Мышиная внутрилегочная трансплантация трахеи: модель для исследования облитерирующего заболевания дыхательных путей после трансплантации легких

Резюме

Мышиная модель внутрилегочной трансплантации трахеи (IPTT) ценна для изучения облитерирующей болезни дыхательных путей (ОАД) после трансплантации легких. Он дает представление о легоспецифическом иммунологическом и ангиогенной поведении при облитерации дыхательных путей после аллотрансплантации с высокой воспроизводимостью. В этой статье мы опишем процедуру IPTT и ее ожидаемые результаты.

Аннотация

Мышиная внутрилегочная трансплантация трахеи (IPTT) используется в качестве модели облитерирующей болезни дыхательных путей (ОАД) после трансплантации легких. Эта модель, о которой первоначально сообщила наша команда, получила широкое распространение в изучении ОАД благодаря своей высокой технической воспроизводимости и пригодности для исследования иммунологического поведения и терапевтических вмешательств.

В модели IPTT трахейный трансплантат грызуна вводится непосредственно в легкое реципиента через плевру. Эта модель отличается от модели гетеротопической трансплантации трахеи (HTT), в которой трансплантаты трансплантаты трансплантируются в подкожные или сальниковые участки, и от модели ортотопической трансплантации трахеи (OTT), в которой донорская трахея заменяет трахею реципиента.

Успешная реализация модели IPTT требует продвинутых анестезиологических и хирургических навыков. Навыки анестезиолога включают эндотрахеальную интубацию реципиента, настройку соответствующих параметров вентиляции легких и адекватное время экстубации после восстановления после анестезии. Хирургические навыки необходимы для точного размещения трансплантата в легком и для обеспечения эффективной герметизации висцеральной плевры для предотвращения утечки воздуха и кровотечения. В целом, процесс обучения занимает примерно 2 месяца.

В отличие от моделей HTT и OTT, в модели IPTT в дыхательных путях аллотрансплантата развивается облитерация дыхательных путей в соответствующем микроокружении легких. Это позволяет изучать легоспецифические иммунологические и ангиогенные процессы, участвующие в облитерации дыхательных путей после трансплантации легких. Кроме того, эта модель уникальна еще и тем, что в ней присутствуют третичные лимфоидные органы (TLO), которые также наблюдаются в аллотрансплантатах легких человека. ТЛО состоят из популяций Т- и В-клеток и характеризуются наличием высоких эндотелиальных венул, которые направляют рекрутирование иммунных клеток; Следовательно, они, вероятно, будут играть решающую роль в принятии и отторжении трансплантата. Сделан вывод о том, что модель IPTT является полезным инструментом для изучения внутрилегочных иммунных и профибротических путей, участвующих в развитии облитерации дыхательных путей в аллотрансплантате легкого.

Введение

Трансплантация легких зарекомендовала себя как эффективный метод лечения пациентов с терминальной стадией респираторных заболеваний. Тем не менее, средняя выживаемость реципиентов трансплантата легких человека составляет всего около 6 лет, при этом развитие облитерирующего бронхиолита (ОБВ), типа обструктивной болезни дыхательных путей (ОАД), является основной причиной смерти после первого года после^{трансплантации1}.

Для исследования механизма, лежащего в основе ОАД, было использовано несколько моделей на животных. Одной из таких моделей является гетеротопическая трансплантация трахеи (HTT) модель². В этой модели трахеальные трансплантаты имплантируются в подкожную клетчатку или сальник реципиента. Происходит индуцированная ишемией потеря эпителиальных клеток трахеального трансплантата с последующей аллореактивной инфильтрацией лимфоцитов и апоптозом донорских эпителиальных клеток. Фибробласты и миофибробласты мигрируют вокруг трахеи, образуя внеклеточный матрикс. Наконец, происходит полная фиброзная облитерация просвета дыхательных путей. Модель HTT технически проста, обеспечивает среду in vivo и обеспечивает высокую воспроизводимость.

Другой моделью для изучения ОАД является модель ортотопической трансплантации трахеи крысы (ОТТ), в которой трахеальные трансплантаты вводятся в трахею реципиента для поддержания физиологической вентиляции³. В этой модели индуцированное ишемией истощение донорских эпителиальных клеток приводит к их замещению эпителиальными клетками реципиента в трахее, образуя необструкцию дыхательных путей, сопровождающуюся умеренным фиброзом. Несмотря на то, что эти модели внесли свой вклад в понимание облитерации дыхательных путей после трансплантации легких, они имеют ограничения с точки зрения рекапитуляции микроокружения легочной паренхимы.

Наша исследовательская группа представила модель внутрилегочной трансплантации трахеи крысы (IPTT), при которой трахейные трансплантаты имплантируются в легкое реципиента⁴ (рис. 1). Модель IPTT демонстрирует фиброзную облитерацию просвета дыхательных путей, происходящую в микроокружении легких. Кроме того, он был успешно применен к мышам, которые технически более сложны, чем крысы IPTT 5,6,7,8,9,10. Эта адаптация мышиной модели IPTT позволила нам глубже углубиться в сложные детали иммунологической среды легких ОАД после трансплантации легких с использованием трансгенных мышей.

Модель IPTT обладает некоторыми уникальными особенностями. Одним из них является неоангиогенез, который облегчается легочным кровообращением и играет решающую роль в облитерации дыхательных путей ^4,10. Кроме того, в модели IPTT выявлены лимфоидные агрегаты, некоторые из которых имеют высокие эндотелиальные венулы, экспрессирующие адрес периферических узлов, что указывает на то, что они являются третичными лимфоидными органами (TLO)^7,8. ТЛО напоминают лимфатические узлы и состоят из Т-клеток, В-клеток и, зачастую, зародышевого центра, сопровождаемого фолликулярными дендритными клетками^11,12. ТЛО были зарегистрированы при различных хронических воспалительных заболеваниях, включая облитерацию дыхательных путей, что делает модель IPTT подходящей для изучения роли ТЛО в облитерации дыхательных путей 7,8,11,12,13. В данной статье представлена методология мышиной модели IPTT с целью ознакомления исследователей с этой моделью и содействия дальнейшим исследованиям облитерации дыхательных путей после трансплантации легких.

протокол

Все животные проходили лечение в соответствии с рекомендациями, изложенными Канадским советом по уходу за животными в Руководстве по уходу и использованию экспериментальных животных. Протокол эксперимента был одобрен Комитетом по уходу за животными Научно-исследовательского института больницы общего профиля Торонто, Университетской сети здравоохранения.

1. Донорская хирургия

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера доноров для эксперимента используются мыши BALB/c. Все процедуры должны проводиться с использованием стерильной техники.

1. Перед процедурой запишите вес каждой мыши.
2. Усыпите мышь с помощью камеры CO₂ .
3. Как только смерть будет подтверждена, поместите мышь в положение лежа на спине и зафиксируйте конечности скотчем.
4. Подготовьте операционную область, стерилизуя ее 70% изопропиловым спиртом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости и в соответствии с рекомендациями местного комитета по этике животных обрежьте шерсть в месте разреза.
5. Сделайте разрез по средней линии кожи, начиная от середины живота и заканчивая передней шейной областью.
6. Получите доступ к трахее, осторожно втягивая жировые пакеты, перемещая мышцы ремня в боковые стороны и отделяя трахею от окружающей соединительной ткани. Используйте щипцы, чтобы создать пространство между трахеей и пищеводом.
7. Приподнимите мечевидный узел и обрежьте диафрагму.
8. Приподнимите грудину, обеспечив свободный путь от грудины к области шеи, введя гемостат. Зажмите грудную клетку с обеих сторон и разрежьте грудину, проходя вверх через мышцы шеи.
9. Удалите тимус и любой жир или мышцу, препятствующие трахее, чтобы обнажить бифуркацию трахеи.
10. Разрежьте оба главных бронха и аккуратно отделите дыхательные пути от пищевода.
11. Разрежьте гортань и удалите ее.
12. Опрыскать рассеченную трахею стерильным физиологическим раствором или консервационным раствором стерильной марлей, смоченной в стерильном физиологическом растворе или консервационном растворе, и поместить на лед для сохранения жизнеспособности.

2. Хирургическое вмешательство реципиента

ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши C57BL/6 используются в качестве реципиентов для эксперимента.

1. Вводят бупренорфин с пролонгированным высвобождением подкожно в дозе 1 мг/кг утром в день операции.
2. Индуцируют анестезию в индукционной камере с использованием 5% изофлурана.
3. После того, как мышь слегка обезболивают, внутрибрюшинно вводят коктейль, состоящий из (0,1 мг/г) ксилазина и (0,01 мг/г) кетамина.
4. Верните мышь в индукционную камеру с сохранением 2-3% изофлурана.
5. Сбрить шерсть в месте операции. Также вводят бупивакаин в виде капельной блокады подкожно вдоль планируемого места введения в дозе 7 мг/кг.
6. Подтвердить отсутствие рефлекторной реакции на защемление пальца ноги перед оротрахеальной интубацией. Интубируйте мышь оротрахеально с помощью внутривенного катетера 20 G и подключите его к аппарату искусственной вентиляции легких с дыхательным объемом 500 мкл, частотой дыхания 120 ударов в минуту, 100% кислородом и 2% изофлураном. Для облегчения этой процедуры используйте подставку с зажимом, прикрепленным к языку, удерживая животное в вертикальном положении с вытянутой шеей.
7. Активируйте грелку и расположите мышь в правом боковом положении поверх коврика так, чтобы голова была отвернута от хирурга, а хвост обращен к нему (рисунок 2). Закрепите конечности скотчем. Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
8. Протрите операционную область 7,5% повидон-йодом, простерилизуйте 70% изопропиловым спиртом и повторно протрите 10% повидон-йодом. Наложите стерильные хирургические простыни, чтобы закрыть операционную область.
9. В течение этого времени загружайте донорскую трахею во внутривенный катетер 16 G (рис. 3C, D).
10. С помощью скальпеля сделайте надрез на коже реципиента и прижгите мышцу и соединительную ткань.
11. Откройте пятое или шестое межреберье и удерживайте грудную клетку открытой с помощью двух ретракторов.
12. Рассекают нижнюю легочную связку с помощью ватных палочек и ножниц.
13. Смоделируйте создание пути для донорской трахеи (рис. 3G, H).
14. Закрепите трубку выхода аппарата ИВЛ, частично закрыв ее трехходовым запорным краном, чтобы облегчить надувание левого легкого.
15. Создайте путь, проколов левое легкое иглой 20 G. Обеспечение того, чтобы глубина прокола была примерно равна длине аллотрансплантата трахеи. Выберите место прокола на краю легкого (как показано на рисунке 3I), убедившись, что путь проходит параллельно столешнице (как отмечено синим кружком на рисунке 3J).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Угол введения вверх приведет к проникновению в плевральный слой, в то время как более глубокий угол может привести к кровотечению из крупных сосудов (как отмечено красными крестами на рисунке 3J).
16. Введите внутривенный катетер 16 G в левое легкое и выдавите донорскую трахею в левое легкое. После введения аллотрансплантата трахеи отпустите трехходовой запорный кран, чтобы обеспечить беспрепятственный поток выдоха через дренажную трубку.
17. Закройте место плевральной инъекции зажимом (рис. 3K,L). Расположите зажим точно в месте прокола, выровняв его край в соответствии с контуром края легкого (обозначен синим кружком на рисунке 3L).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неправильное расположение места клипсации может привести к неэффективной герметизации и утечке воздуха, в то время как недостаточная глубина клипсы может привести к отсоединению клипсы после операции (как показано красными крестами на рисунке 3L).
18. Залейте грудную полость физиологическим раствором и рассосьте физраствор с помощью марли.
19. Надуйте левое легкое и закройте ребра с помощью техники наложения швов.
20. Закройте мышцы и кожу прерывистыми швами.
21. В конце операции вводят мелоксикам анальгетик подкожно в дозе 5 мг/кг.
22. Наблюдайте за мышью-реципиентом, пока она не проснется. Затем извлеките трахеальную трубку и поместите мышь-реципиента в клетку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши-реципиенты должны содержаться индивидуально.
23. Мелоксикам (5 мг/кг) назначают один раз в сутки через подкожную инъекцию, начиная через 24 ч после операции и продолжая в течение 3 дней после операции.

3. Забор образцов у мышей-реципиентов

1. Индуцируют анестезию в индукционной камере с использованием 5% изофлурана.
2. Подтвердить отсутствие рефлекторной реакции на защемление пальца ноги перед оротрахеальной интубацией. Метод интубации и настройка респиратора такие же, как и при хирургии реципиента.
3. Расположите мышь в положении лежа на спине и закрепите конечности.
4. Подготовьте операционную область, стерилизуя ее 70% изопропиловым спиртом.
5. Сделайте разрез по средней линии кожи, начиная от середины живота и заканчивая передней шейной областью.
6. Обескровливают мышь через нижнюю полую вену с помощью шприца объемом 1 мл, соединенного с иглой 25 G, что приводит к эвтаназии.
7. Откройте грудную клетку и получите доступ к трахее так же, как и донорская мышь. Обвяжите трахею вокруг интубационной трубки шелком 7-0.
8. Удалите тимус, жир и мышцы, чтобы обнажить сердце.
9. Разрезают левое предсердие, правое предсердие и нижнюю полую вену. Перфузии легких 3 мл стерильного физиологического раствора через правый желудочек.
10. Для гистологического анализа надуйте легкие 10% формалином через интубационную трубку.
11. Экстубируйте вентиляционную трубку и перевяжите трахею шелком 7-0.
12. Разделите гортань и пищевод. Потяните их в нижнем направлении, а затем извлеките блок сердца и легких, поместив его в 10% формалин.

Результаты

Исходя из нашего опыта, для владения этой моделью обычно требуется около 2 месяцев обучения. После достижения мастерства донорские процедуры обычно занимают 15 минут, в то время как процедуры реципиента требуют около 30 минут. Ожидаемый уровень смертности для обученного оператора состав...

Обсуждение

Процедура IPTT на мышах включает в себя важнейшие этапы. Что касается анестезии, то первым важным этапом является эндотрахеальная интубация. Важно держать мышь на соответствующей высоте, положив ноги на стол, чтобы визуализировать голосовые связки и облегчить немедленную интубацию. Кро?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/cJ	The Jackson Laboratory	8-10 weeks 25-30 g	Male, Donor
BD 1 mL Syringe	Becton Dickinson	309659
BD PrecisionGlide Needle Aiguile BD PrecisionGlide	Becton Dickinson	305122
Bovie Change-A-Tip Deluxe High-Temperture	Bovie	DEL1
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	8-10 weeks 25-30 g	Male, Recipient
Dumont #5/45 Forceps	F·S·T	11251-35
Ethicon Ligaclip Multiple -Clip Appliers-	Ethicon	LX107
Extra Fine Graefe Forceps	F·S·T	11150-10
Glover Bulldog Clamp	Integra	320-127
Halsted-Mosquito Hemostats	F·S·T	13009-12
Horizon Titanium Ligating Clips	Teleflex	001201
Leica M651 Manual surgical microscope for microsurgical procedures	Leica
Magnetix Fixator with spring lock	CD+ LABS	ACD-001
Microsurgical Scissor	Jarit	277-051
Mouse and Perinatal Rat Ventilator Model 687	Harvard	55-0001
Perfadex Plus	XVIVO	19850
Retractor Tip Blunt - 2.5 mm	CD+ LABS	ACD-011
small animal table	CD+ LABS	ACD-003
Surgipro Blue 24" CV-1 Taper, Double Armed	Covidien	VP702X
Systane ointment	Alconn	1444062
System Elastomer	CD+ LABS	ACD-007
Terumo Surflo IV Catheter, 20 G x 1 in	Terumo Medical Corporation	SR-OX2025CA
VMT table Top	benson	91803300