Trasplante de tráquea intrapulmonar murina: un modelo para investigar la enfermedad obliterante de las vías respiratorias después de un trasplante de pulmón

Resumen

El modelo de trasplante traqueal intrapulmonar murino (IPTT, por sus siglas en inglés) es valioso para estudiar la enfermedad obliterante de las vías respiratorias (OAD, por sus siglas en inglés) después del trasplante de pulmón. Ofrece información sobre el comportamiento inmunológico y angiogénico específico del pulmón en la obliteración de las vías respiratorias después del alotrasplante con alta reproducibilidad. A continuación, describimos el procedimiento IPTT y sus resultados esperados.

Resumen

El trasplante traqueal intrapulmonar murino (IPTT) se utiliza como modelo de enfermedad obliterante de las vías respiratorias (DAO) después del trasplante pulmonar. Inicialmente reportado por nuestro equipo, este modelo ha ganado uso en el estudio de la OAD debido a su alta reproducibilidad técnica e idoneidad para investigar comportamientos inmunológicos e intervenciones terapéuticas.

En el modelo IPTT, un injerto traqueal de roedor se inserta directamente en el pulmón del receptor a través de la pleura. Este modelo es distinto del modelo de trasplante traqueal heterotópico (HTT), en el que los injertos se trasplantan en sitios subcutáneos u omentales, y del modelo de trasplante traqueal ortotópico (OTT) en el que la tráquea del donante reemplaza la tráquea del receptor.

La implementación exitosa del modelo IPTT requiere habilidades anestésicas y quirúrgicas avanzadas. Las habilidades anestésicas incluyen la intubación endotraqueal del receptor, el establecimiento de parámetros ventilatorios apropiados y la extubación programada adecuadamente después de la recuperación de la anestesia. Las habilidades quirúrgicas son esenciales para la colocación precisa del injerto dentro del pulmón y para garantizar un sellado eficaz de la pleura visceral para evitar fugas de aire y hemorragias. En general, el proceso de aprendizaje dura aproximadamente 2 meses.

A diferencia de los modelos HTT y OTT, en el modelo IPTT, la vía aérea del aloinjerto desarrolla obliteración de la vía aérea en el microambiente pulmonar relevante. Esto permite a los investigadores estudiar los procesos inmunológicos y angiogénicos específicos de los pulmones implicados en la obliteración de las vías respiratorias después del trasplante de pulmón. Además, este modelo también es único en el sentido de que exhibe órganos linfoides terciarios (TLO), que también se observan en aloinjertos pulmonares humanos. Los TLO están compuestos por poblaciones de células T y B y se caracterizan por la presencia de vénulas endoteliales altas que dirigen el reclutamiento de células inmunitarias; por lo tanto, es probable que desempeñen un papel crucial en la aceptación y el rechazo del injerto. Concluimos que el modelo IPTT es una herramienta útil para el estudio de las vías inmunes y profibróticas intrapulmonares implicadas en el desarrollo de la obliteración de la vía aérea en el aloinjerto de trasplante pulmonar.

Introducción

El trasplante pulmonar se ha establecido como un tratamiento eficaz para pacientes con enfermedades respiratorias terminales. Sin embargo, la mediana de la tasa de supervivencia de los receptores de trasplante de pulmón humano es de solo aproximadamente 6 años, siendo el desarrollo de bronquiolitis obliterante (OB), un tipo de enfermedad obstructiva de las vías respiratorias (OAD), una de las principales causas de muerte después del primer año después del trasplante¹.

Se han utilizado varios modelos animales para investigar el mecanismo subyacente a la OAD. Uno de estos modelos es el modelo de trasplante traqueal heterotópico (HTT)². En este modelo, los injertos traqueales se implantan en el tejido subcutáneo u epiplón del receptor. Se produce la pérdida de células epiteliales del injerto traqueal inducida por isquemia, seguida de infiltración de linfocitos aloactivos y apoptosis de las células epiteliales del donante. Los fibroblastos y miofibroblastos migran alrededor de la tráquea, produciendo una matriz extracelular. Finalmente, se produce la obliteración fibrosa completa de la luz de las vías respiratorias. El modelo HTT es técnicamente simple, proporciona un entorno in vivo y ofrece una alta reproducibilidad.

Otro modelo para el estudio de la DAO es el modelo de trasplante traqueal ortotópico de rata (OTT), en el que los injertos traqueales se interponen en la tráquea del receptor para mantener la ventilación fisiológica³. En este modelo, la depleción inducida por isquemia de las células epiteliales del donante da lugar a su sustitución por células epiteliales receptoras dentro de la tráquea, formando una vía aérea sin obstrucciones acompañada de fibrosis moderada. Aunque estos modelos han contribuido a la comprensión de la obliteración de la vía aérea después del trasplante pulmonar, tienen limitaciones en cuanto a la recapitulación del microambiente del parénquima pulmonar.

Nuestro grupo de investigación introdujo el modelo de trasplante traqueal intrapulmonar en ratas (IPTT), en el que se implantan injertos traqueales en el pulmón receptor⁴ (Figura 1). El modelo IPTT exhibe obliteración fibrosa de la luz de las vías respiratorias que ocurre dentro del microambiente pulmonar. Además, se ha aplicado con éxito a ratones que son técnicamente más desafiantes que el IPTT^de ratas 5,6,7,8,9,10. Esta adaptación del modelo murino de IPTT nos permitió profundizar en los intrincados detalles del entorno inmunológico pulmonar de la OAD después del trasplante pulmonar con ratones transgénicos.

El modelo IPTT posee algunas características únicas. Una de ellas es la neoangiogénesis, que es facilitada por la circulación pulmonar y desempeña un papel crucial en la obliteración de la vía aérea ^4,10. Además, el modelo IPTT exhibe agregados linfoides, algunos de los cuales tienen vénulas endoteliales elevadas que expresan la dirección ganglionar periférica, lo que indica que son órganos linfoides terciarios (TLOs)^7,8. Los TLOs se asemejan a los ganglios linfáticos y consisten en linfocitos T, linfocitos B y, con frecuencia, un centro germinal acompañado de linfocitos dendríticos foliculares^11,12. Se han descrito casos de TLO en diversas enfermedades inflamatorias crónicas, incluida la obliteración de las vías respiratorias, lo que hace que el modelo IPTT sea adecuado para investigar el papel de los TLO en la obliteración de las vías respiratorias 7,8,11,12,13. En este artículo se presenta la metodología del modelo murino IPTT, con el objetivo de familiarizar a los investigadores con este modelo y facilitar futuras investigaciones sobre la obliteración de las vías respiratorias después de un trasplante pulmonar.

Protocolo

Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las directrices establecidas por el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación. El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Cuidado Animal del Instituto de Investigación del Hospital General de Toronto, Red Universitaria de Salud.

1. Cirugía de donante

NOTA: Los ratones BALB/c se utilizan como ejemplo de donantes para el experimento. Todos los procedimientos deben realizarse utilizando una técnica estéril.

1. Antes del procedimiento, registre el peso de cada ratón.
2. Sacrificar al ratón usando una cámara de CO₂ .
3. Una vez confirmada la muerte, coloque al ratón en posición supina y asegure las extremidades con cinta adhesiva.
4. Prepare el área quirúrgica esterilizándola con alcohol isopropílico al 70%.
   NOTA: Si es necesario y según lo recomendado por el comité local de ética animal, corte el pelaje del sitio de la incisión.
5. Realice una incisión en la línea media de la piel, comenzando desde la parte media del abdomen y extendiéndose hasta la región cervical anterior.
6. Acceda a la tráquea retrayendo con cuidado las almohadillas de grasa, moviendo lateralmente los músculos de la correa y separando la tráquea del tejido conectivo circundante. Use fórceps para crear espacio entre la tráquea y el esófago.
7. Levante el xifoides y corte el diafragma.
8. Eleve el esternón, asegurando un camino despejado desde el esternón hasta la región del cuello insertando un hemostático. Sujete la caja torácica por ambos lados y corte a través del esternón, extendiéndose hacia arriba a través de los músculos del cuello.
9. Retire el timo y cualquier grasa o músculo que obstruya la tráquea para exponer la bifurcación traqueal.
10. Corta ambos bronquios principales y separa con cuidado las vías respiratorias del esófago.
11. Corta la laringe y retírala.
12. Rocíe la tráquea disecada con solución salina estéril o solución de conservación con gasa estéril empapada en solución salina estéril o solución de conservación y colóquela sobre hielo para preservar su viabilidad.

2. Cirugía del receptor

NOTA: Los ratones C57BL/6 se utilizan como ejemplo de receptores para el experimento.

1. Administrar buprenorfina de liberación sostenida por vía subcutánea a una dosis de 1 mg/kg en la mañana del día de la cirugía.
2. Inducir la anestesia en una cámara de inducción con isoflurano al 5%.
3. Una vez que el ratón está ligeramente anestesiado, inyectar intraperitonealmente un cóctel que consiste en (0,1 mg/g) de xilacina y (0,01 mg/g) de ketamina.
4. Devolver el ratón a la cámara de inducción con el 2-3% de isoflurano mantenido.
5. Afeita el pelaje en el sitio quirúrgico. Además, administrar bupivacaína como un bloqueo de vía subcutánea a lo largo del sitio de insición planificado a una dosis de 7 mg/kg.
6. Confirmar la ausencia de respuesta refleja a un pinzamiento del dedo del pie antes de la intubación orotraqueal. Intubar al ratón por vía orotraqueal con un catéter intravenoso de 20 G y conectarlo a un ventilador con un volumen corriente de 500 μL, una frecuencia respiratoria de 120 lpm, oxígeno al 100% e isoflurano al 2%. Utilizar un soporte con una pinza aplicada a la lengua, sujetando al animal en posición vertical con el cuello extendido, para facilitar este procedimiento.
7. Active una almohadilla térmica y coloque el mouse en una posición lateral derecha en la parte superior de la almohadilla, con la cabeza alejada del cirujano y la cola hacia el cirujano (Figura 2). Asegure las extremidades con cinta adhesiva. Aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
8. Frote el área quirúrgica con yodo de povidona al 7,5 %, esterilícela con alcohol isopropílico al 70 % y vuelva a frotar con yodo de povidona al 10 %. Aplique paños quirúrgicos estériles para cubrir el área quirúrgica.
9. Cargue la tráquea del donante en un catéter intravenoso de 16 G durante este tiempo (Figura 3C, D).
10. Use un bisturí para hacer una incisión en la piel del receptor y cauterizar el músculo y el tejido conectivo.
11. Abra el quinto o sexto espacio intercostal y mantenga abierta la caja torácica con dos retractores.
12. Diseccionar el ligamento pulmonar inferior con bastoncillos de algodón y tijeras.
13. Simular la creación de la vía para la tráquea del donante (Figura 3G,H).
14. Asegure el tubo de salida del ventilador ocluyéndolo parcialmente con una llave de paso de tres vías para facilitar el inflado del pulmón izquierdo.
15. Cree una vía perforando el pulmón izquierdo con una aguja de 20 G. Asegurarse de que la profundidad de punción sea aproximadamente equivalente a la longitud del aloinjerto traqueal. Seleccione el sitio de punción en el borde del pulmón (como se indica en la Figura 3I), asegurándose de que la vía corra paralela al tablero de la mesa (como se marca con un círculo azul en la Figura 3J).
    NOTA: Un ángulo de inserción hacia arriba dará lugar a la penetración de la capa pleural, mientras que un ángulo más profundo puede provocar sangrado de los vasos principales (como se indica con cruces rojas en la Figura 3J).
16. Inserte el catéter intravenoso de 16 G en el pulmón izquierdo y extruya la tráquea del donante en el pulmón izquierdo. Después de la inserción del aloinjerto traqueal, suelte la llave de paso de tres vías para permitir un flujo espiratorio sin obstrucciones a través del tubo de salida.
17. Cierre el sitio de inyección pleural con un clip (Figura 3K, L). Coloque el clip con precisión en el sitio de punción, con su borde alineado para que coincida con el contorno del borde del pulmón (indicado por el círculo azul en la Figura 3L).
    NOTA: Una ubicación incorrecta para el sitio de recorte puede resultar en un sellado ineficaz y fugas de aire, mientras que una profundidad de recorte insuficiente puede hacer que el recorte se desprenda después de la cirugía (como se muestra en las cruces rojas en la Figura 3L).
18. Llene la cavidad torácica con solución salina y absorba la solución salina con una gasa.
19. Vuelva a inflar el pulmón izquierdo y cierre las costillas con una técnica de sutura continua.
20. Cierre el músculo y la piel con suturas interrumpidas.
21. Administrar meloxicam analgésico por vía subcutánea a una dosis de 5 mg/kg al final de la cirugía.
22. Observe al ratón receptor hasta que esté despierto. Luego, retire el tubo traqueal y coloque al ratón receptor en una jaula.
    NOTA: Los ratones receptores deben alojarse individualmente.
23. Administrar meloxicam (5 mg/kg) una vez al día mediante inyección subcutánea, comenzando 24 h después de la cirugía y continuar durante 3 días postoperatorios.

3. Recogida de muestras de ratones receptores

1. Inducir la anestesia en una cámara de inducción con isoflurano al 5%.
2. Confirmar la ausencia de respuesta refleja al pinzamiento del dedo del pie antes de la intubación orotraqueal. El método de intubación y la configuración del respirador son los mismos que en la cirugía del receptor.
3. Coloque el ratón en posición supina y asegure las extremidades.
4. Prepare el área quirúrgica esterilizándola con alcohol isopropílico al 70%.
5. Realice una incisión en la línea media de la piel, comenzando desde la parte media del abdomen y extendiéndose hasta la región cervical anterior.
6. Desangrar al ratón a través de la vena cava inferior utilizando una jeringa de 1 ml conectada a una aguja de 25 G, lo que resulta en la eutanasia.
7. Abra el cofre y acceda a la tráquea de la misma manera que un ratón donante. Ata la tráquea alrededor del tubo de intubación con seda 7-0.
8. Extirpar el timo, la grasa y los músculos para exponer el corazón.
9. Corta la aurícula izquierda, la aurícula derecha y la vena cava inferior. Perfundir los pulmones con 3 ml de solución salina estéril a través del ventrículo derecho.
10. Para el análisis histológico, infle los pulmones con formalina al 10% a través de un tubo de intubación.
11. Extubar el tubo de ventilación y atar la tráquea con seda 7-0.
12. Divide la laringe y el esófago. Tire de ellos en una dirección inferior y luego extraiga el bloqueo cardíaco y pulmonar, colocándolo en formol al 10%.

Resultados

Según nuestra experiencia, el dominio de este modelo suele requerir aproximadamente 2 meses de formación. Una vez que se logra la competencia, los procedimientos de donación generalmente requieren 15 minutos, mientras que los procedimientos de receptor requieren aproximadamente 30 minutos. La tasa de mortalidad esperada para un operador capacitado es del 0%.

En la Figura 4A, un aloinjerto traqueal presenta una obstrucción completa con el tejido fibroblástico ...

Discusión

El procedimiento de IPTT murino incluye pasos críticos. Con respecto a la anestesia, el primer paso crucial es la intubación endotraqueal. Es fundamental sujetar al ratón a una altura adecuada con las patas sobre la mesa para visualizar las cuerdas vocales y facilitar la intubación inmediata. Además, es necesario un ajuste cuidadoso del volumen respiratorio y de la presión positiva al final de la espiración (PEEP). Normalmente, un volumen respiratorio de 500 μL y una PEEP de 2 cmH₂O son suficientes par...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/cJ	The Jackson Laboratory	8-10 weeks 25-30 g	Male, Donor
BD 1 mL Syringe	Becton Dickinson	309659
BD PrecisionGlide Needle Aiguile BD PrecisionGlide	Becton Dickinson	305122
Bovie Change-A-Tip Deluxe High-Temperture	Bovie	DEL1
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	8-10 weeks 25-30 g	Male, Recipient
Dumont #5/45 Forceps	F·S·T	11251-35
Ethicon Ligaclip Multiple -Clip Appliers-	Ethicon	LX107
Extra Fine Graefe Forceps	F·S·T	11150-10
Glover Bulldog Clamp	Integra	320-127
Halsted-Mosquito Hemostats	F·S·T	13009-12
Horizon Titanium Ligating Clips	Teleflex	001201
Leica M651 Manual surgical microscope for microsurgical procedures	Leica
Magnetix Fixator with spring lock	CD+ LABS	ACD-001
Microsurgical Scissor	Jarit	277-051
Mouse and Perinatal Rat Ventilator Model 687	Harvard	55-0001
Perfadex Plus	XVIVO	19850
Retractor Tip Blunt - 2.5 mm	CD+ LABS	ACD-011
small animal table	CD+ LABS	ACD-003
Surgipro Blue 24" CV-1 Taper, Double Armed	Covidien	VP702X
Systane ointment	Alconn	1444062
System Elastomer	CD+ LABS	ACD-007
Terumo Surflo IV Catheter, 20 G x 1 in	Terumo Medical Corporation	SR-OX2025CA
VMT table Top	benson	91803300