JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الحويصلات خارج الخلية تحمل وعدا هائلا للتطبيقات الطبية الحيوية ، لكن طرق العزل الحالية تستغرق وقتا طويلا وغير عملية للاستخدام السريري. في هذه الدراسة ، نقدم جهاز الموائع الدقيقة الذي يتيح العزل المباشر للحويصلات خارج الخلية من كميات كبيرة من السوائل الحيوية بطريقة مستمرة مع الحد الأدنى من الخطوات.

Abstract

الحويصلات خارج الخلية (EVs) تحمل إمكانات هائلة لمختلف التطبيقات الطبية الحيوية ، بما في ذلك التشخيص وتوصيل الأدوية والطب التجديدي. ومع ذلك ، فإن المنهجيات الحالية لعزل المركبات الكهربائية تمثل تحديات كبيرة ، مثل التعقيد واستهلاك الوقت والحاجة إلى معدات ضخمة ، مما يعيق ترجمتها السريرية. لمعالجة هذه القيود ، كنا نهدف إلى تطوير نظام الموائع الدقيقة المبتكر على أساس ثيول إثيولين أوليفين كوبوليمر حلقي خارج القياس المتكافئ (COC-OSTE) للعزل الفعال للمركبات الكهربائية من العينات ذات الحجم الكبير بطريقة مستمرة. من خلال استخدام الفصل القائم على الحجم والطفو ، حققت التكنولوجيا المستخدمة في هذه الدراسة توزيعا أضيق بكثير للحجم مقارنة بالأساليب الحالية من عينات وسائط البول والخلايا ، مما يتيح استهداف أجزاء محددة من حجم EV في التطبيقات المستقبلية. يوفر تصميم جهاز الموائع الدقيقة COC-OSTE المبتكر الخاص بنا ، والذي يستخدم تقنية تجزئة تدفق مجال التدفق غير المتماثل المتشعبة ، نهجا مباشرا ومستمرا لعزل EV للعينات ذات الحجم الكبير. علاوة على ذلك ، فإن إمكانية التصنيع الشامل لجهاز الموائع الدقيقة هذا توفر قابلية التوسع والاتساق ، مما يجعل من الممكن دمج عزل EV في التشخيص السريري الروتيني والعمليات الصناعية ، حيث يكون الاتساق العالي والإنتاجية من المتطلبات الأساسية.

Introduction

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جسيمات مرتبطة بغشاء مشتقة من الخلايا تتكون من نوعين رئيسيين: exosomes (30-200 نانومتر) والحويصلات الدقيقة (200-1000 نانومتر)1. تتشكل الإكسوسومات من خلال التبرعم الداخلي للغشاء الإندوسومي داخل جسم متعدد الحويصلات (MVB) ، وتطلق حويصلات داخل اللمعة (ILVs) في الفضاء خارج الخلية عند الاندماج مع غشاء البلازما1. في المقابل ، يتم إنشاء الحويصلات الدقيقة عن طريق التبرعم الخارجي والانشطار في غشاء الخلية2. تلعب المركبات الكهربائية دورا مهما في التواصل بين الخلايا عن طريق نقل البروتينات والأحماض النووية والدهون والمستقلبات ، مما يعكس الحالة الفسيولوجية للخلية ، بما في ذلك النمو ، وتكوين الأوعية الدموية ، وورم خبيث ، والانتشار ، ومقاومة العلاج3. ونتيجة لذلك ، فقد برزت كمؤشرات حيوية واعدة وأهداف علاجية للأمراض ، بما في ذلك السرطان ، مما يسلط الضوء على إمكاناتها في أنظمة التشخيص وتوصيل الأدوية4.

للاستفادة الكاملة من المركبات الكهربائية في تشخيص الأمراض وعلاجاتها ، يعد العزل الفعال عن السوائل الحيوية المختلفة أمرا بالغ الأهمية5. تشمل الطرق الشائعة الطرد المركزي الفائق (UC) ، والطرد المركزي المتدرج الكثافة ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، والترشيح ، والعزل المناعي6. UC هي تقنية مستخدمة على نطاق واسع ولكنها قد تنتج جزيئات ذات كثافة مماثلة ليست EVs ويمكن أن تولد مجاميع EV7. اكتسب SEC شعبية بسبب قدرته على توفير عينات أعلى نقاء عن طريق استبعاد الجسيمات على أساس الحجم بدلا من الكثافة8. ومع ذلك ، فإن الاختيار الدقيق لحجم المسام المناسب لعمود SEC وتحسين ظروف الكروماتوغرافيا ضروريان لتقليل العزلة المشتركة للجسيمات غير المرغوب فيها مثل الكيلوميكرون والبروتينات الدهنية منخفضة الكثافة8. على الرغم من فعاليتها ، فإن كلتا الطريقتين تستغرق وقتا طويلا وتمثل تحديا للأتمتة ، خاصة بالنسبة للعينات ذات الحجم الأكبر مثل وسائط الخلية أو البول ، مما يحد من قابليتها للتوسع للتطبيقات الصناعية9.

في السنوات الأخيرة ، تطورت تجزئة مجال تدفق المجال غير المتماثل (A4F) كتقنية فصل قوية لفصل الجسيمات الدقيقة والنانومتر القائمة على الحجموالطفو 10. يعتمد المبدأ التشغيلي ل A4F على قناة الموائع الدقيقة المزودة بغشاء مسامي في قاعدتها ، مما يولد قوة تمارس تجاه الغشاء تسمى التدفق المتقاطع10. عند دمجه مع الحركة البراونية وتدفق Poiseuille المتأصل في النظام ، يسهل التدفق المتقاطع فصل الجسيمات بكفاءة بسبب اختلاف موضع الجسيمات داخل ديناميكيات التدفق11. على الرغم من الفوائد ، تقتصر هذه الطريقة على أحجام العينات ضمن نطاق الميكرولتر12 وتتطلب خطوة تركيز إضافية ، مما يطيل مدة العملية10.

على مدى العقد الماضي ، اكتسبت الموائع الدقيقة مكانة بارزة كأداة لفصل EV السريع والفعال والموثوق بهسريريا 13. ومع ذلك ، فإن معظم طرق الموائع الدقيقة المصممة لفصل EV محسنة لعينات EV صغيرة الحجم وعالية التركيز أو تعتمد على إجراءات الفصل المعقدة14. علاوة على ذلك ، في مجال الموائع الدقيقة ، يتم التعرف على polydimethylsiloxane (PDMS) كمادة قياسية ذهبية نظرا لشفافيتها البصرية وتوافقها الحيوي وسهولة استخدامها15. ومع ذلك ، فإن ميله المعروف لامتصاص الجزيئات الصغيرة المحبة للدهون ، بما في ذلك EVs ، يمكن أن يكون مشكلة لتطبيقه في مجال EV13.

كوبوليمر الأوليفين الحلقي (COC) هو مادة تستخدم بشكل متكرر في علم الموائع الدقيقة بسبب التوافق الحيوي ، والامتصاص الصغير للجزيئات ، والمقاومة الكيميائية العالية15. ومع ذلك ، فإن تصنيع أجهزة COC غالبا ما ينطوي على عمليات معقدة أو معدات متخصصة16. بدلا من ذلك ، يعد ثيول القياس المتكافئ (OSTE) بديلا واعدا ل PDMS بسبب انخفاض امتصاص الجزيئات الصغيرة ، والاستقرار الكيميائي الفائق ، وسهولة التصنيع ، وعملية التصنيع القابلة للتطوير17,18. ومع ذلك ، نظرا للتوصيلات المعقدة بالأنابيب ، يمكن أن تكون الأجهزة عرضة للتسرب19.

كان الهدف من هذه الدراسة هو هندسة وتصنيع جهاز الموائع الدقيقة الذي يجمع بين OSTE و COC ومبدأ A4F المتشعب لفصل EV عن العينات كبيرة الحجم مثل البول أو وسائط الخلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جمع العينات من قبل لجنة أخلاقيات أبحاث الحياة والعلوم الطبية بجامعة لاتفيا (القرار N0-71-35 / 54)

ملاحظة: يتم تضمين المواد المستخدمة في هذه الدراسة في ملف جدول المواد .

1. تصنيع قوالب مطبوعة ثلاثية الأبعاد (3D)

  1. صمم قالبا سلبيا مزدوجا على شكل أفعواني في برنامج CAD بالأبعاد التالية للقناة العلوية: ارتفاع 0.5 مم وعرض 1 مم وطول 210 مم. بالنسبة للقناة السفلية ، استخدم نفس التصميم بعرض 1.5 مم وارتفاع 0.6 مم وطول 210 مم. يتم عرض أبعاد مثل عرض القالب والطول والارتفاع والتوضيح متساوي القياس للتصميم في الشكل 1. احفظ التصميم كملف .stl.
  2. قم بإعداد الملف في Z-Suite ؛ لا يلزم إضافة أي دعم. اطبع القوالب باستخدام طابعة 3D لشاشة الكريستال السائل فوق البنفسجية (UV LCD) مع راتنج أسود قوي.
  3. بعد الطباعة ، قم بإزالة القوالب بعناية من سطح الطابعة. اغسل القوالب في الأيزوبروبانول (IPA) في صوتنة لمدة 20 دقيقة.
  4. جفف القوالب بالمجفف باستخدام N2.
  5. قم بتعريض القوالب للتعرض للفيضانات باستخدام مرشح ND33 لمدة 810 ثانية ، ثم ضعها في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

2. إعداد قوالب PDMS

  1. وزن PDMS بنسبة 10: 1 وزن / وزن (لكل قالب ، استخدم 16 جم من قاعدة المطاط الصناعي و 1.6 جم من عامل الربط المتقاطع). امزج المكونات في خلاط طرد مركزي كوكبي ، واخلطها لمدة 1 دقيقة عند 500 دورة في الدقيقة.
  2. قم بصب PDMS المختلط في القوالب المطبوعة ثلاثية الأبعاد وديغا في مجفف فراغ عند -800 ملي بار لمدة 30 دقيقة أو حتى لا تلاحظ أي فقاعات.
  3. ضع بعناية بطانة كلوريد البولي فينيل بسمك 100 ميكرومتر فوق PDMS السائل.
    ملاحظة: ضع البطانة ببطء من جانب إلى آخر لتجنب تكوين الفقاعة.
  4. أدخل القالب باستخدام PDMS في رقصة القالب في المكان وشد الرقصة باستخدام مفتاح عزم الدوران مضبوطا على 0.3 نيوتن متر.
  5. ضع الرقصة في فرن 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات لعلاج PDMS.
  6. قم بتفكيك الرقصة باستخدام مفتاح سداسي عشري وقم بإزالة القالب المطبوع 3D من الرقصة.
  7. قم بإزالة قوالب PDMS بعناية من القوالب الرئيسية المطبوعة 3D ، والتي تدور حول حواف القالب بمشرط ، ثم تزيل القالب بملاقط.
    ملاحظة: لتسهيل إزالة العفن ، يمكن استخدام IPA ؛ ومع ذلك ، يجب تسخين القوالب عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بعد ذلك لتبخير IPA الزائد.

3. إعداد قناة OSTE-COC العليا

  1. وزن OSTE بنسبة 1.09: 1 وزن / وزن (ل 5 أجهزة ، يلزم 1.56 جم من الجزء A و 1.44 جم من الجزء B). امزج المكونات في خلاط طرد مركزي كوكبي: امزج لمدة 5 دقائق عند 750 دورة في الدقيقة ، ثم ديغا لمدة 5 دقائق عند 750 دورة في الدقيقة.
  2. نقل OSTE مختلطة إلى أنبوب الطرد المركزي وديغا في -800 ملي بار في مجفف فراغ لمدة 30 دقيقة.
  3. قم بتنظيف شرائح COC باستخدام موصلات 2 × 16 mini Luer عن طريق الصوتنة في IPA لمدة 10 دقائق. جفف الشرائح بعناية باستخدام N2.
  4. ضع شرائح COC النظيفة في أشر البلازما بحيث يتم وضع السطح المسطح لأعلى ، وعالج السطح ببلازما أكسجين 800 SCCM لمدة 2 دقيقة بقوة 700 واط مع ضغط 0.133 ملي بار.
  5. ضع شريحة COC المؤكسدة على قالب PDMS للقناة العلوية بحيث يكون السطح المعالج ملامسا للسطح المنظم ل PDMS. ضع التجميع في رقصة Mold-in-Place ، مع شد الرقصة بمفتاح عزم دوران مضبوط على 0.3 نيوتن متر.
  6. قم بتوصيل نظام الضغط بخط الهواء المضغوط عند 6 بار. خذ أنبوب الطرد المركزي مع OSTE المفرغة من الغاز وقم بتجميعه وفقا لتعليمات نظام الضغط باستخدام أنابيب polytetrafluorethylene (PTFE) بقطر داخلي 0.8 مم (ID).
  7. قم بتوصيل أنبوب PTFE بمدخل قالب PDMS ، وباستخدام ضغط 1000 ملي بار يتم الحفاظ عليه بواسطة مضخة كهرضغطية موجودة في نظام الضغط ، املأ الجهاز. ضع الرقصة مع الجانب الزجاجي لأعلى في مصفف القناع واعرضها بجرعة 850 مللي جول باستخدام مرشح ND33.
  8. بعد التعرض ، قم بتفكيك الرقصة باستخدام مفتاح سداسي عشري وقم بإزالة شريحة COC بعناية باستخدام طبقة OSTE المنظمة من قالب PDMS.
  9. اجعل OSTE المنظم ملامسا لغشاء 25 مم × 75 مم مع مسام 50 نانومتر وكثافة مسام 11.8٪ بحيث يتم تغطية القنوات بالكامل بالغشاء.
    ملاحظة: من المهم بشكل خاص الحفاظ على الغشاء مستقيما قدر الإمكان أثناء عملية التطبيق.
  10. ضع التجميع على صفيحة تسخين مضبوطة على 60 درجة مئوية مع وضع جانب الغشاء لأعلى ، ضع شريحة زجاجية نظيفة أعلى الغشاء ، وقم بتطبيق ضغط 1.6 كيلو باسكال من الأعلى لضمان الترابط المتساوي. تسخين التجمع بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: بعد هذه الخطوة ، من المهم بشكل خاص تقييم أداء الترابط وتشوه القناة.

4. إعداد القناة السفلية OSTE-COC وتجميع الجهاز

  1. امزج OSTE بنسبة 1.09: 1 وزن / وزن (ل 5 أجهزة ، يلزم 1.56 جم من الجزء A و 1.44 جم من الجزء B). امزج المكونات في خلاط طرد مركزي كوكبي: امزج لمدة 5 دقائق عند 750 دورة في الدقيقة ، ثم ديغا لمدة 5 دقائق عند 750 دورة في الدقيقة.
  2. انقل OSTE المختلط إلى أنبوب الصقر وديغا عند -800 ملي بار في مجفف فراغ لمدة 30 دقيقة.
  3. تنظيف شرائح COC عن طريق صوتنة في IPA لمدة 10 دقائق. جفف الشرائح بعناية باستخدام N2.
  4. ضع شرائح COC النظيفة في آشر البلازما وعالج السطح ببلازما أكسجين 800 SCCM لمدة 2 دقيقة بقوة 700 واط مع ضغط 0.133 ملي بار.
  5. ضع شريحة COC المؤكسدة على قالب PDMS للقناة السفلية بحيث يكون السطح المعالج ملامسا للسطح المنظم ل PDMS. ضع التجميع في رقصة Mold-in-Place ، مع شد الرقصة بمفتاح عزم دوران مضبوط على 0.3 نيوتن متر.
  6. خذ أنبوب الصقر مع OSTE المفرغ وتجميعه وفقا لتعليمات نظام الضغط باستخدام أنابيب PTFE بمعرف 0.8 مم.
  7. قم بتوصيل أنبوب PTFE بمدخل قالب PDMS وباستخدام ضغط 1000 ملي بار ، املأ الجهاز. ضع الرقصة مع الجانب الزجاجي لأعلى في محاذاة القناع واعرضها بجرعة 1100 مللي جول باستخدام مرشح ND33.
  8. بعد التعرض ، قم بتفكيك الرقصة باستخدام مفتاح سداسي عشري وقم بإزالة شريحة COC بعناية باستخدام طبقة OSTE المنظمة من قالب PDMS.
  9. اجمع طبقة OSTE المنظمة مع مجموعة القناة العلوية بحيث يتم محاذاة تصميم الطبقة العلوية والسفلية مع بعضها البعض وأن الطبقة السفلية OSTE على اتصال بالغشاء.
  10. أدخل التصميم في رقصة Mold-in-Place ، وباستخدام مشابك البلدغ ، قم بتطبيق ضغط 1.6 كيلو باسكال على الجهاز بالتساوي. ضع الرقصة في فرن على حرارة 60 درجة مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي الوضع غير المتكافئ للمشابك إلى ترابط غير متساو.

5. تقييم الجهاز

  1. بعد الترابط ، قم بتقييم الأجهزة بصريا باستخدام المجهر بحثا عن العيوب البصرية ، على سبيل المثال ، تشوه القناة أو الترابط غير الناجح.
  2. اختبر الأجهزة بدون عيوب عن طريق تمرير 0.02 ميكرومتر من الماء منزوع الأيونات المصفى عبر القنوات بضغط 30 ملي بار. مراقبة تسرب قناة التدفق ومنفذ Luer وتدفق المياه.
    ملاحظة: إذا لم يتم اكتشاف أي تسرب ولم ينقطع تدفق القناة ، تعتبر الأجهزة قابلة للاستخدام لإجراء مزيد من التجارب.

6. إعداد الجهاز

  1. املأ حقنتين سعة 5 مل ب 2 مل من 20 نانومتر مصفاة 3٪ H2O2 وقم بتركيبها على مضخة حقنة (استخدم أسهم الحركة للمسافة المطلوبة ، وأدخل المحاقن ، وقم بتثبيتها في مكانها باستخدام الشريط العلوي).
    أنذر! كن حذرا دائما عند التعامل مع H2O2. ارتد معطف المختبر والقفازات المطاطية الواقية وحماية العين.
  2. قم بتوصيل أنابيب PTFE بطول 14 سم 800 ميكرومتر بالمحاقن باستخدام إبر المحاقن ومداخل الجهاز باستخدام موصلات Luer.
  3. قم بتوصيل أنابيب كيتون البولي إيثر (PEEK) بطول 20 سم بطول 20 سم بالمخرجات.
  4. قم بتوصيل الطرف الآخر من أنبوب PEEK بحاوية نفايات. يمكن رؤية الإعداد في الشكل 3.
  5. ابدأ تشغيل مضخة المحقنة بسرعة تدفق تبلغ 500 ميكرولتر / دقيقة لكل مدخل (على شاشة الجهاز: الإعدادات > ضبط النظام > حقنة (الشركة المصنعة: حقنة طبية ، حقنة: 5 مل) > زر الرجوع > المعلمات (حدد: التسريب ، التكرار: 1 ، الحجم: 1.5 مل ، التدفق: 500 ميكرولتر / دقيقة) > زر الرجوع > زر الرجوع ). اجمع التدفق في حاوية نفايات.
  6. املأ حقنتين جديدتين سعة 5 مل ب 2 مل من الإيثانول المصفى بنسبة 70٪ 20 نانومتر.
  7. استبدل المحاقن السابقة بالمحاقن المملوءة بالإيثانول وابدأ تشغيل مضخة المحقنة باستخدام نفس المعلمات الموضحة في الخطوة 6.5.
  8. استخدم محاقن جديدة سعة 5 مل واملأها ب 5 مل من محلول ملحي مفلتر بالفوسفات 20 نانومتر (PBS).
  9. استبدل المحاقن السابقة بالمحاقن المملوءة ب PBS واغسل الجهاز ب 4 مل من PBS بتكرار الخطوات 6.1. و 6.5.
    ملاحظة: تأكد من تغيير معلمات إعداد النظام إلى الصوت: 4 مل (على شاشة الجهاز: الإعدادات > المعلمات > (تحديد: الصوت: 4 مل).
  10. افصل الأنبوب من الجهاز وأغلق كل مدخل ومخرج باستخدام مقابس Luer.
    ملاحظة: اترك برنامج PBS في الجهاز وتجنب حبس أي هواء عن طريق إضافة PBS إضافي على كل مدخل ومخرج باستخدام ماصة دقيقة قبل الإغلاق.
  11. اترك الجهاز طوال الليل في مكان مظلم في درجة حرارة الغرفة (RT).
  12. في اليوم التالي ، اغسل الجهاز المملوء ب PBS ب 4 مل من 20 نانومتر PBS المصفى (كما هو موضح في الخطوة 6.8).
  13. اجمع آخر 1 مل من التدفق من كلا المخرجين في أنبوب منخفض الارتباط بالبروتين سعة 2 مل وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية كفراغ للجزيئات التي يدخلها الجهاز.
  14. قم بإزالة المحاقن المملوءة ب PBS واستبدلها بمحاقن جديدة سعة 5 مل مملوءة بالهواء.
  15. قم بتطهير الجهاز ب 4 مل من الهواء حتى يخرج كل السائل من الجهاز والأنبوب.

7. اختبار الجهاز مع حبات اللاتكس موحدة

  1. تحضير عينة حبة موحدة باستخدام 1.0 ميكرومتر من البوليسترين و 0.1 ميكرومتر من حبات الكربوكسيلات. إلى أنبوب 15 مل ، أضف 500 ميكرولتر من معايير حبة البوليسترين 1.0 ميكرومتر ، و 1 ميكرولتر من معايير حبة الكربوكسيلات 0.1 ميكرومتر ، و 9499 ميكرولتر من 20 نانومتر من PBS المصفى (التركيز النهائي لمزيج حبة 1.0 و 0.1 ميكرومتر سيكون 5 × 108 حبة / مل و 3.6 × 1010 حبة / مل باحترام).
  2. دوامة عينة حبة لمدة 30 ثانية وتخزينها في +4 درجة مئوية في حين لا تستخدم.
  3. املأ حقنة جديدة سعة 5 مل ب 1.5 مل من خليط الخرزة القياسي وأخرى ب 1.5 مل من 20 نانومتر من PBS المصفى.
  4. قم بإزالة المحاقن المرفقة مسبقا وأرفق حقنة خليط الخرزة بأنبوب المدخل الأول والآخر بالمدخل الثاني.
  5. قم بإزالة حاوية النفايات وقم بإعداد ما لا يقل عن خمسة أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 0.5 مل لكل أنبوب مخرج.
  6. قم بتغيير معلمات بدء تشغيل نظام مضخة الحقن إلى الحجم: 1 مل ؛ التدفق: 250 ميكرولتر / دقيقة.
    ملاحظة: اعتمادا على احتياجات المستخدم ، يمكن ضبط سرعات تدفق مختلفة مثل 250 ميكرولتر / دقيقة ، 200 ميكرولتر / دقيقة ، 150 ميكرولتر / دقيقة ، 100 ميكرولتر / دقيقة ، و 50 ميكرولتر / دقيقة. يوصى بإجراء دراسة أولية لاختيار السرعة الأكثر ملاءمة للنتيجة المطلوبة.
  7. ابدأ تشغيل مضخة المحقنة واجمع التدفق الخارجي - من 5 إلى 6 قطرات في كل أنبوب طرد مركزي دقيق.
    ملاحظة: إذا تم استخدام نفس الجهاز عدة مرات، فقم بشطف الجهاز كما هو موضح في الخطوة 6.8 وقم بتغيير جميع الموصلات والمقابس والإبر. اغسل الموصلات والمقابس والإبر المستخدمة عن طريق تركها في إيثانول 20 نانومتر مفلتر بنسبة 70٪ لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد ذلك ، انقل جميع الأجزاء إلى أنبوب يحتوي على 20 نانومتر من الماء مفلتر منزوع الأيونات ، وهز الأنبوب جيدا ، وانقلها إلى طبق بتري يحتوي على 20 مل من 20 نانومتر من الماء منزوع الأيونات المصفى. اترك طبق بتري على الخلاط لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 100 دورة في الدقيقة ، ثم اترك الأشياء لتجف في طبق بتري جاف (لمدة 12 ساعة على الأقل) قبل إعادة الاستخدام.

8. اختبار الجهاز مع عينات البول

  1. قم بإعداد الجهاز كما هو موضح في الخطوات من 6.1 إلى 6.15.
  2. جمع 100 مل من بول الصباح لكل متبرع باستخدام حاويات معقمة البول وتسليمها إلى المختبر للمعالجة في غضون 2 ساعة من جمعها.
  3. افصل كل عينة بول إلى أنبوبين سعة 50 مل وأجهزة طرد مركزي عند 2'000 × جم لمدة 15 دقيقة في RT.
  4. جمع طاف وتجاهل بيليه.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 10'000 × ز لمدة 30 دقيقة في RT للتخلص من الجسيمات الكبيرة وحطام الخلايا.
  6. جمع طاف وتجاهل بيليه.
  7. اغسل الجهاز كما هو موضح في 6.6.
  8. قم بتغيير المحاقن سعة 5 مل إلى حقنة سعة 20 مل مملوءة بعينة البول المحضرة لمدخل العينة ومحقنة أخرى سعة 20 مل مملوءة ب 20 مل من 20 نانومتر من DEPC-PBS المصفى لمدخل المخزن المؤقت. تغيير إعدادات مضخة حقنة إلى BDPlastipak; حقنة: سم مكعب ؛ الحجم: 20 مل ؛ التدفق: 250 ميكرولتر / دقيقة (معدل التدفق الأمثل) ، بالمثل كما هو موضح في الخطوة 6.2. ابدأ تشغيل مضخة المحقنة واجمع التدفق من كل منفذ في أنابيب منفصلة سعة 50 مل.
  9. ركز كل تدفق على حدة باستخدام 100000 أنبوب تركيز قطع الوزن الجزيئي إلى 100 ميكرولتر لكل منها عند 3000 × جم في 4 درجات مئوية.
  10. نقل المركزات إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 0.5 مل.
  11. دوامة العينات المركزة لمدة 30 ثانية ، ثم تدور لمدة 10 ثوان.
  12. قم بقسمة العينات عن طريق نقل 25 ميكرولتر من العينة لكل أنبوب ، وقم بتسميتها ، وتجميدها عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.

9. اختبار الجهاز باستخدام وسائط مكيفة

  1. قم بإعداد الجهاز كما هو موضح في الخطوات 6.1 - 6.15.
  2. خلايا المزرعة في بيئة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية حتى يصل العدد الإجمالي إلى 100 مليون وفقا ل Bajo-Santos et al.20 قم بتمرير الخلايا إلى دورق تعليق T175 واحد في 100 مل من الوسائط الخالية من المصل مع مكمل بديل مصل B-27 بنسبة 2٪ وثقافة في بيئة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة إضافية.
  3. جمع تعليق الخلية وأجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في RT للتخلص من الخلايا.
  4. جمع وطرد مركزي الطافع مرة أخرى عند 3000 × جم لمدة 30 دقيقة عند +4 درجة مئوية للتخلص من الجسيمات الكبيرة وحطام الخلايا.
  5. اجمع المادة الطافية واحفظها في درجة حرارة +4 درجة مئوية حتى يمكن أن يحدث الفصل ، ولكن ليس أكثر من 3 ساعات.
  6. قم بتغيير المحاقن سعة 5 مل مع محاقن سعة 20 مل مملوءة بالوسائط المكيفة المعدة لمدخل العينة ومليئة ب 20 مل من 20 نانومتر من PBS المصفى لمدخل المخزن المؤقت.
  7. اضبط الإعدادات في محطة الضخ كما هو موضح في الخطوة 7.8.
  8. ابدأ تشغيل مضخة المحقنة واجمع التدفق من كل منفذ في أنبوب منفصل سعة 50 مل.
  9. ركز كل تدفق على حدة باستخدام 100000 أنبوب تركيز قطع الوزن الجزيئي إلى 150 ميكرولتر لكل منها عند 3000 × جم عند +4 درجة مئوية.
  10. نقل المركزات إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 0.5 مل.
  11. عينات مركزة دوامة لمدة 30 ثانية.
  12. تدور عينات مركزة لمدة 10 ثوان.
  13. قم بتقسيم العينات عن طريق نقل 25 ميكرولتر من العينة لكل أنبوب ، وقم بتسميتها ، وتجميدها عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.

10. عزل المركبات الكهربائية باستخدام الطرد المركزي الفائق

  1. جهاز طرد مركزي 20 مل من البول أو وسائط الخلايا المكيفة عند 100000 × جم لمدة 70 دقيقة عند +4 درجة مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي بدوار ثابت الزاوية.
  2. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 20 مل من 20 نانومتر من PBS المصفى.
  3. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى ، كما هو موضح في 10.1.
  4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 12 مل من 20 نانومتر من PBS المصفى.
  5. جهاز طرد مركزي عند 100000 × جم لمدة 70 دقيقة عند +4 درجة مئوية باستخدام دوار متأرجح.
  6. تخلص من المادة الطافية.
    ملاحظة: كن حذرا عند التخلص من المادة الطافية هذه المرة. من المستحسن أن تفعل ذلك مع ماصة.
  7. أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من 20 نانومتر PBS المصفى.
  8. قسمة العينة وانتقل إلى setion 12 لتوصيف EV. خلاف ذلك ، يخزن في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.

11. عزل المركبات الكهربائية باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC)

  1. ركز 20 مل من البول أو وسائط الخلايا المكيفة إلى 500 ميكرولتر باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي ذات الوزن الجزيئي 100 كيلو دالتون (MWCO) عند 3000 × جم عند +4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  2. انقل التركيز إلى عمود SEC (نطاق تحميل 35 نانومتر).
  3. صب 20 نانومتر PBS المصفى على العمود وجمع 15 كسرا من 0.5 مل.
  4. قم بتحليل الكسور باستخدام نظام تشتت الضوء الديناميكي (DLS) باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  5. اجمع الكسور المحددة معا. اختر الكسور ذات المخفف أقل من 11 و 30٪ على الأقل من إجمالي الجسيمات أكبر من 40 نانومتر.
  6. تركيز الكسور المختارة إلى 100 ميكرولتر باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي لقطع الوزن الجزيئي 3 كيلو دالتون (MWCO) عند 14000 × جم عند +4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  7. قسمة العينة وانتقل إلى القسم 12 لتوصيف EV. خلاف ذلك ، يخزن في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.

12. توصيف EV

  1. خذ العينة المراد تمييزها من الفريزر وقم بإذابة الثلج ببطء (على كتلة ثلج أو عند +4 درجة مئوية).
  2. إجراء تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) لتحديد توزيع حجم الجسيمات والكمية13. إجراء فحص الممتز المناعي المرتبط بإنزيم الساندويتش المزدوج المرتبط بالإنزيم (dsELISA) عالي التقارب لبروتين غشاء الخلايا التائية 4 (TIM-4) 14 لتأكيد وجود EV في العينات.

13. NTA

  1. دوامة عينة EV المذابة لمدة 30 ثانية وتدور لمدة 10 ثوان ، ثم نقل 1 ميكرولتر إلى 999 ميكرولتر من 20 نانومتر PBS المصفى في أنبوب طرد مركزي دقيق 2 مل لتخفيفه 1000 ضعف. وفر 1 مل من PBS الإضافي المستخدم للتخفيف للتحقق من عدم احتوائه على جزيئات. قم بتخزين كل شيء في +4 درجة مئوية حتى القياس.
    ملاحظة: قم بتصفية PBS من خلال مرشح 0.02 نانومتر قبل الاستخدام.
  2. دوامة عينة EV أو فارغة لمدة 30 ثانية وأدخلها في الوحدة باستخدام حقنة. املأ الوحدة بحوالي 0.7 مل من العينة وضعها في الجهاز.
  3. قم بقياس العينة باستخدام أداة محلل الجسيمات النانوية باتباع تعليمات الشركة المصنعة.

14. dsELISA لعلامات EV

  1. تحضير محلول من 1 ميكروغرام / مل بروتين TIM4-Fc. قم بتغطية آبار صفيحة ELISA المكونة من 96 بئرا عن طريق نقل 100 ميكرولتر من المحلول إلى كل بئر ضروري واحتضانها طوال الليل عند +4 درجة مئوية تهتز عند 200 دورة في الدقيقة.
  2. في اليوم التالي ، قم بإعداد محلول الغسيل (1x TBS + 0.05٪ Tween20 + 2 mM CaCl2).
  3. تخلص من كل السائل في كل بئر. اغسل كل بئر بإضافة 200 ميكرولتر من محلول الغسيل ، والرج عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في RT ، والتخلص منه. كرر هذه الخطوة مرتين.
  4. تحضير محلول الحجب (1x TBS + 0.05٪ Tween20 + 1٪ ألبومين مصل البقري. أضف 200 ميكرولتر من محلول الحجب إلى كل بئر واحتضانها في RT لمدة 1 ساعة أثناء الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
  5. اغسل كل بئر كما هو موضح في الخطوة 14.3.
  6. تحضير 220 ميكرولتر من كل تخفيف عينة في المخزن المؤقت للغسيل (تركيز EV الأمثل هو 2.7 × 105 EVs / μL). أضف 100 ميكرولتر من العينة المخففة لكل بئر وقم بإجراء نسختين متماثلتين. احتضان في RT لمدة 90 دقيقة بينما تهتز عند 200 دورة في الدقيقة.
  7. اغسل كل بئر كما هو موضح في الخطوة 14.3.
  8. أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المقابلة لكل بئر. استخدم علامات EV المناسبة لتأكيد المركبات الكهربائية والملوثات4. احتضان في RT لمدة 2 ساعة بينما تهتز عند 200 دورة في الدقيقة. ملاحظة: إذا تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية، كرر الخطوات 14.7-14.8. ومع ذلك ، تقليل فترة حضانة الأجسام المضادة الثانوية إلى 1 ساعة.
  9. اغسل كل بئر كما هو موضح في الخطوة 14.3.
  10. أضف 100 ميكرولتر من ركيزة بيروكسيديز الفجل إلى كل بئر ، واخلطي اللوحة لمدة 1 دقيقة ، واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة.
  11. أضف 1 M H2SO4 إلى كل بئر لإيقاف التفاعل.
  12. باستخدام قارئ microplate ، قم بقياس الامتصاص عند 450 نانومتر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

قمنا بتصنيع جهاز الموائع الدقيقة باستخدام قالب سلبي مزدوج مطبوع ثلاثي الأبعاد (الشكل 1) عبر الطباعة الحجرية الناعمة (الشكل 2 أ) لفصل EV عالي الإنتاجية بناء على مبدأ A4F المتشعب (الشكل 2B ، C). يتطلب الإعداد مضخة ومحطة تدفق ، كما يتضح من

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يوفر جهاز الموائع الدقيقة المقدم طريقة واعدة لعزل واستخراج المركبات الكهربائية من السوائل البيولوجية ، ومعالجة بعض القيود الحرجة لطرق المعيار الذهبي الحالية مثل UC و SEC12. من المعروف أن UC و SEC كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا وتعاني من انخفاض العائد ، مما يجعلها أقل ملاءمة للتط...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

A.A. ، G.M. ، و R.R. هم مؤسسون وأعضاء مجلس إدارة وأصحاب أسهم في Cellbox Labs، LLC

Acknowledgements

نشكر جميع المانحين الذين شاركوا في هذه الدراسة ، وموظفي قاعدة بيانات الجينوم اللاتفية على تقديم العينات. تلقى معهد فيزياء الحالة الصلبة ، جامعة لاتفيا كمركز للتميز ، تمويلا من برنامج إطار عمل Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 بموجب اتفاقية المنحة رقم 739508 ، المشروع CAMART2. تم دعم هذا العمل من قبل مشروع المجلس اللاتفي للعلوم رقم. lzp-2019 / 1-0142 ورقم المشروع: lzp-2022 / 1-0373.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 µm carboxylate FluoSpheresInvitrogen#F8803Stock concentration: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT dependent)
0.5 mL microcentrifuge tubesStarstedt72.704
1 mL Luer cone syringe single use without needleRAYSTUB1ML
1.0 µm polystyrene FluoSpheresInvitrogen#F13083Stock concentration: 1 x 1010 beads/mL (LOT dependent)
10 mL Serological pipettesSarstedt86.1254.001
15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filtersMerck MilliporeUFC910024
2.0 mL Protein LoBind tubesEppendorf30108132
20 mL syringesBD PlastikPak10569215
250 µm ID polyether ether ketone tubingDarwin MicrofluidicsCIL-1581
3 kDa MWCO centrifugal filter unitsMerck Millipore,UFC200324
5 mL Medical Syringe without NeedleAnhui Hongyu Wuzhou Medical159646
50 mL conical tubesSarstedt62.547.254
70 Ti fixed angle ultracentrifuge rotorBeckman Coulter337922
800 µm ID polytetrafluoroethylene tubingDarwin MicrofluidicsLVF-KTU-15
96 well microplate, f-bottom, med. bindingGreiner Bio-One655001ELISA plate
B-27 Supplement (50x), serum freeThermo Fisher Scientific17504044
Bovine serum albuminSigmaAldrichA7906-100G
COC Topas microscopy slide platformMicrofluidic Chipshop10000002
COC Topas microscopy slide platform 2 x 16 Mini Luer Microfluidic Chipshop10000387
Elveflow OB1 pressure controllerElvesys Group
Luer connectorsDarwin Microfluidics CS-10000095
Mask aligner Suss MA/BA6SUSS MicroTec Group
Mixer Thinky ARE-250Thinky Corporation
NanoSight NS300Malvern PanalyticalNS300nanoparticle analyzer 
Optical microscope Nikon Eclipse LV150NNikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal ClearMercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg free. Fisher Bioreagents. 100 gFisher ScientificBP2944-100
PC membrane (50 nm pore diameter, 11.8% density)it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium
Petri dishes, sterileSarstedt82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 MPVA TePla America, LLC
qEVoriginal/35 nm columnIzonSP5SEC column
QSIL 216 Silicone Elastomer KitPP&S
Resin Tough BlackZortrax
SW40 Ti swing ultracentrifuge rotorBeckman Coulter331301
Syringe pumpDK InfusetekISPLab002
T175 suspension flaskSarstedt83.3912.502
TIM4-Fc proteinAdipogen LifeSciencesAG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)SigmaAldrichT0440-100MLHorseradish peroxidase substrate
Tween20SigmaAldrichP1379-100ML
Ultracentrifuge Optima L100XPBeckman Coulter
Ultrasonic cleaning unit P 60 HElma Schmidbauer GmbH
Universal Microplate SpectrophotometerBio-Tek instruments71777-1
Urine collection cup, 150mL, sterileAPTACA2120_SG
Whatman Anotop 25 Syringe FilterSigmaAldrich68092002
Zetasizer Nano ZSMalvern Panalyticaldynamic light scattering (DLS) system 
Zortrax InkspireZortrax

References

  1. Colombo, M., et al. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  2. Tricarico, C., et al. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
  3. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066(2015).
  4. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  5. Wang, Z. Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances. Biomed Pharmacother. 153, 113480(2022).
  6. Royo, F., et al. Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee. Cells. 9 (9), 1955(2020).
  7. Sidhom, K., et al. A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option. Int J Mol Sci. 21 (18), 6466(2020).
  8. Reshi, Q. U. A., et al. Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns. Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).
  9. Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. J Chromatogr A. 1636, 461773(2021).
  10. Priedols, M., et al. Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation. Polymers. 15 (4), 789(2023).
  11. Zhang, H., Lyden, D. Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization. Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).
  12. Talebjedi, B., et al. Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment. Front Vet Sci. 7, 620809(2020).
  13. van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).
  14. Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
  15. Bussooa, A., et al. Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices. Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198(2022).
  16. Tang, L., Lee, N. Y. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).
  17. Borda, E., et al. Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets. Biomaterials. 293, 121979(2023).
  18. Sandström, N., et al. Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002(2015).
  19. Sticker, D., et al. Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).
  20. Bajo-Santos, C., et al. Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device. Int J Mol Sci. 24 (9), 7971(2023).
  21. Claridge, B., et al. Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities. Front Cell Dev Biol. 9, 734720(2021).
  22. Rezaie, J., et al. Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges. Cell Commun Signal. 20 (1), 145(2022).
  23. Aragón, I. M., et al. The urinary tract microbiome in health and disease. Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved