suzuki, Y., et al. Effect of CTLA4-Ig on Obliterative bronchiolitis in a mouse intrapulmonary tracheal transplantation model. Ann Thorac Cardiovasc Surg. 27 (6), 355-365 (2021).
  10. Watanabe, T., et al. A potent anti-angiogenic factor, vasohibin-1, ameliorates experimental bronchiolitis obliterans. Transplant Proc. 44 (4), 1155-1157 (2012).
  11. Aloisi, F., Pujol-Borrell, R. Lymphoid neogenesis in chronic inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 6 (3), 205-217 (2006).
  12. Cupedo, T., Jansen, W., Kraal, G., Mebius, R. E. Induction of secondary and tertiary lymphoid structures in the skin. Immunity. 21 (5), 655-667 (2004).
  13. Sato, M., et al. The role of intrapulmonary de novo lymphoid tissue in obliterative bronchiolitis after lung transplantation. J Immunol. 182 (11), 7307-7316 (2009).
  14. Okazaki, M., et al. Maintenance of airway epithelium in acutely rejection orthotopic vascularized mouse lung transplants. A J Resp Cell Mol Biol. 37 (6), 625-630 (2007).
  15. Yamada, Y., et al. Chronic airway fibrosis in orthotopic mouse lung transplantation models-an experimental reappraisal. Transplantation. 102 (2), e49-e58 (2018).
  16. Watanabe, T., et al. A B cell-dependent pathway drives chronic lung allograft rejection after ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Transplant. 19 (12), 3377-3389 (2019).
  17. Guo, Y., et al. Vendor-specific microbiome controls both acute and chronic murine lung allograft rejection by altering CD4+Foxp3+ regulatory T cell levels. Am J Transplant. 19 (10), 2705-2718 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

201 Tirthialy

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved